激素組合對本生煙草愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生的影響

激素組合對本生煙草愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生的影響

卷煙是一種重要的耕作，通常被用作重要的互補基因工程和闡明劑1.5。目前煙草遺傳轉(zhuǎn)化研究多用普通煙草(Nicotianatabacum)作為受體,而對本生煙草(Nicotianabenthamiana)的研究相對較少。本生煙草和普通煙草有密切的親緣關(guān)系［6－7］,由于其植株矮小,生長速度快,生命周期短,對植物病毒非常敏感,所以是基因功能分析和植物病害研究的重要工具［4－8］。有關(guān)本生煙草轉(zhuǎn)基因的研究也見諸報道,通過在本生煙草中瞬時表達促紅細胞生成素基因,能夠生產(chǎn)重組蛋白-促紅細胞生成素［9］。利用本生煙草建立的質(zhì)體轉(zhuǎn)化系統(tǒng),可以用來研究質(zhì)體和細胞核基因間的相互作用,以及檢測質(zhì)體中相關(guān)基因的表達情況［7］。研究表明,不同煙草品種的組織培養(yǎng)條件有所區(qū)別,如果完全按照普通煙草的培養(yǎng)方法培養(yǎng)本生煙草,容易出現(xiàn)外植體褐化、不定芽玻璃化等現(xiàn)象,并且很難獲得再生植株［4－5］。激素是植物組織培養(yǎng)中的關(guān)鍵因素,在建立本生煙草再生體系的整個培養(yǎng)過程中,激素的使用起到了非常重要的作用［4－5，10］。因此,如何獲得最佳的激素組合,成為建立本生煙草高效再生體系的關(guān)鍵。本研究探索了本生煙草愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生的最佳條件,旨在為建立高效的本生煙草懸浮細胞培養(yǎng)體系和遺傳轉(zhuǎn)化體系奠定基礎(chǔ)。1材料和方法1.1煙草生長條件本生煙草種子由濱州學(xué)院生命科學(xué)系實驗室保存,本生煙草生長條件為:每天16h光照、8h黑暗,濕度保持在60%~70%,溫度控制在25℃左右,光照強度為2200lx。1.2培養(yǎng)基的配制與增殖1.2.1種子消毒和無菌苗獲得將本生煙草種子用0.1%氯化汞溶液消毒10min,無菌水漂洗5~6次,接種到MS基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)。1.2.2培養(yǎng)基配制培養(yǎng)基的配制方法見表1。所有培養(yǎng)基中均添加3%蔗糖和0.8%瓊脂。不定芽增殖培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基。1.2.3結(jié)果觀測與統(tǒng)計方法外植體接種30d后進行增殖培養(yǎng),并統(tǒng)計出愈率、不定芽分化率、生根率。有關(guān)計算公式如下:2結(jié)果與分析2.1煙草葉片的愈傷組織以生長30d的無菌苗葉片為外植體,接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中(圖1-A)。在接種后第10天可以觀察到本生煙草葉片發(fā)生明顯卷曲,在葉片邊緣產(chǎn)生肉眼可見的乳白色顆粒狀愈傷組織(圖1-B)。繼續(xù)培養(yǎng)至22d時,在葉片上形成了成團的愈傷組織,結(jié)構(gòu)疏松,生長十分旺盛(圖1-C)。2.2葉片含深芽點本生煙草葉片接種到不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中12d后,葉片邊緣出現(xiàn)少量深綠色芽點(圖1-D)。接種后第26天芽點已經(jīng)形成明顯的不定芽(圖1-E)。2.3ebf切取不定芽,接種到生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)(圖1-F)。在生根誘導(dǎo)的第12天可以看到不定芽基部已形成明顯的根(圖1-G)。最后選取生長旺盛的試管苗進行馴化和移栽(圖1-H)。2.4葉片愈傷組織的生長為了研究不同激素組合對本生煙草愈傷組織誘導(dǎo)的影響,分別對不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基中葉片愈傷組織的生長情況進行觀察分析。結(jié)果顯示,在葉片接種后的第30天,雖然這4種培養(yǎng)基均可誘導(dǎo)葉片產(chǎn)生愈傷組織,并且誘導(dǎo)率幾乎都為100%,但產(chǎn)生愈傷組織的數(shù)量和質(zhì)量存在差異。