藥物蛋白的聚乙二醇類修飾

藥物蛋白的聚乙二醇類修飾

蛋白質(zhì)藥物主要包括蛋白質(zhì)激素和干預(yù)、血漿蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)類生長調(diào)節(jié)因素和神經(jīng)營養(yǎng)因素、粘度、蛋白質(zhì)、堿性蛋白質(zhì)、丙烯酸和復(fù)合氨基酸。蛋白質(zhì)藥物由于具有作用專一、高效等特點,而在人類健康中發(fā)揮著日益重要的作用。蛋白質(zhì)藥物的原料有動植物細(xì)胞和微生物細(xì)胞等非人體來源。若將非人體來源的藥物蛋白通過靜脈注射到人體后常常刺激機體的免疫系統(tǒng)使之產(chǎn)生特異免疫應(yīng)答,產(chǎn)生對該種蛋白的抗體。繼續(xù)注射該種蛋白,就會產(chǎn)生過敏性反應(yīng)。即使不產(chǎn)生過敏反應(yīng),免疫應(yīng)答也會導(dǎo)致蛋白質(zhì)的失活或加快蛋白質(zhì)的代謝,從而降低藥物蛋白的療效。蛋白質(zhì)藥物的療效不僅取決于蛋白質(zhì)特定的化學(xué)結(jié)構(gòu),而且還取決于其特定的空間結(jié)構(gòu),因此可以通過基因工程、化學(xué)修飾等手段部分或全部解決蛋白質(zhì)藥物的缺陷,其中化學(xué)修飾以其靈活多樣、簡便易行的特點而得到了較為廣泛的應(yīng)用。1peg類修飾劑化學(xué)修飾劑與蛋白質(zhì)的反應(yīng)主要有酰化反應(yīng)、烷基化反應(yīng)、氧化和還原反應(yīng)、芳香環(huán)取代反應(yīng)等。代表性的修飾劑有醋酸酐、乙酰咪唑、乙二醛、右旋糖苷、肝素、葡聚糖、乙二酸/丙二酸的共聚物、羧甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、聚1,3-乙二醇次甲基醚、乙烯/順丁烯二酰肼共聚物、聚氨基酸、多聚唾液酸、環(huán)糊精、聚乙二醇等,其中以聚乙二醇(PEG)類修飾劑應(yīng)用最多。PEG是一種兩親性聚合物,由重復(fù)的乙烯氧亞單元組成,每個乙烯氧亞單元的相對分子質(zhì)量為44。PEG活性較低,無毒,而且末端有兩個能被活化的OH基團(tuán)。為了獲得單功能的PEG,一般將PEG的一端轉(zhuǎn)化為甲氧基或其它的烷氧基。除了線形PEG,還有星形PEG,即通過中間物如賴氨酸、三嗪等將兩上或更多的PEG鏈連接在一起。PEG類修飾劑與其他修飾劑相比,毒性小,無抗原性,具有良好的兩親性,且生物相容性已經(jīng)得到FDA認(rèn)證,特別是當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)經(jīng)過PEG類修飾劑修飾后,修飾劑的許多優(yōu)良性質(zhì)也會隨之移植到修飾蛋白中。常用PEG類修飾劑見圖1。不同種類的PEG修飾劑表現(xiàn)在都能較容易地合成出來或直接購買,但不同的修飾劑化學(xué)反應(yīng)性和純度等均有所不同。據(jù)估計,能阻礙腎和細(xì)胞清除的最佳PEG相對分子質(zhì)量為4萬～6萬。PEG與蛋白質(zhì)偶合時有三種不同的方式:單個大分子量PEG修飾蛋白質(zhì)的單一位點;星形PEG(兩個或更多的中等分子量PEG通過交聯(lián)連接在一起)修飾蛋白質(zhì)的單一位點;幾個小分子量PEG修飾蛋白質(zhì)的多個位點。理論上,因為在受體結(jié)合域內(nèi)受體與PEG結(jié)合的機會減少,單一位點被PEG修飾的蛋白質(zhì)應(yīng)該有較高的活性。多位點的PEG修飾或大分子量PEG的應(yīng)用往往會導(dǎo)致蛋白質(zhì)部分或全部失去生物活性。2修復(fù)反應(yīng)2.1peg衍生物的修飾最常用的修飾反應(yīng)是親電活化的PEG修飾劑與賴氨酸的ε-氨基或蛋白質(zhì)N-末端的氨基反應(yīng),典型的PEG修飾劑和修飾反應(yīng)形成的連接鍵類型有:①羥基琥珀酰胺脂類(NHS酯,酰胺鍵);②環(huán)氧化類(烷基鍵);③羰基咪唑類(尿烷鍵);④硝基苯基碳酸酯類(尿烷鍵);⑤三氟乙基磺酸酯類(烷基鍵);⑥醛類(N-末端,schiff堿)。