利用根癌農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化大豆的研究

利用根癌農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化大豆的研究

大豆是重要的糧食、肥料和飼料。它是植物蛋白的主要來源，在國內(nèi)外市場中發(fā)揮著非常重要的作用。轉(zhuǎn)基因大豆的研究也因此受到普遍重視。農(nóng)桿菌作為一種自然的植物基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng),具有操作方便、費用低廉、可插人外源基因片段大、不易發(fā)生重排、拷貝數(shù)低且符合孟德爾遺傳規(guī)律等優(yōu)點,因而備受科研工作者的重視。農(nóng)桿菌成功轉(zhuǎn)化大豆的首例報道是由Hinchee等在1988年所作的,之后的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化大豆方面的報道大多以Hinchee的工作為基礎(chǔ)。Meurer等報道了農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化大豆子葉節(jié)的影響因素,發(fā)現(xiàn)用超聲處理過的子葉節(jié)較對照容易轉(zhuǎn)化,而且農(nóng)桿菌菌株KYRT1的轉(zhuǎn)化效果最佳。最近也相繼有報道KYRT1在介導(dǎo)大豆轉(zhuǎn)化方面可以明顯提高轉(zhuǎn)化效率。Olhoft等相繼報道了在培養(yǎng)基中添加硫醇類化合物和L-半胱氨酸可以防止由農(nóng)桿菌侵染而導(dǎo)致的組織壞死現(xiàn)象,從而提高轉(zhuǎn)化頻率,同時采用潮霉素作為篩選劑應(yīng)用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆的遺傳轉(zhuǎn)化,也獲得了很好的效果。我們實驗室以卡那霉素為篩選劑,采用EHA105建立的胚尖轉(zhuǎn)化體系也獲得了較高的轉(zhuǎn)化頻率。Paz等最近建立了一種“半種(half-seed)”系統(tǒng)使得大豆的轉(zhuǎn)化簡單化,而且轉(zhuǎn)化效率有了明顯的提高。從以上的報告可以看出目前農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法采用的受體系統(tǒng)多數(shù)為子葉節(jié)。本研究采用大豆成熟種子胚尖作為轉(zhuǎn)基因受體,采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法獲得了轉(zhuǎn)基因植株,并對一些影響大豆轉(zhuǎn)化效率的因素進(jìn)行了探討。在建立優(yōu)化的轉(zhuǎn)化體系基礎(chǔ)上,用含有cryIA(c)和pta(Pinelliatenataagglutinin)基因的雙價抗蟲基因?qū)Υ蠖惯M(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。1材料和方法1.1大豆種子的處理大豆[Glycinemax(L.)Merr]成熟種子品種有合豐35,合豐39,合豐25,東農(nóng)42,樂豐39,黑農(nóng)37和黑農(nóng)40。取表面光滑無病斑的大豆成熟種子,放入含有由30%NaClO+20%鹽酸反應(yīng)生成的氯氣的密閉容器中,6-8h后取出放至無菌水中28℃浸泡24h。去掉種皮,將下胚軸連同剛萌動的胚尖與兩片子葉剝離,去掉原葉。1.2ambi-3300本研究中用到的農(nóng)桿菌菌株為琥珀堿型的KYRT1,章魚堿型的LBA4404和農(nóng)桿堿型的E-HA105。其中KYRT1菌株由美國肯塔基大學(xué)的Collins教授提供,雙價抗蟲載體質(zhì)粒pCAMBIA3300由上海交通大學(xué)武天龍教授惠贈。