藥動學(xué)模型法測定五靈膠囊中乙素含量

藥動學(xué)模型法測定五靈膠囊中乙素含量

五靈膠囊是由五味子、柴胡等中藥組成的復(fù)方制劑。具有平肝健脾、活血化瘀、對乙型慢性肝炎的治療效果好。五味子乙素是五味子的有效成分,具有顯著降酶、抗脂質(zhì)過氧化作用。五味子乙素在小鼠體內(nèi)的藥動學(xué)研究未見報道。本文對小鼠ig五靈膠囊后血漿中五味子乙素的藥代動力學(xué)進(jìn)行了研究,為臨床用藥提供實驗依據(jù)。1藥物、試劑和標(biāo)準(zhǔn)品美國tsp-100型高效液相色譜儀;昆明小鼠購自第四軍醫(yī)大學(xué)動物中心,動物合格證號:陜醫(yī)動證字SC×K(軍)2002-05;五靈膠囊,由西京醫(yī)院制劑室提供,批號20020925;五味子乙素供試品(乙素供試品),由本室提取純化,為白色結(jié)晶,熔點(diǎn)117～119℃,經(jīng)紫外、紅外光譜、EI-MS質(zhì)譜確證,純度96%;五味子乙素對照品(乙素對照品),由中國藥品生物制品鑒定所提供;甲醇色譜純,Merck公司產(chǎn)品;水為三蒸水;硫酸胺為分析醇,西安化學(xué)試劑廠生產(chǎn)。2方法和結(jié)果2.1鉻ct-18的鉻柱4.6mm150mm，粒度：5m-m。流動相為甲醇水80.20。流量1.0ml/min;檢測波長254nm;柱溫為室溫。2.2藥液制備方式昆明小鼠456只,雄性,置相對濕度45%～75%、溫度(25±1)℃動物試驗室飼養(yǎng)3d,禁食過夜,自由飲水,次日按體重分層,隨機(jī)分組,每時間點(diǎn)為一組,每組4只,五靈膠囊按16.6g/kg(相當(dāng)于人體給藥劑量10倍,其中含五味子乙素45.0mg)ig給藥,分別在0.16,0.32,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,3.5,4.0,4.5,5.0,6.0,7.0,8.0,10.0,12.0,14.0,18.0,20.0,24.0,26.0,28.0,32.0h眼眶采血,置于肝素鈉的離心管內(nèi),室溫放置30min,3000r/min離心10min,分離血漿,每組血漿合并置-20℃凍存。乙素供試品按45.0mg/kgig給藥,分別在0.16,0.32,0.5,1.0,1.5,2.0,3.0,3.5,4.0,4.5,5.0,6.0,8.0,10.0h采血,同上法操作得血漿,-20℃凍存。2.3試驗溶液的制備2.3.1血漿供試品溶液取上述依時間點(diǎn)取每組小鼠混勻血漿0.7ml,分別加0.25g硫酸胺,振蕩混勻1min,再加乙腈-甲醇(4∶1)溶液4ml,振蕩混勻3min,3000r/min離心20min,取上清液置小蒸發(fā)皿內(nèi),于40℃水浴上用氮?dú)獯蹈?殘渣加色譜甲醇溶解至1ml,搖勻,-20℃放置過夜。次日用0.22μm微孔濾膜抽濾,作為血漿供試品溶液。取上述乙素供試品依時間點(diǎn)取每組混勻血漿0.7ml,按供試品溶液的制備方法制得血漿乙素供試品溶液。另取五靈膠囊缺五味子陰性樣品按2.2和供試品溶液的制備方法制得的陰性供試品溶液。2.3.2對照品溶液的制備取50℃真空干燥4h五味子乙素對照品適量,精密稱定,加入0.7ml空白血漿中,按血漿供試品溶液的制備方法制備得50μg/ml的對照品溶液。精密吸取血漿對照品溶液、血漿供試品溶液、血漿乙素供試品溶液和陰性供試品溶液各20μl,注入液相色譜儀在UV-204nm處測定吸收面積值,在此條件下,對照品供試液、乙素供試品溶液和供試品溶液吸收入血的其它成分或代謝產(chǎn)物均可達(dá)到基線分離,峰形基本對稱,在同一整留時間有色譜吸收峰,而陰性供試品溶液在同一滯留時間無色譜吸收峰。見圖1。2.4乙素血漿濃度檢測取空白血漿0.7ml,一式7份,加入乙素對照品溶液,使血漿終濃度分別為0.5,1.0,2.0,4.0,8.0,16.0,32.0μg/ml,按血漿供試品的處理方法制備并測定峰面積,以乙素峰面積(Y)對乙素血漿濃度(C)作圖,得回歸方程Y=8457+26408·C,r=0.9995。乙素在0.5～32.0μg/ml范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,最低檢測限為30ng/ml。