PEG修飾劑通過伯胺基團(tuán)與蛋白質(zhì)的反應(yīng),常常會形成不均一的偶合物。不均一主要是指蛋白質(zhì)分子中同一基團(tuán)被某一修飾劑修飾時,其化學(xué)反應(yīng)性不相同以及不同的基團(tuán)可以與同一種修飾劑發(fā)生同一性質(zhì)的反應(yīng)。為改進(jìn)修飾的不均一性,對蛋白質(zhì)表面的其它官能團(tuán)進(jìn)行修飾的方法也有大量的研究報道。這些官能團(tuán)主要包括游離的半胱氨酸、寡糖、羥基等。用作修飾特殊位點的PEG衍生物有①乙烯基磺酸(修飾游離的半胱氨酸);②碘乙酰胺(修飾游離的半胱氨酸);③馬來酰胺(修飾游離的半胱氨酸);④正吡啶二硫化物(修飾游離的半胱氨酸);⑤酰肼(修飾寡糖);⑥異氰酸酯(修飾羥基或氨基)。2.2修飾反應(yīng)條件影響PEG修飾過程的主要因素有:①蛋白質(zhì)濃度、蛋白質(zhì)與PEG修飾劑的摩爾比;②修飾反應(yīng)的pH值和離子強度;③修飾反應(yīng)溫度;④修飾反應(yīng)持續(xù)時間。通過正交實驗設(shè)計,得到適宜的修飾反應(yīng)條件。通過對一個或多個操作因素的控制,就可以得到所需的連有單個、兩個、三個或多個PEG的蛋白質(zhì)偶合物。2.3peg裝飾過程設(shè)計蛋白質(zhì)的PEG修飾反應(yīng)可以在固相和液相中進(jìn)行。2.3.1修飾蛋白的純化在典型的液相PEG修飾反應(yīng)中,蛋白質(zhì)與PEG的摩爾比一般為1∶3～5,反應(yīng)pH值維持在7～8之間,溫度保持在4～8℃,反應(yīng)持續(xù)8～16h,然后用冰醋酸調(diào)節(jié)pH值到4.5來終止反應(yīng)。反應(yīng)混合物用水稀釋后在陽離子交換柱上進(jìn)行吸附分離,將剩余的PEG和反應(yīng)副產(chǎn)物洗掉。修飾蛋白與未修飾蛋白可以通過提高緩沖液中鹽的濃度來分離。典型的純化方法如下所示。聚乙二醇修飾反應(yīng)→酸化→稀釋→陽離子交換→洗濾→過濾→干燥。2.3.2修飾蛋白的脫附在固相的PEG修飾反應(yīng)中,蛋白質(zhì)被吸附到離子交換柱上,在規(guī)定的時間內(nèi)PEG修飾劑不斷地循環(huán)流過柱子。反應(yīng)結(jié)束后,用緩沖液將過量的PEG和其它的副產(chǎn)物洗掉。當(dāng)未修飾蛋白仍被吸附在柱子上時,可以改變緩沖液中鹽的濃度將修飾蛋白脫附下來。分析洗脫液,確定蛋白質(zhì)的修飾度。柱子用相同量的未修飾蛋白再生,以便下次循環(huán)操作時,能夠保持相同蛋白質(zhì)濃度。同上所述,PEG再一次循環(huán)進(jìn)行修飾反應(yīng),然后再修飾蛋白脫附下來。在固相PEG修飾過程中,反應(yīng)、分離、提純能夠在同一根柱子上進(jìn)行,并且能重復(fù)多次。3表面活性劑的分析與性能3.1修飾蛋白的檢測類似與普通的蛋白質(zhì)濃度測定,紫外分光光度法、Lowry法、二寧可辛酸(BCA)法、Bradford法或其它一些更可靠和準(zhǔn)確的氨基酸組成分析方法等均可用于修飾蛋白的濃度測定。3.2sds-paeg分析按照Laemmli所敘述的方法,進(jìn)行SDS實驗,首先對凝膠進(jìn)行特異性染色,針對PEG的染色方法采用改進(jìn)的Kurfurst方法。SDS凝膠用蒸餾水淋洗后,浸泡在5%的氯化鋇溶液10min,再用蒸餾水將氯化鋇洗掉,浸泡在0.1mol·L-1TitrisolTM(碘溶液)10min,然后再用蒸餾水將TitrisolTM洗掉,將凝膠浸泡在蒸餾水中裝入經(jīng)過熱密封的Kapak/Scotchpak袋中避光保存。由于PEG分子的反常泳動性,以蛋白質(zhì)的標(biāo)記物作為對照時,SDS-PAEG分析得到分子量要比實際的分子量要高。為了避免這個問題,可以采用PEG作為標(biāo)記物同時進(jìn)行針對PEG的凝膠特異性染色。3.3peg修飾蛋白的表征質(zhì)譜是確定不同種類PEG修飾蛋白分子量的一種較為理想的方法。新近研究出的基質(zhì)輔助激光解析飛行時間質(zhì)譜方法(英文縮寫MALDITOFMS)不僅能夠研究PEG修飾蛋白的分子量,還能分辨出修飾蛋白的具體種類。