菊花對農(nóng)桿菌的敏感性及其改良研究

菊花對農(nóng)桿菌的敏感性及其改良研究

通過傳統(tǒng)的混合育種方法，菊花的品種改良在植物形狀、花色、開花期、病蟲害和非生物脅迫方面取得了顯著成效。但菊花高度雜合的特點使其在雜交育種中不確定性很強,生殖或地理隔離使其無法充分利用近緣種屬植物的優(yōu)良基因資源,常規(guī)方法育種存在較大的局限性。轉(zhuǎn)基因育種目前已成為菊花新品種培育的重要手段,外源基因的導入有針對性地改善了目標性狀并保留原有優(yōu)良性狀,實現(xiàn)了利用新基因資源改良菊花品種的目標。農(nóng)桿菌介導的外源基因轉(zhuǎn)化是最為常用的菊花轉(zhuǎn)基因的手段,其轉(zhuǎn)化效率依賴于基因型和外植體的再生特性。1989年Lemieux利用農(nóng)桿菌介導法成功獲得第一株轉(zhuǎn)基因菊花(Lemieuxetal.,1990),開創(chuàng)了菊花分子育種的新途徑。至今分子育種已在花色、花期、抗性等方面取得了極大成就。1外源基因表達提高自20世紀70年代中期首次發(fā)現(xiàn)菊花對農(nóng)桿菌敏感以來,農(nóng)桿菌介導法已成為菊花遺傳轉(zhuǎn)化中最常用的方法,但存在轉(zhuǎn)化效率低、外源基因表達量低、嵌合體株率高及再生過程中基因沉默等問題。外植體的選擇、抗生素的確定、易感菌株的選用、共培養(yǎng)條件等對轉(zhuǎn)化效率起著決定性作用。1.1利用比較顯著的菊花遺傳轉(zhuǎn)化效率菊花對LBA4404、EHA105、EHA101、AGL0和Ach5等多種農(nóng)桿菌菌株都表現(xiàn)出敏感性(Ledgeretal.,1991;Renouetal.,1993;deJongetal.,1994)。Ledger等(1991)首次使用農(nóng)桿菌LBA4404轉(zhuǎn)化菊花品種‘Korean’,成功獲得轉(zhuǎn)基因菊花,遺傳轉(zhuǎn)化率達到1.7%。Renou等(1993)利用EHA101菌株轉(zhuǎn)化菊花,遺傳效率可達到5%~40%。Shinoyama等利用LBA4404和EHA101菌株轉(zhuǎn)化菊花品種‘ShuhoNoChikara’,并對兩者遺傳效率進行比較,LBA4404為5.2%(Shinoyamaetal.,2002b),EHA101為4.4%(Shinoyamaetal.,2002a)和8.8%(Shinoyamaetal.,2003);利用EHA101和EHA105兩個菌株轉(zhuǎn)化菊花栽培種‘YamateShiro’,得到了相對較高的遺傳轉(zhuǎn)化效率,EHA101為21.7%(Shinoyamaetal.,2002a)和22.0%(Shinoyamaetal.,2008),EHA105為23.9%(Shinoyamaetal.,2012b)。此外,Ach5、AGL0、B6S3等菌株也應用于菊花的轉(zhuǎn)化過程,并成功獲得較高的轉(zhuǎn)化效率(Pavingerováetal.,1994;Urbanetal.,1994;Annadanaetal.,2002)。在早期的菊花遺傳轉(zhuǎn)化中,對菌株的選擇較分散,其中LBA4404的使用率較高,其次為A2002、A281、Ach5等菌株。deJong等(1994)和Urban等(1994)發(fā)現(xiàn)使用的菌株不同,轉(zhuǎn)化的效率不同,AGL0和EHA105相較LBA4404的遺傳轉(zhuǎn)化效率更高。近些年,隨著菊花轉(zhuǎn)化方法的不斷改進,遺傳轉(zhuǎn)化率高的菌株的使用表現(xiàn)出集中化,主要為LBA4404,其次為EHA101和EHA105,再次是AGL0。綜合菊花轉(zhuǎn)基因的成功案例中不同菌株的使用情況(Teixeiraetal.,2013),最為常用的LBA4404菌株遺傳轉(zhuǎn)化率高且較穩(wěn)定,使用的比例占32.0%,其次為EHA105、AGL0和C58,分別占15.5%、11.7%和7.8%。