5-fu與hsa的相互作用研究

5-fu與hsa的相互作用研究

氟尿酮屬于最初的磺酸鹽。其中，5-氟尿酮（5-fu）具有很強(qiáng)的水位腫瘤活性結(jié)構(gòu)，以及易引起突變的烯醇結(jié)構(gòu)。它可以干擾、阻止dna、鈉胺和蛋白質(zhì)合成并發(fā)揮腫瘤作用。它是評價生命系統(tǒng)的重要內(nèi)容。生物大分子與植物小分子相互作用的研究是生命系統(tǒng)科學(xué)研究的重要內(nèi)容。本文論述了生物大分子與植物小分子相互作用的性質(zhì)。以及藥物在分子水平上的作用。對于了解藥物的一般含義以及藥物治療效果的生命過程具有基礎(chǔ)和重要意義。根據(jù)藥物腫瘤機(jī)的研究，一些抗腫瘤藥物與d'特定相互作用是腫瘤活性的主要原因，而d'不是腫瘤藥物的唯一目標(biāo)。腫瘤藥物和蛋白質(zhì)的異質(zhì)化變化也是腫瘤細(xì)胞去世機(jī)制的研究目的、內(nèi)容和方法。同時，還提供了各種疾病的相關(guān)研究信息，以確定藥物在人類血漿中的最佳濃度。微熱法的非特異性有助于研究藥物和生物高官之間的特定相互作用。采用圓二色譜法和楊氏計算方法，對溶液中的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行了方便、有效、準(zhǔn)確的分析。這是基于等溫反應(yīng)和等溫反應(yīng)的理論。利用最小熱反應(yīng)法和太陽二色譜法，研究了藥物作為模型物質(zhì)的異質(zhì)化反應(yīng)信息。以及以金屬或表面活性劑的分子之間的相互作用。因此，對于藥物和hsa的組合，我們可以獲得許多生命系統(tǒng)發(fā)展過程中的結(jié)構(gòu)和能量變化信息，以及藥物代謝動力學(xué)和最佳藥物濃度的確定具有一定的理論和應(yīng)用價值。微熱法的非特異性有助于研究藥物和生物高官之間的特定相互作用。這種二色譜分析方法也具有一定的操作價值。微熱法的非特異性有助于研究藥物和生物高官之間的特定相互作用。通過對溶液中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化的分析，采用了最小差分離心法和楊氏計算方法。根據(jù)盡可能假設(shè)的假設(shè)和朗姆-色度-平面效應(yīng)的測量，采用非線性最小差分法和楊氏計算方法，確定藥物配合體（5-fu）與蛋白質(zhì)（hsa）的結(jié)合類型、單位點(diǎn)的組合，以及水體的密度、熵的變化、吉布斯自由裁量權(quán)和5-fu誘導(dǎo)的二級結(jié)構(gòu)單元的相對含量。本文在力學(xué)原理和。1實(shí)驗(yàn)部分1.1方法的精密度和試劑納瓦級滴定式微量熱計(TAM2277,瑞典ThermometricAB公司).用隨機(jī)所帶Digitam4.1軟件控制實(shí)驗(yàn)過程并進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和處理.通過測定蔗糖稀釋焓驗(yàn)證,該量熱計的電標(biāo)定精密度高于±1%.JascoJ-810圓二色譜儀(Japan).人血清白蛋白(HSA),摩爾質(zhì)量為66.5×103kg·mol-1,購自Sigma公司,其溶液濃度用稱重法配制.5-氟尿嘧啶(5-FU)(結(jié)構(gòu)見圖1),購自北京百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司.三(羥甲基)胺基甲烷(Tris)、鹽酸、氯化鈉等均為分析純試劑,實(shí)驗(yàn)用水是在堿性高錳酸鉀存在下制備的二次蒸餾水.5-氟尿嘧啶和HSA的溶液均用濃度為0.01mol·dm-3,pH=7.4的Tris-HCl緩沖溶液配制.1.25u3000酸、堿分別滴定氟尿炔啶和hsa的反應(yīng)將5-氟尿嘧啶溶液裝入500μLHamilton注射器,用612LundSyringePump注射泵,每次滴12.00μL于0.50mLHSA溶液中.滴定時間間隔足夠長(40min),以使信號返回基線.