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化過程中采用的雙元載體質(zhì)粒為pCAMBIA3301,該質(zhì)粒帶有CaMV35S啟動的β-葡萄糖苷酶(gus)基因(帶內(nèi)含子)和CaMV35S啟動的除草劑抗性(bar)基因。另一個雙價抗蟲載體質(zhì)粒為pCAMBI-A3300,該質(zhì)粒帶有CaMV35S啟動的除草劑抗性(bar)基因,CaMV35S啟動的半夏凝集素(pta)基因和Ubiquitin啟動的cryIA(c)基因(圖1)。參考Hofgen和Willmitzel的凍融法直接將質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌株中。1.3乙酰丁香酮a挑取農(nóng)桿菌單菌落接種于含卡那霉素100mg/L或者利福平100mg/L的5mlYEP液體培養(yǎng)基中,28℃搖床培養(yǎng)過夜,然后將菌液轉(zhuǎn)至50ml新鮮的上述YEP液體培養(yǎng)基中搖至A600=1.4-1.6,菌體于4000rpm離心10min后重懸于感染液中[1/2MSB5(1/2MS基本培養(yǎng)基的無機(jī)鹽濃度,附加B5培養(yǎng)基的有機(jī)元素),30g/L蔗糖,10g/L葡萄糖,6.0mg/LBA,0.5g/LMES,200μmol/L乙酰丁香酮,A600調(diào)整至0.5]。胚尖在預(yù)培養(yǎng)基(MSB5+3.5mg/LBA+0.6%瓊脂)上光照培養(yǎng)24h后,在上述農(nóng)桿菌感染液中28℃振蕩培養(yǎng)20h,然后轉(zhuǎn)至共培養(yǎng)基上(培養(yǎng)基成分同感染液,附加0.6%瓊脂)暗培養(yǎng)5天,用無菌水洗凈胚尖后轉(zhuǎn)至恢復(fù)培養(yǎng)基上(1/2MSB5+0.2mg/LBA+0.2mg/LIBA+300mg/L頭孢霉素),光照培養(yǎng)5-7天?；謴?fù)培養(yǎng)后的胚尖先后轉(zhuǎn)至含有0.5、0.75和1.0mg/LPPT的篩選培養(yǎng)基上(1/2MSB5+0.2mg/LBA+0.2mg/LIBA+300mg/L頭孢霉素),每輪培養(yǎng)3-4周,每10天繼代一次。當(dāng)抗性芽長至3cm左右時將其切下轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基(1/2MSB5+1.0mg/LIBA+250mg/L頭孢霉素+0.25mg/LPPT),根長到足夠健壯時敞開瓶口練苗2-3天,然后移入培養(yǎng)土中。幼苗長出兩片新葉后,再移栽到溫室中生長結(jié)實。1.4tri能力測定法按照J(rèn)efferson的方法,取共培養(yǎng)5d的胚尖,在篩選培養(yǎng)基上生長抗性胚尖,分別浸入到X-G1uc溶液(含1mmol/LX-Gluc,10mmol/LNa2EDTA,100mmol/LpH7.0的磷酸緩沖液,0.5mmol/L亞鐵氰化鉀,0.5mmol/L高鐵氰化鉀,0.1%(v/v)TritonX-100)中,37℃保溫過夜。洗滌后轉(zhuǎn)入75%和95%乙醇中脫色,觀察染色情況。1.5pcr擴(kuò)增碳質(zhì)細(xì)胞系統(tǒng)cdk基因,克隆抗體patki取人工氣候室中的抗性植株葉片,采用CTAB法提取總DNA用于檢測。PCR擴(kuò)增bar基因的引物為:P1:5′-GCACCATCGTCAACCACTAC-3′,P2:5′-TGAAGTCCAGCTGCCAGAAAC-3′;擴(kuò)增pta基因的引物為:PXF:5′-ATGGCCTCCAAGCTCCTCCT-3′,PXR:5′-GCTTATTAATTCACCTTCTC-3′;擴(kuò)增cryIA(c)基因的引物為:BTF:5′-ATGGACAA-CAACCCAAACATC-3′,BTR:5′-TAGAATCAGGAC-CCCAGACAC-3′。每個反應(yīng)體積為50μL,其中含上下游引物各0.4!mol/L,4種dNTP各100!mol/L,10×buffer5μL,TaqDNA聚合酶2U,模板50ng,礦物油50μL。