雌二醇對大鼠下丘腦神經(jīng)激肽b表達(dá)的影響

雌二醇對大鼠下丘腦神經(jīng)激肽b表達(dá)的影響

1983年，kanga等人首次從豬骨髓中分離神經(jīng)激酶b（nk）。含有10個(gè)氨基酸,是興奮性神經(jīng)肽類中速激肽家族的一員。近期研究發(fā)現(xiàn),編碼NKB和其受體(NK3R)的基因TAC3以及TACR3失活突變所引發(fā)的人促性腺功能減退癥,并出現(xiàn)性腺類固醇和促黃體生成素(Luteinizinghormone,LH)的循環(huán)水平降低,青春期延遲,甚至不育。因此探究性腺激素與NKB表達(dá)之間的關(guān)系可為初情期啟動(dòng)調(diào)控機(jī)制增加新的調(diào)控靶點(diǎn),同時(shí)也為青春期發(fā)育相關(guān)疾病的病理生理基礎(chǔ)和臨床研究與治療提供理論依據(jù)。前人研究發(fā)現(xiàn),NKB和NK3R在下丘腦促性腺激素釋放激素(Gonadotropinreleasinghormone,GnRH)神經(jīng)元分布的關(guān)鍵區(qū)域有較高的表達(dá),如下丘腦弓狀核、室旁核和腹內(nèi)側(cè)核等核團(tuán)。近期對基因敲除小鼠的相關(guān)研究證實(shí),雌激素通過雌激素受體α(Estrogenreceptorα,ERα)介導(dǎo)GnRH的負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用,研究表明在人、大鼠和綿羊的下丘腦弓狀核NKB神經(jīng)元中均有ERα表達(dá),而在GnRH神經(jīng)元未發(fā)現(xiàn)ERα表達(dá)。以上研究表明,雌激素及其受體在NKB調(diào)控生殖方面起著重要的作用。但目前關(guān)于NKB研究多停留在不同物種的定位研究上,未見探討NKB與雌激素在生殖過程中的變化規(guī)律。本試驗(yàn)采用卵巢摘除以及雌激素處理等方法,研究不同處理方式下大鼠青春期啟動(dòng)的時(shí)間以及下丘腦NKB表達(dá)量的變化,旨在為進(jìn)一步揭示NKB在動(dòng)物生殖調(diào)控中所起的作用及其機(jī)制提供形態(tài)學(xué)參考。1材料和方法1.1麻醉大鼠分組自清源試驗(yàn)動(dòng)物公司購入15只健康的成年SD大鼠(10只雌鼠、5只雄鼠),進(jìn)行飼養(yǎng)繁殖,從其所生F1代中挑選40只25d幼齡雌性SD大鼠,隨機(jī)分成4組:外源性E2處理組(E2組);花生油處理組(C組);卵巢摘除+E2組(OVX+E2組);卵巢摘除組(OVX組);每組10只。腹腔注射2%的戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉,麻醉后在E2組大鼠背部埋植含有100μg/kg苯甲酸雌二醇的硅膠管;在C組大鼠背部埋植含有0.05mL花生油的硅膠管;OVX+E2和OVX組大鼠麻醉后,利用外科手術(shù)法摘除雙側(cè)卵巢,并在OVX+E2組大鼠背部埋植含有100μg/kg苯甲酸雌二醇的硅膠管。1.2思想上染苯二醇aszh-mas試驗(yàn)截取2.2cm長,內(nèi)徑1.57mm,外徑2.41mm的硅膠管(濟(jì)南晨生醫(yī)用硅橡膠制品公司),用硅膠專用粘合劑進(jìn)行一端封口。苯甲酸雌二醇(寧波激素二廠)按1mg/mL溶于藥典級花生油(BSZHSCIENCES,P49872)中,根據(jù)試驗(yàn)分組將適量的雌二醇用1mL注射器注入硅膠管中,反復(fù)甩管避免氣泡產(chǎn)生,最后用粘合劑將另一端封口。室溫放置24h干燥,干燥后蒸餾水清洗表面,75%的乙醇再清洗1min,室溫晾干,環(huán)氧乙烷滅菌。1.3冠狀連續(xù)冰激凌切片的制備繼續(xù)飼養(yǎng)大鼠,至陰門開啟立即麻醉并處死大鼠,取下丘腦置入4%的多聚甲醛溶液中固定12~24h。然后將下丘腦置于30%的蔗糖溶液中固定,制成7μm厚的冠狀連續(xù)冰凍切片。冰凍切片制備2套,1套做免疫組化染色,另1套做陰性對照。1.4nhpa顯色試驗(yàn)做好的切片用PBS浸洗3次,每次10min,用1%Triton(V(Triton)∶V(PBS)=1∶99)孵育10~20min,用牛血清白蛋白(10%)封閉15min,甩去血清,加入NKB(NKB羊抗鼠,SANTACRUZ,sc-14109,1∶200),濕盒內(nèi)4℃過夜。