R3培養(yǎng)基中產(chǎn)生愈傷組織的質(zhì)量最好,愈傷組織色澤均勻而透明,生長迅速,堆積的團塊明顯較大(圖2-C);雖然R4培養(yǎng)基中產(chǎn)生愈傷組織的數(shù)量較多,但質(zhì)量有所下降(圖2-D);R1、R2培養(yǎng)基也能誘導(dǎo)葉片產(chǎn)生愈傷組織,但愈傷組織的誘導(dǎo)效果相對較差,尤以R1表現(xiàn)的更為明顯(圖2-A、圖2-B)。上述結(jié)果表明,1mg/L2,4-D和0.2mg/LKT為誘導(dǎo)本生煙草愈傷組織的最佳激素組合,這時本生煙草葉片細胞脫分化的能力最強,細胞分裂最為旺盛。2.5y1、y2培養(yǎng)基中奏鳴率高、分布速度較快,培養(yǎng)時間短為了獲得本生煙草不定芽誘導(dǎo)的最佳激素組合,分別對不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基中葉片不定芽的生長情況進行觀察分析。結(jié)果顯示,在葉片接種后第30天,雖然這4種培養(yǎng)基均可誘導(dǎo)葉片產(chǎn)生不定芽,但不定芽產(chǎn)生的數(shù)量和速度存在差異。y1培養(yǎng)基中不定芽產(chǎn)生最早、生長最快、數(shù)量最多(圖2-E);與y1培養(yǎng)基相比,y2培養(yǎng)基誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽的時間有所延長,不定芽生長速度稍慢,數(shù)量略有下降(圖2-F)。在y1、y2培養(yǎng)基中,不定芽分化率都在90%以上。y4培養(yǎng)基中不定芽生長較為緩慢(圖2-H),不定芽分化率大概為80%;y3培養(yǎng)基中不定芽長勢最差(圖2-G),不定芽分化率僅為60%左右。此外觀察發(fā)現(xiàn),在y1、y2培養(yǎng)基中許多不定芽呈半透明的水浸狀,表現(xiàn)出明顯的玻璃化現(xiàn)象,并且培養(yǎng)時間越長,這種現(xiàn)象越明顯。但在y4培養(yǎng)基中不定芽并沒有表現(xiàn)出明顯的玻璃化。根據(jù)以上結(jié)果,可以認(rèn)為不定芽誘導(dǎo)最適培養(yǎng)基為y1培養(yǎng)基,但須要在不定芽產(chǎn)生早期進行增殖培養(yǎng),以減少玻璃化的發(fā)生;y4培養(yǎng)基則適于不定芽的長期培養(yǎng)。3激素添加量對及其誘導(dǎo)的菌株中kt濃度的影響植物激素是植物細胞生長最適宜的調(diào)節(jié)物質(zhì)［11］。生長素常用來誘導(dǎo)愈傷組織的形成和根的分化［11－13］;細胞分裂素的主要生理作用是促進細胞分裂、誘導(dǎo)芽的形成、促進芽的生長［11，13］。2,4-D對啟動植物細胞脫分化十分重要,研究表明隨著2,4-D濃度的增大,植物愈傷組織的誘導(dǎo)能力逐漸增強,但超過一定濃度時,反而對愈傷組織的誘導(dǎo)起抑制作用。本研究表明,本生煙草愈傷組織誘導(dǎo)的最適2,4-D濃度為1mg/L,該條件下本生煙草葉片細胞脫分化的能力最強,細胞分裂最為旺盛。KT是一種細胞分裂素,能促進脫分化的細胞保持旺盛的分裂能力,因此在培養(yǎng)基中添加低濃度KT有助于愈傷組織生長和增殖,但KT濃度不宜過高,否則會對細胞分裂起抑制作用。對于本生煙草而言,比較合適的KT濃度為0.2mg/L。在不定芽誘導(dǎo)過程中,6-BA和NAA是2種關(guān)鍵成分,它們之間必須維持一個合適比例。當(dāng)6-BA、NAA濃度分別為1.5、0.1mg/L時,不定芽產(chǎn)生較多,生長速度較快,但存在一定程度的玻璃化現(xiàn)象;當(dāng)6-BA濃度達到3.0mg/L,不定芽長勢較慢,但玻璃化程度較輕?？梢?適當(dāng)提高6-BA濃度在一定程度上可減少不定芽玻璃化的產(chǎn)生,這和蘇上等的研究結(jié)果一致［4］,而和崔海濤等的研究結(jié)果稍有不同［5］。在本生煙草培養(yǎng)過程中,極易產(chǎn)生玻璃化現(xiàn)象,導(dǎo)致試管苗分化能力降低［14－15］。為了減少試管苗的玻璃化,一種方法是適當(dāng)提高6-BA濃度,但不定芽產(chǎn)生數(shù)量較少;另一種方法是在6-BA濃度較低的情況下,先誘導(dǎo)產(chǎn)生較多的不定芽,然后在不含激素的培養(yǎng)基中及時進行繼代增殖培養(yǎng),這樣可以降低不定芽出現(xiàn)玻璃化的概率。綜上,為了得到更多的不定芽,比較適宜的激素組合為1.5mg/L6-BA+0.1mg/LNAA,但須要在不定芽形成早期及時進行增殖培養(yǎng)。對于生根誘導(dǎo),無論是MS培養(yǎng)基還是1/2MS培養(yǎng)基,都可誘導(dǎo)不定根的產(chǎn)生