PCR反應(yīng)參數(shù):94℃預(yù)變性5min;然后94℃變性1min,58℃退火1min,72℃延伸1min,共35個循環(huán);最后72℃延伸10min。5-10μLPCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離,觀察拍照。1.6pcr擴(kuò)增聚合酶pa取20-30!gCTAB法提取的高質(zhì)量總DNA經(jīng)HindⅢ或者SmaI完全消化后,在0.8%瓊脂糖凝膠電泳上分離。參照Sambrook等的方法將DNA轉(zhuǎn)至帶正電荷的尼龍膜上。探針為以pCAMBIA3300為模板經(jīng)PCR擴(kuò)增的cryIA(c)基因片段(680bp)和pta基因片段(804bp)。采用隨機(jī)引物法(Takara試劑盒)用[α-32P]dCTP進(jìn)行標(biāo)記。預(yù)雜交、雜交和洗膜依次按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行(TOYOBO雜交試劑)。雜交膜壓X-光片,在-70℃放射自顯影3天。2結(jié)果2.1外植體的存活率本實驗中所使用的篩選標(biāo)記基因是除草劑抗性基因bar,篩選劑為PPT。在轉(zhuǎn)化之前,首先對各種不同的外植體的PPT篩選濃度進(jìn)行確定。把經(jīng)過24h預(yù)培養(yǎng)的胚尖和由胚尖分化的芽苗接種在含有不同濃度的PPT的芽分化培養(yǎng)基上。選擇三種基因型進(jìn)行測定,四周后統(tǒng)計外植體存活的數(shù)目,計算存活率,結(jié)果表明在含有PPT的培養(yǎng)基上,各外植體的生長明顯受到了抑制,并逐漸褐化死亡。相對而言芽苗較為敏感,在PPT濃度為0.75mg/L時,它的存活率僅為2%左右。在PPT濃度為1.0mg/L時幾乎所有的胚尖都死亡,而在濃度為0.5mg/L時雖然存活率為8%左右,但是存活的胚尖基本上都不能正常的產(chǎn)生芽苗。有研究表明在大豆子葉節(jié)系統(tǒng)中不同的大豆品種對選擇劑的敏感性存在著一定差異,但是本試驗結(jié)果顯示基因型間同種外植體對PPT的敏感性沒有顯著差異。而且我們所采用的胚尖系統(tǒng)對PPT的敏感性較強(qiáng),這將有利于提高轉(zhuǎn)化效率以及非嵌合轉(zhuǎn)化體的高效再生。在轉(zhuǎn)化篩選過程中以這個PPT濃度(胚尖為0.75mg/L,芽苗為0.5mg/L)為基礎(chǔ)進(jìn)行選擇。2.2eha105的gus表達(dá)大量研究表明,農(nóng)桿菌對不同植物的侵染能力存在著很大差異,不同植物對農(nóng)桿菌侵染的敏感性也明顯不同。因此,在遺傳轉(zhuǎn)化研究中兩者的匹配選擇十分重要,即選擇農(nóng)桿菌與植物之間有著高侵染力的配合直接影響著轉(zhuǎn)化效率。本研究中,分別屬于3種不同染色體背景的農(nóng)桿菌菌株KYRT1,LBA4404,EHA105被用于轉(zhuǎn)化試驗。將攜帶有同一質(zhì)粒pCAMBIA3301的三個農(nóng)桿菌對三種優(yōu)良大豆品系的胚尖進(jìn)行轉(zhuǎn)化,共培養(yǎng)5天后進(jìn)行GUS染色,計算瞬時表達(dá)率。從GUS瞬時表達(dá)結(jié)果(表1,圖版Ⅰ,圖A)來看:三種菌株對大豆胚尖均具有較強(qiáng)的侵染能力。但是相較而言KYRT1是LBA4404的轉(zhuǎn)化效率的1.6倍左右,同時由于應(yīng)用LBA4404為轉(zhuǎn)化載體時較難操作,培養(yǎng)過程中易結(jié)球,共培養(yǎng)后較難除菌,影響了抗性苗的獲得,因此首先排除LBA4404。而對于KYRT1和EHA105這兩種超毒菌株而言,差別并不是很顯著,但是使用KYRT1獲得了最高的GUS瞬時表達(dá)頻率(69.3%),另一方面進(jìn)一步的研究表明KYRT1侵染后獲得的抗性芽數(shù)目是EHA105的1.4倍左右。因而在隨后的實驗中,我們使用KYRT1作為轉(zhuǎn)化用的菌株。