1.2外植體與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)外植體的來源和生理活性也是決定轉(zhuǎn)化效率的另一主要因素。迄今為止,葉片是最為常見且效率較高的農(nóng)桿菌侵染受體,其次是莖(Teixeiraetal.,2013);此外,采用花梗(Lemieuxetal.,1990;deJongetal.,1995;Annadanaetal.,2002)、花瓣(deJongetal.,1994)和根(Dolgovetal.,1997)作為受體的遺傳轉(zhuǎn)化均獲得成功。外植體與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)過程中,添加乙酰丁香酮或水解酪蛋白等輔助試劑的培養(yǎng)基可以促進提高農(nóng)桿菌的侵染效率。在共培養(yǎng)基質(zhì)中添加100μmol·L-1的乙酰丁香酮可以提高農(nóng)桿菌的侵染性(deJongetal.,1994)。Shinoyama等(1998)發(fā)現(xiàn)50μmol·L-1的乙酰丁香酮就足以提高農(nóng)桿菌的侵染效率,同時還發(fā)現(xiàn)添加水解酪蛋白的共培養(yǎng)基可顯著提高侵染效率,及添加5%(體積比)聚山梨酸酯后可以增強農(nóng)桿菌與外植體之間的粘合性。1.3自我抑制劑的選擇菊花轉(zhuǎn)化中選擇標記基因的使用最早見于1990年(Lemieuxetal.,1990),該基因為新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II基因(nptⅡ),卡那霉素在之后的研究中被作為最主要的抗生素。此外,潮霉素、巴龍霉素、遺傳霉素等抗生素均在選擇轉(zhuǎn)基因菊花陽性植株中取得了成功,并得到了廣泛的應用(Shinoyamaetal.,2002a;Aidaetal.,2004;Narumietal.,2005b;Kuboetal.,2006)。此外,Xie等(2012)以磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因(PMI)為選擇性標記基因,用甘露糖作為選擇劑,以PtDHAR作為目的基因,獲得了轉(zhuǎn)化植株。通過甘露糖篩選后,155株幼嫩植株存活,通過Southernblot分析,4個株系轉(zhuǎn)入了目的基因,這種甘露糖選擇標記系統(tǒng),對陽性植株的選擇非常有效,可以代替抗生素作為安全性非抗生素的陽性植株篩選劑。2改變菊花的優(yōu)良特性2.1wjbachii基因在地被小菊中的應用轉(zhuǎn)基因技術(shù)在觀賞性狀改良方面主要應用于花色、花形和株形等方面(表1)。查爾酮合成酶(chalconesynthase,CHS)是花青素合成的關(guān)鍵酶,跟花朵成色密切相關(guān),將CHS的正義和反義片段導入菊花,抑制內(nèi)源CHS的表達,植株花瓣顏色從粉色變成為淺粉色(Courtney-Guttersonetal.,1993,1994)。通過RNAi技術(shù)沉默類胡蘿卜素裂解雙加氧酶(carotenoidcleavagedioxygenase,CCD)基因,花色由白色變?yōu)辄S色,培育出優(yōu)良的‘YellowJinba’新品種(圖1,A、B)(Ohmiyaetal.,2006,2009)。F3′,5′H是花色素苷代謝途徑中的一個關(guān)鍵性酶,控制合成飛燕草素,形成藍色系花。Kim等(1998)將F3′,5′H基因成功導入野菊(Dendranthemaindicum)和紫花野菊(Dendranthemazawadskii)中,以期培育出藍色菊花品種。抑制菊花隱花基因CAG(chrysanthemum-AGAMOUS),雄蕊和雌蕊表現(xiàn)出花冠狀組織(Aidaetal.,2008),改變了花形。外源rol基因在菊花中表達,形成了矮小緊湊株型的植株(Mitiouchkina&Dolgov,2000;Kuboetal.,2006)。