安瓿中攪拌器轉(zhuǎn)速固定在30r·min-1,待基線在攪拌下穩(wěn)定后啟動實(shí)驗(yàn),以使攪拌產(chǎn)生的熱量被自動扣除.實(shí)驗(yàn)溫度為(298.15±0.01)K.為扣除5-氟尿嘧啶和HSA的稀釋熱,分別進(jìn)行5-氟尿嘧啶溶液向緩沖溶液中滴定和緩沖溶液向HSA溶液中滴定的實(shí)驗(yàn).1.35hsa結(jié)構(gòu)參數(shù)測量HSA是光學(xué)活性物質(zhì),因此可通過圓二色譜(CD)分析溶液中藥物誘導(dǎo)HSA的構(gòu)象改變.實(shí)驗(yàn)時光源系統(tǒng)用氮?dú)獗Ｗo(hù)(流量為5L·min-1),樣品池的光徑為0.1cm.測量參數(shù):掃描速率100nm·min-1,分辨率0.1nm,響應(yīng)時間1s,累積次數(shù)3次.掃描波段為200~250nm,HSA原始濃度為2μmol·L-1.向上述指定濃度HSA中分別加入不同量的5-氟尿嘧啶,控制5-氟尿嘧啶與HSA摩爾比率Mr(c5-FU/cHSA)分別為0,71和140.用JascoJ-810圓二色譜儀(Japan)測其CD譜,并用該儀器附帶的楊氏方法軟件計算出本結(jié)合體系兩類作用位點(diǎn)對應(yīng)HSA二級結(jié)構(gòu)單元的相對含量.2結(jié)果與討論2.1配合體的力學(xué)性質(zhì)對于藥物配體5-氟尿嘧啶與蛋白質(zhì)(HSA)的結(jié)合過程,其基本假設(shè)為:(1)一個蛋白質(zhì)分子可有i類結(jié)合位點(diǎn),它們可結(jié)合相同的配體,同類中的所有位點(diǎn)在熱力學(xué)意義上是相同的;(2)i類結(jié)合位點(diǎn)相互獨(dú)立,即蛋白質(zhì)分子的每一類受體位點(diǎn)與藥物配體的結(jié)合率彼此互不依賴.基于上述假設(shè)和Langmuir結(jié)合理論有式中θi,Ki和Ni分別是第i類位點(diǎn)的結(jié)合率、結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)(或曰藥物配體5-FU與HSA結(jié)合的摩爾比率Mr=c5-FU/cHSA),cL,0和cP,0分別為配體和蛋白質(zhì)的初始濃度,cL是配體的游離濃度.將(1)式代入(2)式有ITC實(shí)驗(yàn)中第j次注射所得到的熱量(Qj)可表示為式中Vcell是微量熱計中安瓿(反應(yīng)器)中被滴定劑的體積,?θi是從第j-1次注射到第j次注射第i類結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合率的增量,?Hi是第i類位點(diǎn)的結(jié)合焓.由(3)式可知,在cL,0和cP,0已知的情況下,cL是關(guān)于Ni和Ki的函數(shù).所以(4)式含有Ki,?Hi,Ni共3m個未知量,根據(jù)等溫滴定量熱數(shù)據(jù)(Qj),利用MATLAB7.01軟件以Qj對cL,0進(jìn)行非線性最小方差擬合,可得到3m個熱力學(xué)參數(shù).通過擬合曲線與實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的擬合度的回歸分析,當(dāng)藥物配體與HSA結(jié)合時,在蛋白質(zhì)HSA分子上有兩類結(jié)合位點(diǎn)(m=2,方差最小)是合理的[14~16](見圖3).因此,通過非線性擬合處理可確定本結(jié)合體系兩類結(jié)合的K1,K2,?H1,?H2,N1和N2六個熱力學(xué)參數(shù)值.根據(jù)熱力學(xué)原理,又可求出該結(jié)合過程體系的吉布斯自由能變和熵變(見表1).2.2類結(jié)合體系的擬合分析由圖2可見,隨藥物與HAS物質(zhì)的量比Mr增加,藥物5-氟尿嘧啶與HSA的表觀摩爾結(jié)合焓(累積熱量與藥物的物質(zhì)的量比)的變化呈現(xiàn)為先增加后減小(此趨勢轉(zhuǎn)化時5-氟尿嘧啶與HSA的物質(zhì)的量比Mr約為73左右)然后趨于平穩(wěn)(此趨勢轉(zhuǎn)化時5-氟尿嘧啶與HSA的物質(zhì)的量比Mr約為143左右).