各菌株對供試的3個大豆品種的侵染也表現(xiàn)出明顯的基因型差異。三個受試品種對同一菌株的敏感程度依次是合豐35〉合豐25〉東農(nóng)42。2.3培養(yǎng)條件:農(nóng)桿菌生長的最共培養(yǎng)培養(yǎng)基pH對瞬時表達(dá)率的影響在不同的轉(zhuǎn)化試驗中有不同的結(jié)果。有研究認(rèn)為較低pH對轉(zhuǎn)化有利,原因是偏酸性的培養(yǎng)條件有利于農(nóng)桿菌vir區(qū)基因的表達(dá)。也有人認(rèn)為pH7.0對轉(zhuǎn)化有利,原因是pH7.0有利于農(nóng)桿菌生長,可縮短共培養(yǎng)時間,減輕農(nóng)桿菌對植物材料的毒害,從而有利于轉(zhuǎn)化材料生長。本實驗發(fā)現(xiàn),共培養(yǎng)基中pH為5.4時,胚尖具有最高的抗性芽得率(44.8%,圖2)。當(dāng)pH低于5.2或者高于5.6時抗性芽得率顯著下降。2.4共培養(yǎng)溫度和溫度對農(nóng)桿菌gus表達(dá)的影響共培養(yǎng)的溫度對T-DNA的轉(zhuǎn)移也有一定的影響。本實驗探討了共培養(yǎng)溫度對農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化大豆的影響。大豆幼嫩的胚尖經(jīng)農(nóng)桿菌感染后分別在19℃,22℃,25℃,28℃四種溫度下共培養(yǎng)5d后,檢測其GUS瞬時表達(dá)及相應(yīng)的抗性芽得率。結(jié)果顯示(圖3),22℃共培養(yǎng)溫度條件下農(nóng)桿菌具有最高的侵染活性,95%的胚尖均具有GUS活性,而且也獲得了最高的產(chǎn)生抗性芽頻率(59.8%)。當(dāng)溫度低于22℃時,抗性芽的數(shù)目大大下降,19℃時抗性芽得率比22℃時下降了近50%。當(dāng)溫度高于22℃時,抗性芽的數(shù)目也隨著溫度的升高而下降,28℃時的抗性芽得率與19℃時的基本一樣,即最低的抗性芽得率。這說明T-DNA的轉(zhuǎn)移對溫度是很敏感的。2.5共培養(yǎng)后先進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)篩選方式對轉(zhuǎn)化效率的影響較大。為確定有利于轉(zhuǎn)化細(xì)胞存活和分化生長的最佳條件,我們試驗了不同篩選方法對轉(zhuǎn)化后大豆再生頻率的影響。共培養(yǎng)之后外植體的生長能力較弱,如果直接轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基上會造成已經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞因為生長能力變?nèi)醵鴮?dǎo)致對抗生素抗性變?nèi)醵劳?。本實驗中我們也采取了共培養(yǎng)之后先進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)的方式,這也是目前大豆遺傳轉(zhuǎn)化中逐漸趨向統(tǒng)一的一種方式。感染過的胚尖經(jīng)過5-7天的恢復(fù)培養(yǎng)后,再進(jìn)行高選擇壓的篩選培養(yǎng),這樣獲得的抗性胚尖比未進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)的要多,但是抗性胚尖上剛剛萌動的分化芽大部分不能耐受高濃度的選擇壓力而逐漸褐化死亡。而效果更佳的篩選方式是將感染過的胚尖經(jīng)恢復(fù)培養(yǎng)后,先進(jìn)行低濃度選擇壓的篩選培養(yǎng),再進(jìn)行高選擇壓的篩選培養(yǎng),這種方式獲得的抗性胚尖及其分化頻率均較高。雖然恢復(fù)培養(yǎng)的同時可能會造成非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的大量增殖,抑制轉(zhuǎn)化細(xì)胞的增長或是造成假陽性和嵌合體,但長時間的高濃度選擇壓下的篩選培養(yǎng),可以淘汰大量的非轉(zhuǎn)化體而得到較多的轉(zhuǎn)化植株。