赤霉素不敏感g(shù)ai基因的導入也可以獲得矮小的植株類型(圖1,D)(Pettyetal.,2003);此外,煙草光敏色素基因phyB1轉(zhuǎn)入菊花可以引起植株輕微矮化(Zhengetal.,2001),甘薯MADS-box基因IbMADS4的轉(zhuǎn)入也能獲得矮小緊湊的株型(Aswathetal.,2004)。Khodakovskaya等(2009)發(fā)現(xiàn)異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因IPT的導入可增強植株的側(cè)枝發(fā)生,而分枝抑制子類似基因Ls-like基因的導入則會引起植株分枝的減少(Hanetal.,2007;Jiangetal.,2010),如圖1,C所示(Jiangetal.,2010)。這些性狀的改變?yōu)閳@林綠化的地被小菊提供了矮化多分枝的新種質(zhì)。Narumi等(2011)利用CRES-T(嵌合抑制子沉默技術(shù))將擬南芥生長發(fā)育相關(guān)基因TCP3與植物特異轉(zhuǎn)錄抑制域SRDX相融合,而后轉(zhuǎn)入菊花,獲得了具有指狀細長形葉片的植株。2.2外源ft基因改變菊花發(fā)育菊花是典型的短日照植物,在短日照的秋季開花,之后隨溫度下降進入休眠狀態(tài),開花受光周期和溫度共同影響。轉(zhuǎn)基因技術(shù)越來越多地運用于調(diào)節(jié)菊花開放時間(表2)。與開花時間相關(guān)的基因有CO,FT,COL,HY5和COP1等,其中FT蛋白具有誘導花芽分化的作用,如將擬南芥FT(FLOWERINGLOCUST)基因轉(zhuǎn)入‘神馬’菊花中,轉(zhuǎn)基因株系的組培苗在16h光照下分化出花蕾,說明外源FT基因使短日照菊花具有了不依賴光周期控制而開花的特性,通過轉(zhuǎn)FT基因來改變菊花的花期是可行的(圖1,E)(姜丹等,2010)。Oda等(2012)從甘野菊中分離出FT類似基因CsFTL1、CsFTL2和CsFTL3,其中CsFTL3被證實是光周期調(diào)控開花的關(guān)鍵調(diào)節(jié)子,CsFTL3在菊花中過表達后,與對照相比,在非誘導光照下可正常開花,推斷CsFTL3可能誘導菊花提早開花。在菊花品種‘Sei-Marine’中導入突變的乙烯受體基因mDGERS1(etr1-4),降低了轉(zhuǎn)基因植株對乙烯敏感性,使得轉(zhuǎn)基因植株在低溫條件下仍能正常開放(Narumietal.,2005a;Satohetal.,2008)。Morita等(2012)也驗證了etr1-4突變體轉(zhuǎn)基因菊花植株可以早花并對FLOWERINGLOCUST-like的表達量有明顯提高。對于一些品種,外源GA的施加可以代替短日處理促進花形成,而乙烯或乙烯利將抑制花朵的開放(Sumitomoetal.,2008),證實了乙烯在花朵開放過程中起負調(diào)控的作用。2.3抗真菌和細菌設施栽培環(huán)境下種植的菊花極易感染病害,表現(xiàn)為植株矮化枯萎、葉片斑化、黑莖、植株生長抑制等,嚴重影響了菊花的經(jīng)濟價值。菊花的病害主要分為兩類:(1)病毒和類病毒,菊花抗病毒轉(zhuǎn)基因育種主要是將抑制病毒或類病毒發(fā)生的病毒本身基因的部分片段導入菊花后篩選抗病植株(表3)。如將黃瓜花葉病毒(CMV)外殼蛋白CP基因轉(zhuǎn)入菊花‘Kundan’中,轉(zhuǎn)基因植株對CMV的敏感性降低,同時延遲了植株的發(fā)病時間,表現(xiàn)出對CMV的抗性(Kumaretal.,2012)。該手段在菊花中還應用于TSWV,INSV,GRSV,CVB等病毒的抗性研究中(Urbanetal.,1994;Shermanetal.,1998;Yepesetal.,1999;Skachkivaetal.,2006)。(2)真菌和細菌,抗真菌和細菌的轉(zhuǎn)基因育種主要將病菌抑制物基因?qū)刖栈ㄖ仓?。在菊花抗真菌病害轉(zhuǎn)基因育種中,應用最為廣泛的是幾丁質(zhì)酶基因(chitinasegene)。如Takatsu等(1999)獲得的11個轉(zhuǎn)小麥幾丁質(zhì)酶基因RCC2的轉(zhuǎn)基因菊花株系對灰霉病表現(xiàn)出不同程度的抗性(圖1,F)?？