由圖3擬合曲線可看出,通過實(shí)驗(yàn)預(yù)測的兩類結(jié)合位點(diǎn)的物質(zhì)的量比Mr與應(yīng)用非線性最小方差擬合方法(擬合曲線見圖3)確定的兩類結(jié)合的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)分別為71和140是基本吻合的,這說明本文藥物與HSA結(jié)合作用的假設(shè)是可行的.由表1可見兩類結(jié)合體系的K值均相對較大,說明其結(jié)合力較強(qiáng)結(jié)合狀態(tài)亦較為穩(wěn)定.2.3民機(jī)菌細(xì)胞重疊過程多肽鏈和水化層相互作用的力學(xué)性質(zhì)應(yīng)注意做到三基本結(jié)合體系藥物與蛋白質(zhì)的結(jié)合可設(shè)想涉及以下過程:a.藥物和蛋白質(zhì)的溶解稀釋;b.蛋白質(zhì)與單個藥物分子的作用;c.蛋白質(zhì)在兩類作用位點(diǎn)與藥物配體的穩(wěn)定結(jié)合作用;d.藥物誘導(dǎo)蛋白質(zhì)發(fā)生的構(gòu)象變化.因?yàn)樵贗CT實(shí)驗(yàn)中我們已經(jīng)設(shè)法扣除了藥物與蛋白質(zhì)的溶解稀釋熱效應(yīng),又因?yàn)樾纬煞€(wěn)定兩類作用位點(diǎn)時自由藥物分子的濃度遠(yuǎn)低于量熱滴定實(shí)驗(yàn)過程中樣品池內(nèi)藥物分子的濃度,所以a,b過程的熱效應(yīng)可忽略不計.因此可以認(rèn)為,本結(jié)合體系的熱效應(yīng)主要是藥物配體與蛋白質(zhì)分子的穩(wěn)定結(jié)合及其誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象變化(即c,d過程)而產(chǎn)生的.蛋白質(zhì)分子構(gòu)象是其生物功能的基礎(chǔ).藥物分子可通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化發(fā)揮其藥理藥效作用.根據(jù)圓二色譜分析的研究結(jié)果(見表2、圖4)可以看出,本結(jié)合體系中蛋白質(zhì)(HSA)的二級結(jié)構(gòu)單元的相對含量是不同的,這說明伴隨著本結(jié)合體系兩類結(jié)合位點(diǎn)的形成,不同濃度的藥物配體與蛋白質(zhì)的相互作用誘導(dǎo)蛋白質(zhì)分子構(gòu)象發(fā)生了一定程度的變化.根據(jù)蛋白質(zhì)折疊熱力學(xué)原理,蛋白質(zhì)的折疊過程是以自由能(?G)達(dá)最低趨勢由其伸展態(tài)(或曰去折疊,Unfolding)向其折疊態(tài)(Folding)演變的過程,蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化及穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的形成是其發(fā)生折疊的結(jié)果.蛋白質(zhì)折疊的熱力學(xué)基礎(chǔ)可表示為?G=GF-GU=?H-T?S=?H鏈+?H溶劑-T?S鏈-T?S溶劑,折疊過程的發(fā)生取決于蛋白質(zhì)多肽鏈和溶劑的焓變(?H)和熵變(?S).?H鏈取決于折疊過程中蛋白質(zhì)各殘基之間及其與溶劑之間的相互作用,?S鏈取決于蛋白質(zhì)多肽鏈發(fā)生折疊的構(gòu)象變化而?H溶劑和?S溶劑則取決于結(jié)合體系中諸種相互作用對溶劑水分子的分布和結(jié)構(gòu)的影響.