因此實驗中篩選方式選用后者。2.6大豆基因型對農(nóng)桿菌生長的影響我們已經(jīng)研究了影響大豆遺傳轉(zhuǎn)化的幾個因素,將這些優(yōu)化的條件組合起來形成了優(yōu)化的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆遺傳轉(zhuǎn)化體系。大豆胚尖經(jīng)農(nóng)桿菌感染、共培養(yǎng)和恢復(fù)培養(yǎng)后,轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行選擇培養(yǎng),抗性組織轉(zhuǎn)入到分化培養(yǎng)基中生長并分化出芽苗(圖版Ⅰ,圖C,D)并具有GUS的穩(wěn)定表達(dá)(圖版Ⅰ,圖B),當(dāng)芽長至3cm左右后將其轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中進(jìn)一步發(fā)育,形成較好的根系(圖版Ⅰ,圖F),進(jìn)而抗性小植株被移栽到溫室的花盆中(圖版Ⅰ,圖G),最終得到假定的轉(zhuǎn)基因植株(putativetransgenicplants)。用這個優(yōu)化的轉(zhuǎn)化體系,供試的7個大豆優(yōu)良品系均得到了抗性植株,轉(zhuǎn)化頻率(PCR陽性植株率)為4.29%-18.0%(表2)。差不多所有的假定的轉(zhuǎn)化植株形態(tài)正常并且大多數(shù)(約70%)能夠正常結(jié)實(圖版Ⅰ,圖H)。植物基因型的依賴性是目前公認(rèn)的影響農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率的主要限制因素。大豆基因型對農(nóng)桿菌的敏感性,以及農(nóng)桿菌對大豆的侵染能力直接影響到大豆的遺傳轉(zhuǎn)化效率,是備受關(guān)注的問題。實驗結(jié)果顯示不同基因型對根癌農(nóng)桿菌侵染的敏感性存在著顯著的差異。其中樂豐具有最高的轉(zhuǎn)化率18.0%;其次合豐系列(25,35和39)和東農(nóng)42也獲得了較高的轉(zhuǎn)化率;而黑農(nóng)37和黑農(nóng)43對農(nóng)桿菌的敏感性最差,他們的轉(zhuǎn)化效率最低。另外實驗中我們發(fā)現(xiàn)農(nóng)桿菌對取得最高轉(zhuǎn)化率的樂豐39的侵染能力并沒有合豐39高,但是前者的植株再生能力很強(qiáng),組織培養(yǎng)實驗中由樂豐39的胚尖產(chǎn)生的芽苗數(shù)目為3-5個,由健康的芽苗再生成小植株的頻率達(dá)到95%,而且移栽成活率也最高。因此一個高效的組織培養(yǎng)再生體系對于后期的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化至關(guān)重要。實驗中我們所取得的較高的轉(zhuǎn)化效率也歸功于所采用的高效的胚尖再生體系。2.7轉(zhuǎn)化植株葉片的分析提取PPT抗性植株的DNA,進(jìn)行bar基因、pta基因和cryIA(c)基因的PCR分析。結(jié)果表明隨機(jī)抽取的30個植株中有24株為陽性植株,陽性植株中三個被測基因均有表達(dá),未出現(xiàn)單株差異現(xiàn)象。PCR陽性植株率約為80%。PCR檢測結(jié)果初步證明外源基因已經(jīng)整合進(jìn)大豆基因組中。部分抗性植株的PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖4。PCR陰性植株的產(chǎn)生可能是由于未被轉(zhuǎn)化的芽苗在抗性培養(yǎng)基上的生長或者是轉(zhuǎn)入的外源基因沒有能夠穩(wěn)定地整合進(jìn)大豆的基因組中。在對這些轉(zhuǎn)化植株葉片進(jìn)行PPT抗性分析之前,我們首先用棉棒將濃度為0、100、200、400、600mg/L的PPT溶液涂抹未轉(zhuǎn)化植株葉片。