過夜后的切片用PBS洗3次,每次10min,加入PV-9003試劑盒(北京中杉金橋,K122320D)中的試劑Ⅰ,37℃恒溫箱孵育30min,PBS洗3次,每次10min,再加試劑Ⅱ,37℃恒溫箱孵育30min,PBS洗3次,每次10min。參照DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋,ZLI-9032)說明書進(jìn)行顯色,蘇木精復(fù)染,1%的鹽酸酒精分色,梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。顯微鏡觀察可見免疫組化陽性產(chǎn)物呈棕黃色,陰性對照組一抗用PBS替代,其他步驟同上。1.5觀察指標(biāo)1.5.1門關(guān)閉時(shí)間每組大鼠陰門開啟后立即記錄日齡,并計(jì)算各組大鼠陰門開啟的平均日齡。1.5.2顯微鏡觀察在光學(xué)顯微鏡下觀察切片,并用Olympus攝影顯微鏡BH22采集圖像,以獲取NKB在大鼠下丘腦的免疫組化陽性反應(yīng)區(qū)域。1.6陽性區(qū)域平均光密度值每組隨機(jī)取5張切片,對免疫組化陽性區(qū)域進(jìn)行拍照,運(yùn)用Image-proplus6.0軟件對陽性區(qū)域平均光密度值(Densitymean)進(jìn)行分析。各組光密度值和大鼠陰門開啟時(shí)間均用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,采用t檢驗(yàn)分析各組間差異。2結(jié)果與分析2.1大鼠陰門開啟的時(shí)間對大鼠陰門開啟的時(shí)間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。發(fā)現(xiàn)E2、OVX+E2組大鼠比C組大鼠陰門開啟的時(shí)間顯著提前(P<0.01),E2與OVX+E2組的大鼠陰門開啟時(shí)間差異不顯著(P>0.05)。OVX組大鼠至試驗(yàn)結(jié)束時(shí)陰門仍未開啟(處死日齡同C組)(表1)。2.2各組大鼠nhpa表達(dá)情況DAB顯色后,NKB免疫陽性細(xì)胞呈現(xiàn)深淺不均的棕黃色(圖1),陽性細(xì)胞多呈卵圓形和橢圓形,胞質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色或有棕黃色微粒附著,胞核內(nèi)無著色。在E2組(圖1(a)、(b)、(c)、(d))、C組(圖1(e)、(f)、(g))、OVX+E2組(圖1(h)、(i)、(j))和OVX組(圖1(k)、(l)、(m))大鼠下丘腦弓狀核、室旁核、腹內(nèi)側(cè)核均出現(xiàn)了NKB免疫陽性細(xì)胞表達(dá)。OVX組大鼠弓狀核(圖1(k)-a)、室旁核(圖1(l)-b)、腹內(nèi)側(cè)核(圖1(m)-c)中NKB呈強(qiáng)陽性表達(dá)。C組(圖1(g)-d)和OVX組(圖1(m)-d)大鼠室周核也有少量的NKB陽性表達(dá)。陰性對照組的免疫反應(yīng)結(jié)果為陰性(圖1(n)、(o))。圖1(p)為下丘腦整體輪廓圖。2.3對大鼠腹內(nèi)側(cè)核和室旁核nhpa表達(dá)的影響對各組大鼠下丘腦不同核團(tuán)NKB免疫陽性產(chǎn)物相對表達(dá)量進(jìn)行分析(表2)。OVX組大鼠下丘腦弓狀核NKB陽性表達(dá)顯著高于OVX+E2、C和E2組(P<0.05);在大鼠腹內(nèi)側(cè)核,OVX組大鼠NKB平均光密度值最高(P<0.05),OVX+E2組高于C組(P<0.05),E2組最低(P<0.05);OVX+E2、C和E2組大鼠室旁核NKB平均光密度值均顯著低于OVX組(P<0.05);OVX與C組大鼠下丘腦室周核也有少量陽性表達(dá),但二者間差異不顯著(P>0.05)。3討論3.1a大鼠陰門提前開啟,a型中的激素對gnrh脈沖發(fā)生器陰門開啟是判斷雌性大鼠初情期啟動(dòng)的重要標(biāo)志?，F(xiàn)有的研究表明下丘腦GnRH出現(xiàn)脈沖式釋放是下丘腦-垂體-性腺(Hypothalamic-pituitarygonada,HPG)軸正常運(yùn)行的始動(dòng)因素和核心物質(zhì)。初情期的啟動(dòng)則源于GnRH脈沖發(fā)生器抑制狀態(tài)的解除。幼年期是動(dòng)物生殖系統(tǒng)發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期,此時(shí)機(jī)體內(nèi)源性雌激素水平極低,因此對性激素水平的變化非常敏感。