本結(jié)合過程的發(fā)生及其結(jié)合體系熱力學(xué)性質(zhì)的改變是體系作用物質(zhì)諸種相互作用效應(yīng)綜合平衡的結(jié)果在結(jié)合過程中:(1)藥物和蛋白質(zhì)分子表面的極性基團(tuán)對溶劑水化層結(jié)構(gòu)的破壞,因折疊過程中蛋白質(zhì)折疊態(tài)非極性疏水側(cè)鏈之間的范德華作用(或稱分散效應(yīng)dispersioneffect)不足于抵償?shù)鞍踪|(zhì)伸展態(tài)極性水分子誘導(dǎo)疏水基團(tuán)中的偶極而產(chǎn)生的靜電相互作用(或稱誘導(dǎo)效應(yīng)inductiveeffect)而導(dǎo)致的蛋白質(zhì)疏水鏈的折疊效應(yīng)(?H非極性鏈),以及蛋白質(zhì)分子表面極性側(cè)鏈之間相互作用的效應(yīng)(?H極性鏈),為吸熱效應(yīng);(2)藥物與蛋白分子表面的極性基團(tuán)之間的靜電相互作用以及氫鍵作用,蛋白質(zhì)折疊態(tài)眾多水分子之間的氫鍵相互作用對伸展態(tài)水分子與疏水側(cè)鏈的相互作用的取代效應(yīng)(?H溶劑),以及因藥物和蛋白質(zhì)的極性基團(tuán)與溶劑水分子的相互作用而導(dǎo)致的溶劑水分子在極性基團(tuán)周圍一定程度的聚集分布效應(yīng)(?H溶劑),為放熱效應(yīng);(3)折疊態(tài)稱之為“有序、堅密之構(gòu)造”,伸展態(tài)稱之為“無序、散漫之構(gòu)造”,折疊過程多肽鏈的?S鏈(構(gòu)象熵變)<0,為熵減效應(yīng);因蛋白質(zhì)(HSA)折疊過程中非極性側(cè)鏈?zhǔn)杷饔眯纬墒杷诵膶?dǎo)致伸展態(tài)非極性側(cè)鏈強(qiáng)迫溶劑水分子形成的剛性有序結(jié)構(gòu)(或曰籠結(jié)構(gòu),clathratestructure)的破壞,致使部分溶劑水分子遷出疏水核心進(jìn)入溶液本體轉(zhuǎn)化為自由水分子而產(chǎn)生的較大?S溶劑(疏水熵變)>0,為熵增效應(yīng);按照溶劑化分層結(jié)構(gòu)理論處于原水化層與溶液本體之間的次水化層是活動性很大的無序排列的結(jié)構(gòu)破壞區(qū)域,體系適量的極性基團(tuán)對溶劑次水化層結(jié)構(gòu)的影響,冰山四面體結(jié)構(gòu)適量增加致使溶劑的?S溶劑(結(jié)構(gòu)熵變)>0,亦為熵增效應(yīng).?S鏈(構(gòu)象熵變)和?S溶劑(結(jié)構(gòu)熵變)與?S溶劑(疏水熵變)相比,數(shù)值一般較小.能對蛋白質(zhì)折疊形成穩(wěn)定構(gòu)象作出單項(xiàng)較大貢獻(xiàn)的當(dāng)屬非極性疏水側(cè)鏈引起的?S溶劑(疏水熵變).體系的焓變和熵變的改變特征是分析結(jié)合過程驅(qū)動及其作用推動力的熱力學(xué)依據(jù).根據(jù)Ross和Subramanian的觀點(diǎn)和本結(jié)合體系的熱力學(xué)性質(zhì)的改變,可認(rèn)為:第一類結(jié)合,?H>0(吸熱),?S>0(熵增)T?S>?H,熵增效應(yīng)較大并決定該過程的?G<0,故表現(xiàn)為熵驅(qū)動過程,疏水相互作用可能是熵驅(qū)動的主要推動力;第二類結(jié)合,?H<0(放熱),?S>0(熵增),|?H|>|T?S|,放熱和熵增效應(yīng)均導(dǎo)致該過程的?G<0,故表現(xiàn)為以焓驅(qū)動為主的焓-熵協(xié)同驅(qū)動過程,氫鍵和靜電相互作用可能是焓-熵協(xié)同驅(qū)動的主要推動力.對于本結(jié)合體系的熱效應(yīng),綜合結(jié)合過程中的吸熱效應(yīng)和放熱效應(yīng),前者較大導(dǎo)致結(jié)合焓?H>0,后者較大導(dǎo)致結(jié)合焓?H<0.第一類結(jié)合的熵變?S>0,正值較大,為體系熵變因素中?S溶劑(疏水熵變)占有較大分額所致.第二類結(jié)合的熵變?S>0,數(shù)值較小,可能是伴隨著兩類作用位點(diǎn)的形成,游離藥物分子的減少,蛋白質(zhì)疏水核心的基本穩(wěn)定,疏水作用的相對減弱,?S溶劑(疏水熵變)的降低而?S溶劑(結(jié)構(gòu)熵變)和多肽鏈的?S鏈(構(gòu)象熵變)作用的相對增大,熵變因素的