2.5儀器測定的穩(wěn)定性考察精密吸取血漿供試品溶液測定日內(nèi)、日間面積并計算含量,日內(nèi)每3h測定1次,共測5次,日間每日測1次,共測5次。測得血漿供試品日內(nèi)含量分別為:0.750,0.748,0.752,0.751,0.756μg/ml,平均含量為(0.751±0.029)μg/ml,RSD=0.39%。測得日間含量分別為0.751,0.753,0.740,0.760,0.760μg/ml,平均含量為(0.753±0.082)μg/ml,RSD=0.39%,儀器測定的穩(wěn)定性符合含量測定要求,供試品溶液在測定期間是穩(wěn)定的,可滿足測定要求。取正常小鼠血漿分成5份,分別加入4μg/ml的五味子乙素對照品,按血漿供試品溶液制備得對照品溶液。2人重復(fù)測得5次含量分別為:0.774,0.769,0.745,0.780,0.774μg/ml,平均含量為(0.768±0.014)μg/ml,RSD=1.77%。同對照品多次操作測定含量波動不大,說明次測定方法穩(wěn)定可靠。2.6加樣回收率試驗取給藥后的混合血漿0.7ml,一式2份,1份加已知量的乙素對照品,另一份不加,按血漿供試品方法制備,連續(xù)制樣5次,測定含量并計算血漿供試品的百分回收率,結(jié)果表明5次平均回收率為101.18%,RSD=1.84%。見表1。2.7藥物動力學(xué)計算經(jīng)HPLC測得血漿乙素供試品和血漿供試品血藥濃度數(shù)據(jù)用3P97藥代動力學(xué)計算程序和SIP胃腸制劑藥代動力學(xué)計算程序進(jìn)行處理,供試品乙素和五靈膠囊ig給藥后,在體內(nèi)藥代動力學(xué)過程符合一級吸收的單室模型,乙素供試品與血漿供試品的血藥濃度計算所得時間曲線見圖2。藥動學(xué)參數(shù)見表2。3藥動學(xué)結(jié)果關(guān)系本試驗采用中性鹽硫酸胺凝絮蛋白,快速震搖,迅速加入乙腈與甲醇混合溶液(4∶1)提取,在40℃水浴上氮?dú)獯蹈?能從血漿樣品內(nèi)提取乙素,經(jīng)HPLC能較好地分析小鼠ig五靈膠囊后其血漿中乙素含量,回收率與重復(fù)性試驗證明此方法可行,分離度和穩(wěn)定性較好,五靈膠囊陰性樣品分析表明血漿中其它成分對乙素測定無干擾。中藥復(fù)方制劑吸收入血成分復(fù)雜,色譜峰較多,內(nèi)標(biāo)無合適的滯留時間,故采用外標(biāo)法計算含量,同次試驗均用血漿乙素供試品與血漿供試品同時測定并計算含量。依據(jù)AIC、擬合度和擬合優(yōu)度值數(shù)據(jù)判斷,乙素供試品與五靈膠囊所含乙素在小鼠體內(nèi)藥動學(xué)過程符合一級吸收單室模型。從藥時曲線可知五味子乙素在小鼠體內(nèi)從吸收到消除歷程10h藥時曲線反應(yīng)為雙峰,采用胃腸制劑藥代動力學(xué)程序計算(見表2),五靈膠囊中乙素在小鼠體內(nèi)從吸收到消除歷程大于32h,胃內(nèi)藥時曲線與前者相似,在胃內(nèi)的藥動學(xué)參數(shù)大致相似。在腸內(nèi)兩者的藥時曲線就截然不同了,供試品乙素在腸內(nèi)的藥時曲線有規(guī)律,適合胃腸制劑藥動學(xué)程序計算,而五靈膠囊中乙素在胃腸內(nèi)藥時曲線呈波動式上升,在ig給藥后,32h血漿濃度達(dá)最高,其水平與胃內(nèi)峰濃度持平,用胃腸制劑藥代動力學(xué)程序不能計算藥動學(xué)參數(shù),產(chǎn)生此現(xiàn)象的原因可能是五靈膠囊內(nèi)組分中五味子其它木脂素在肝內(nèi)藥物酶作用下轉(zhuǎn)化成五味子乙素,我們曾在體外采用大鼠肝細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行試驗,將五味子甲素與肝細(xì)胞培養(yǎng)48h,測定肝細(xì)胞甲素的同時也發(fā)現(xiàn)有乙素的存在,含量分析約30%。從藥時曲線可以看出,在給藥12h又產(chǎn)生一個最大濃度峰并且繼續(xù)呈鋸齒狀增高,這種現(xiàn)象與肝臟產(chǎn)生代謝轉(zhuǎn)化的肝藥酶時間周期有關(guān),還是五味子其它成分經(jīng)肝腸循環(huán)而