1-2周后發(fā)現(xiàn),當(dāng)PPT濃度為200或200mg/L以上時,所有經(jīng)過涂抹的大豆葉片均在一周內(nèi)開始黃化,脫水萎蔫,直至枯死。因而確定200mg/L的PPT溶液為適宜用量。所有這些PCR陽性的轉(zhuǎn)化植株葉片經(jīng)200mg/L的PPT溶液涂抹后,均表現(xiàn)出對PPT的抗性(圖版Ⅰ,圖E)。這些結(jié)果證實了bar基因已經(jīng)整合進(jìn)大豆基因組并得到了表達(dá)。PCR檢測bar基因、pta基因和cryIA(c)基因均為陽性的轉(zhuǎn)化植株被用來進(jìn)一步做Southern雜交分析。用CTAB法提取基因組DNA,用HindⅢ酶切后以PCR擴(kuò)增的pta基因片段為探針進(jìn)行Southern印跡分析,同時用SmaI酶切后以PCR擴(kuò)增的cryIA(c)基因片段為探針進(jìn)行Southern印跡分析。HindⅢ和SmaI在pCAMBIA3300質(zhì)粒中雖均為雙酶切位點,但是按照實驗設(shè)計的程序依舊可以說明Southern雜交條帶的數(shù)目基本可以顯示外源基因整合位點的數(shù)目。由圖5可看出,未轉(zhuǎn)化植株未顯示任何雜交信號,而檢測的10個轉(zhuǎn)化植株中有6個都顯示了pta基因和cryIA(c)基因的雜交信號,證明這兩個外源基因已經(jīng)整合進(jìn)大豆基因組中。其中有4個顯示單一條帶,2個顯示2條帶,表明外源基因在植物基因組中大多數(shù)(66.7%)為單位點整合。實驗結(jié)果也證明了農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物外源基因拷貝數(shù)低的優(yōu)點。3對農(nóng)桿菌誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的作用與其他雙子葉農(nóng)桿菌宿主植物(如煙草、馬鈴薯等)比較,大豆的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化難得多,是公認(rèn)的難轉(zhuǎn)化植物。究其原因,我們認(rèn)為大豆農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的主要障礙有兩個方面:一是大豆對農(nóng)桿菌的敏感性差。Hinchee等從100多個基因型中只篩選到了3個轉(zhuǎn)化頻率較高的材料。超毒菌株EHA105在大豆轉(zhuǎn)化中已被廣泛使用。最近KYRT1也被證明可以有效提高轉(zhuǎn)化效率。本實驗中我們對三種不同染色體背景的大豆常用農(nóng)桿菌菌株進(jìn)行了測試,篩選得到大豆胚尖最為敏感的KYRT1菌株,有效地提高了轉(zhuǎn)化效率。應(yīng)試的7個大豆品種中除了黑農(nóng)系列以外其他5個品系均獲得了較高的轉(zhuǎn)化率(12.31%-18%)。其次實驗中發(fā)現(xiàn)胚尖再生系統(tǒng)可以承受更長的感染時間(20h),其原因大致如下:(1)外植體表面光滑,比較容易洗去農(nóng)桿菌,而子葉節(jié)表面不光滑,褶皺較多,農(nóng)桿菌不易被洗去;(2)胚尖外植體有較強(qiáng)的分生能力,其分生組織為原分生組織,具有很強(qiáng)的分生能力,感染后其生長能夠抑制農(nóng)桿菌的生長,從而明顯降低了壞死的可能性。這樣長時間的侵染也在一定程度上提高了大豆對農(nóng)桿菌的敏感性。二是缺少適合于農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的大豆再生體系。實驗中我們采用的胚尖再生體系相對較常用的大豆子葉節(jié)再生體系具有較高的再生頻率,而且單個外植體獲得多芽的頻率也較高。而就再生周期來看,胚尖再生體系具有更短的周期,能在較短的時間內(nèi)獲得更多的再生植株。因此這一高效的再生體系的使用是轉(zhuǎn)化水平提高的基礎(chǔ)。同時篩選方式的優(yōu)化也有助于外源基因的整合并得到較多的