3.4peg修飾可能出現(xiàn)的位置異構(gòu)體修飾位點和位置異構(gòu)體的檢測一般是各種技術(shù)綜合分析的。這些技術(shù)包括離子交換液相色譜、分子排阻色譜、肽圖、Edman序列、氨基酸分析及MALDTTOFMS。PEG修飾后的蛋白質(zhì)分子可能出現(xiàn)的位置異構(gòu)體可以用下列公式計算。對于有N個位點可被修飾的蛋白質(zhì),假定一次修飾K個位點,那么可能的位置異構(gòu)體數(shù)目等于N!/[(N-K)!×K!]。3.5peg修飾的制備制備蛋白質(zhì)的PEG修飾時,應(yīng)當(dāng)考慮以下幾點:①出發(fā)原料(蛋白質(zhì)和PEG修飾劑)的性質(zhì)要了解清楚;②PEG修飾后的蛋白質(zhì)是一種新型分子:它既不是蛋白質(zhì),也不是PEG,而是兩者的雜合物;③PEG修飾位點和化學(xué)計量關(guān)系應(yīng)該確定;④應(yīng)保持制備過程的批次一致性;⑤修飾劑和修飾蛋白的制備應(yīng)該通過認(rèn)證。4結(jié)合蛋白的生物學(xué)特性4.1peg偶合的蛋白質(zhì)1977年,Abuchowski等經(jīng)實驗證明,PEG修飾后的蛋白質(zhì)作為藥物比未修飾蛋白更有效,迄今為止,已有許多藥物蛋白被PEG修飾后在臨床應(yīng)用中顯示出優(yōu)良性質(zhì)。具體體現(xiàn)有:物理和熱穩(wěn)定性的增強,對酶降解敏感程度的降低,溶解度的增大,在體內(nèi)循環(huán)半衰期、清除時間的增長,免疫原性和抗原性的降低及毒性的減小等。另外,修飾的作用還表現(xiàn)在體內(nèi)活性提高而體外活性降低。該作用在集落刺激因子(GM-CSF)、白介素-2(IL-2)和白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子(TNF-α)、γ-干擾素(IFN-γ)及其它生物分子上也得到了體現(xiàn)。PEG修飾后的蛋白還具有下述優(yōu)點:①生物分配行為變化;②生物學(xué)性質(zhì)變化;③膜的滲透性提高。很小劑量就能取得持久臨床效應(yīng),從而提高了生命質(zhì)量,降低了治療成本。一般,PEG偶合的生物大分子,與未修飾的分子相比,呈現(xiàn)出不同的物理、化學(xué)性質(zhì)。這些改變的性質(zhì)包括構(gòu)象、空間位阻、靜電結(jié)合性質(zhì)、疏水性、賴氨酸的pK(可用來衡量可逆反應(yīng)的完成程度)和等電點。與受體連接的親和力經(jīng)常受到這些物理化學(xué)性質(zhì)變化的影響,因而以細(xì)胞為基礎(chǔ)的體外活性檢測測得值有所降低。藥物蛋白在體內(nèi)的生物活性與偶合的PEG量有著正比的關(guān)系。然而,體外的生物活性卻與偶合的PEG量呈反比,見圖1。蛋白質(zhì)被PEG修飾后延遲了它在腎臟中的清除,反過來又延長了它的循環(huán)半衰期。在以細(xì)胞為基礎(chǔ)的體外活性檢測時,由于培養(yǎng)時間是固定的,PEG修飾后的生物分子半衰期的提高并不能得到顯示。在相對較短的培養(yǎng)時間內(nèi),PEG修飾后的蛋白質(zhì)與受體間的親和力較低,導(dǎo)致活體外生物活性降低。由未修飾的蛋白質(zhì)、偶合了單個、二個、三個和更多PEG的蛋白質(zhì)組成的混合物復(fù)配使用可能會更好。理論上,修飾度越高,吸附速率越低(延長了循環(huán)持續(xù)時間),受體的飽和度越低。由于吸附速率的不同而導(dǎo)致的上述混合物呈現(xiàn)重迭生物活性見圖2。4.2peg修飾蛋白質(zhì)的藥動學(xué)性質(zhì)檢測將PEG修飾后的蛋白質(zhì)注射到動物體內(nèi)時,呈現(xiàn)出比未經(jīng)PEG修飾的蛋白質(zhì)更好的藥動學(xué)性質(zhì)。由于血清循環(huán)半衰期和血漿保留時間都比未修飾的蛋白質(zhì)高得多,因而生物活性保持時間更長。4.3免疫原性PEG修飾后的蛋白質(zhì)的免疫原性會有顯著地降低,當(dāng)修飾度超過一定值時,免疫原性會消失。4.4修飾蛋白的穩(wěn)定性PEG修飾后蛋白質(zhì)的毒性一般都比未修飾后的蛋白質(zhì)的毒性低。但是使用低分子量的PE