Х纫蜃鳛橐环N次級代謝產(chǎn)物,針對真菌病害也具有典型的化學防御作用。如Kim等(2011a,2011b)將3個N–甲基轉(zhuǎn)移酶基因(CaXMT1,CaMXMT1,CaDXMT1)導入到菊花‘Jinba’品種中,其咖啡因水平與煙草相同,具有灰霉病抗性(圖1,G),同時還具有抵抗食草動物、鱗翅類昆蟲和蚜蟲侵害的作用。目前菊花抗蟲分子育種中最常見的一類基因是從微生物蘇云金桿菌分離出來的蘇云金桿菌(Bacillusthuringiens)殺蟲晶體蛋白基因,簡稱Bt基因(表3)。將蘇云金桿菌內(nèi)毒素基因BtⅡ轉(zhuǎn)入菊花‘WhiteHurricane’將從蘇云金桿菌中分離的殺蟲蛋白Cry1A(b)基因分別導入菊花‘Parliament’、‘Shuno-no-chikara’及‘Yamate-shiro’品種中,均得到抗蟲性轉(zhuǎn)化植株(vanWordragenetal.,1993;Shinoyamaetal.,2002a,2008)。2.4干旱、鹽脅迫和冷害對正?；颊呖估湫缘挠绊懪c農(nóng)作物抗逆相關(guān)的基因主要有:(1)編碼滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和脅迫下細胞保護物質(zhì)的基因,如果聚糖蔗糖酶基因,甜菜堿醛脫氫酶基因,水通道蛋白基因等;(2)細胞膜上的離子轉(zhuǎn)運基因,如Na+/H+逆向運轉(zhuǎn)體基因;(3)逆境相關(guān)的調(diào)控基因,如DREB轉(zhuǎn)錄因子。在菊花上應用最廣泛的是逆境相關(guān)的調(diào)控基因DREB。DREB家族基因是提高植物非生物脅迫抗性的有效基因之一,擬南芥DREB轉(zhuǎn)基因植株在干旱、鹽脅迫和冷害處理時均表現(xiàn)出逆境耐性的顯著增強(表4)。Hong等(2006a,2006b,2009)將35S和rd29A啟動子驅(qū)動的擬南芥AtDREB1A基因轉(zhuǎn)入地被菊花‘FallColor’品種中,在干旱和高鹽等逆境誘導條件下,AtDREB1A在35S啟動子驅(qū)動的轉(zhuǎn)基因植株中為組成型過表達,而在rd29A啟動子驅(qū)動的轉(zhuǎn)基因植株中為誘導型過量表達。在干旱和鹽脅迫條件下,轉(zhuǎn)基因植株相較正常植株表現(xiàn)出更強抗性,且rd29A︰AtDREB1A轉(zhuǎn)基因植株比35S︰AtDREB1A轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出更強的抗性。在2℃冷處理條件下,通過表型分析、電解質(zhì)滲出率、SOD活性和脯氨酸含量分析發(fā)現(xiàn),AtDREB1A轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出更強的抗冷性,且rd29A啟動子驅(qū)動的轉(zhuǎn)AtDREB1A植株抗冷性更為顯著。在45℃高溫脅迫條件下,70%的35S︰AtDREB1A轉(zhuǎn)基因植株存活,而野生型的植株存活率小于20%,顯示出轉(zhuǎn)化株具有較強的抗高溫能力(圖1,H)(Hongetal.,2009)。3功能驗證和基因序列的解釋近幾年,對菊科植物自身基因功能的研究也取得了長足的進展。將從菊科植物分離出的基因?qū)霐M南芥、煙草等模式植物中進行功能驗證,研究這些基因的作用機理。目前該類研究主要集中在菊花非生物脅迫耐性和側(cè)枝發(fā)生等相關(guān)基因的功能分析(表5)。4無藥物選擇的基因轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物可同時具有高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病毒、抗蟲、抗寒、抗旱、抗?jié)?、抗鹽堿和抗除草劑等多重優(yōu)點,但同時轉(zhuǎn)基因植物對環(huán)境和人類都存在潛在的威脅,菊花是一種典型的自交不親和、天然異交植物,存在著通過蟲媒或風媒授粉與菊科其他植物進行天然雜交的可能性,即存在外源基因漂移的危險。