本試驗(yàn)在不消除內(nèi)源性雌激素的情況下施以外源性雌激素,結(jié)果發(fā)現(xiàn)E2組大鼠陰門提前開啟;在消除內(nèi)源性雌激素的同時(shí)給予外源性雌激素替代,發(fā)現(xiàn)OVX+E2組大鼠陰門提前開啟。揭示一定量的雌激素可解除“GnRH脈沖發(fā)生器”的抑制狀態(tài),提前啟動(dòng)雌性大鼠HPG軸。這與Herbison在1998年報(bào)道雌激素對哺乳動(dòng)物GnRH神經(jīng)元分泌起著至關(guān)重要作用的結(jié)論一致。近年研究表明,雌激素受體有二種亞型ERα、ERβ,敲除下丘腦的ERα基因后,大鼠無生殖行為和正常動(dòng)情周期。提示雌激素通過ERα來調(diào)節(jié)生殖作用。已有的研究證實(shí)GnRH神經(jīng)元上不存在ERα,如果雌激素要想解除“GnRH脈沖發(fā)生器”的抑制狀態(tài),就必須通過中間神經(jīng)元來連通二者。有研究發(fā)現(xiàn)NKB神經(jīng)元上存在ERα,提示NKB可能是雌激素調(diào)控生殖作用的樞紐。本試驗(yàn)在進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)果的前提下又探究了雌激素對下丘腦NKB表達(dá)的影響。3.2er與nhp-lh神經(jīng)元軸突相關(guān)研究試驗(yàn)結(jié)果表明,NKB主要分布在大鼠下丘腦弓狀核、腹內(nèi)側(cè)核和室旁核。這與前人在小鼠、大鼠、猴、人和綿羊的定位結(jié)果一致。下丘腦弓狀核、腹內(nèi)側(cè)核和室旁核是哺乳動(dòng)物神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的重要核團(tuán),也是下丘腦GnRH神經(jīng)元和ERα主要聚集處。研究證實(shí)GnRH神經(jīng)元僅表達(dá)ERβ,說明雌激素負(fù)反饋?zhàn)饔每赡芡ㄟ^其他神經(jīng)元上的ERα發(fā)揮作用。人類基因研究也確定了NKB及其受體NK3R是正常發(fā)育狀況下激活下丘腦GnRH脈沖分泌所必需的。根據(jù)前人研究下丘腦弓狀核NKB神經(jīng)元投射路徑來看,NKB神經(jīng)纖維有向GnRH分泌的關(guān)鍵區(qū)域正中隆起和第三腦室周圍的室旁核、室周核處延伸的跡象,且NKB神經(jīng)元軸突也有向第三腦室周圍延伸的跡象。研究發(fā)現(xiàn)GnRH神經(jīng)元軸突可以識別NKB受體。因此,筆者推測雌激素通過ERα與NKB神經(jīng)元建立聯(lián)系,產(chǎn)生的調(diào)節(jié)信號經(jīng)NKB神經(jīng)元的投射路徑傳遞到GnRH神經(jīng)元,刺激GnRH神經(jīng)元調(diào)節(jié)生殖內(nèi)分泌作用,當(dāng)然這并不是唯一的路徑。本試驗(yàn)結(jié)果表明NKB在E2組大鼠下丘腦的室周核上也有陽性表達(dá)。這與Kalló等人在小鼠上的研究結(jié)果相似;但與Rance等和Kauffman等在大鼠上的研究結(jié)果不同。設(shè)想可能跟物種差異,以及試驗(yàn)動(dòng)物的處理方法不同有關(guān)。對比各組大鼠下丘腦NKB免疫陽性產(chǎn)物的表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)OVX組大鼠下丘腦弓狀核上的NKB呈強(qiáng)陽性表達(dá),揭示內(nèi)源性雌激素干擾NKB的表達(dá),這與Kauffman等和Navaaro等發(fā)現(xiàn)的小鼠卵巢切除后下丘腦弓狀核內(nèi)的NKB表達(dá)量增加,以及Eghlidi等發(fā)現(xiàn)的卵巢摘除的猴子,其下丘腦弓狀核NKB出現(xiàn)強(qiáng)陽性表達(dá)的結(jié)論不謀而合。此外,C組大鼠下丘腦弓狀核NKB呈陽性表達(dá),而E2和OVX+E2組大鼠下丘腦弓狀核上的NKB免疫反應(yīng)呈現(xiàn)弱陽性,提示外源性雌激素抑制大鼠下丘腦弓狀核NKB的表達(dá)。研究證實(shí)上述抑制作用并沒有發(fā)生在ERα基因敲除的小鼠上,推測ERα是雌激素與NKB相互作用的結(jié)合位點(diǎn)。近期研究發(fā)現(xiàn)NKB激動(dòng)劑刺激青春期前大鼠分泌LH,并且該結(jié)果隨后在小鼠、猴、山羊和羊等動(dòng)物上也得到了驗(yàn)證。然而Kinsey-Jones等發(fā)現(xiàn)NKB激動(dòng)