如野生型的菊科植物接受了轉(zhuǎn)某種抗蟲基因的菊花品種的花粉,F1代的野生植株就很有可能具有抗蟲性。這種異源基因在菊科內(nèi)的基因漂流現(xiàn)象對環(huán)境生態(tài)還有植物體本身具有潛在威脅,從一定程度上限制了轉(zhuǎn)基因菊花的實際應用。然而Shinoyama等(2012b)的研究使這種問題的解決成為了可能:使用中間載體pBIK102H69A將甜瓜中突變的乙烯受體基因Cm-ETR1/H69A導入菊花‘YamateShiro’品種中,在獲得的335個轉(zhuǎn)基因株系中,有15個株系的花粉粒明顯減少,其中3個株系在20~35℃條件下完全觀察不到花粉粒,且發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因株系也會導致雌蕊不育,表明Cm-ETR1/H69A基因的表達能顯著影響轉(zhuǎn)基因植株的雄蕊和雌蕊育性。DMC1基因涉及減數(shù)分裂的同源重組過程,沉默該基因?qū)е轮亟M的紊亂。將攜帶DMC1基因片段和cry1Ab基因片段的中間載體轉(zhuǎn)入菊花中,獲得的682株再生植株中有149個株系表現(xiàn)出較強的鱗翅類抗性,其中7個在正常生長溫度下表現(xiàn)雄蕊不育性(Shinoyamaetal.,2012a),這對控制基因漂移具有重要作用。除目標基因外,選擇性標記基因?qū)τ诃h(huán)境和植株體本身也會存在潛在的危害,其合成的蛋白可能會通過根系進入土壤,對土壤的微生物系統(tǒng)造成影響。Xie等(2012)以磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因(PMI)為選擇性標記基因,以甘露糖作為選擇試劑的選擇標記系統(tǒng)可有效選擇出陽性植株,這種無抗生素篩選的基因?qū)敕▽⒂幸嬗谔岣咿D(zhuǎn)基因植物的安全性。Sun等(2009)構(gòu)建的pCAMBIA1300載體具有兩個相鄰的T-DNA區(qū),分別攜帶潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(hpt)和β–葡萄糖醛酸酶基因(uidA),轉(zhuǎn)入菊花‘Beilinhuang’,獲得兼有潮霉素抗性和GUS活性的T0代植株17株,而在繼續(xù)篩選的T1代中,大約有15.7%的轉(zhuǎn)基因植株不含有選擇標記基因,說明無選擇標記基因載體系統(tǒng)也可應用于陽性植株的篩選同時還可降低抗生素的危害性,這在菊花轉(zhuǎn)基因育種中也具有很好的借鑒性。5育種技術(shù)在菊花性狀改善中的前景5.1分子育種促進dna的同源轉(zhuǎn)化與其他觀賞植物相比,菊花的遺傳轉(zhuǎn)化和分子育種研究較為廣泛和深入(圖1),主要原因是菊花植株的再生對培養(yǎng)條件要求不高,對多種根癌農(nóng)桿菌敏感,遺傳轉(zhuǎn)化受體廣泛,已建立了多種基因型適宜的遺傳轉(zhuǎn)化體系等。菊科植物花期長和抗逆性強等優(yōu)良性狀,為栽培菊花的分子育種提供了豐富的基因資源。在菊花中不僅重要功能基因的同源轉(zhuǎn)化能夠有效改良的目標性狀(Hanetal.,2007;Jiangetal.,2010;Chenetal.,2011;Odaetal.,2012),還可以將非同屬同科植物的優(yōu)良基因通過異源轉(zhuǎn)入進行性狀改良(張路等,2011;Chenetal.,2012),較大程度拓寬了菊花性狀改良的空間。菊花轉(zhuǎn)基因研究進展顯示,轉(zhuǎn)基因技術(shù)育種具有提高觀賞價值、降低生產(chǎn)成本、提高切花品質(zhì)、提高抗性等優(yōu)勢,因此,結(jié)合常規(guī)育種,利用有效安全轉(zhuǎn)基因手段,創(chuàng)造更加豐富的菊花種質(zhì)資源將具有較好的應用前景。5.2玫瑰花花色的改良盡管菊花轉(zhuǎn)基因研究已經(jīng)有了長足進展,但大量基因資源未被挖掘和利用。隨著菊花遺傳轉(zhuǎn)化體系的日益成熟,需要越來越多的基因資源來滿足轉(zhuǎn)基因性狀改良的需求,特別是菊科植物中特