手性藥物的生物合成技術(shù)研究

手性藥物的生物合成手性分離技術(shù)手性分離和分析的重要性★

獲取單一對(duì)映體化合物

★對(duì)于涉及分子手性分析的領(lǐng)域要采用高對(duì)映體選擇性的分析方法手性分離的特殊性

在非手性環(huán)境中，對(duì)映體的物理化學(xué)性質(zhì)（如熔點(diǎn)、沸點(diǎn)、折射率、蒸氣壓、溶解度、紅外、核磁譜和質(zhì)譜等）大都相同，這就造成對(duì)映體分離的困難。1獲得單一對(duì)映體的途徑手性源(chiralpool)合成前手性底物不對(duì)稱合成外消旋體拆分防止“外消旋化”“立體選擇性”反應(yīng)，如手性催化、手性誘導(dǎo)、生物催化結(jié)晶法衍生法酶法色譜法

●天然手性庫：從自然界存在的光活性化合物提取得到，如氨基酸、羥基酸、糖、生物堿和萜類等為原料，采用保持原構(gòu)型、轉(zhuǎn)化或手性轉(zhuǎn)換等方法合成手性化合物

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不對(duì)稱合成：采用手性輔助基、手性配體、手性催化劑對(duì)前手性底物進(jìn)行選擇性反應(yīng)

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外消旋體拆分：常規(guī)合成方法得到外消旋體產(chǎn)物，如何將它們進(jìn)一步分離2

外消旋體拆分方法

等量對(duì)映體的混合物，其旋光性相互抵消，沒有旋光能力，稱為外消旋體。將外消旋體分為對(duì)映體的過程，叫做對(duì)映體拆分（resolution）。廣義地講，對(duì)不等量對(duì)映體混合物進(jìn)行分離，也屬于對(duì)映體拆分的范疇。2.1結(jié)晶拆分法

▲Pasteur分離酒石酸對(duì)映體1849年，Pasteur首次分離酒石酸對(duì)映體，就是利用外消旋的酒石酸銨鈉在27℃以下結(jié)晶時(shí)，形成的晶體是“外消旋混合物”，兩個(gè)對(duì)映體的半面晶外觀不一樣。Pasteur借助放大鏡，用鑷子將兩種酒石酸銨鈉晶體分開。這就是歷史上有名的第一個(gè)對(duì)映體拆分實(shí)驗(yàn)。

圖3酒石酸銨鈉晶體外型這一方法雖然古老，但在一些特定的場(chǎng)合還有用處，如“手性金屬配合物”。接種晶體拆分法

在一個(gè)外消旋混合物的熱飽和溶液中加入其中的一個(gè)純對(duì)映體的晶種，然后冷卻，則同種的對(duì)映體將附在晶體上析出；濾去晶體后，母液重新加熱，并補(bǔ)加外消旋體使之達(dá)到飽和，冷卻使另一對(duì)映體析出。這樣交替進(jìn)行，可方便地獲得大量純對(duì)映體結(jié)晶。在沒有純對(duì)映體晶種的情況下，有時(shí)用結(jié)構(gòu)相似的其它手性化合物（有時(shí)甚至非手性化合物）作晶種，也能獲得成功。（為什么？）晶體形成時(shí)的有規(guī)律的定向排列，可能自然形成一手性環(huán)境。D,L氯霉素的母體氨基醇的結(jié)晶拆分示意圖

D,L-氨基醇水溶液D-氨基醇，80℃冷至20℃D-氨基醇晶體母液80℃濃縮冷至20℃L-氨基醇晶體母液2.2生物拆分法

生物酶、微生物、細(xì)菌等生物源具有非常專一的反應(yīng)特性。利用酶可以選擇性地使外消旋體中的一個(gè)對(duì)映體發(fā)生反應(yīng)，如降解，從而達(dá)到拆分的目的。因此，這一方法也稱為“生物化學(xué)拆分法”。1858年，Pasteur就觀察到：外消旋酒石酸在酵母或青霉的存在下進(jìn)行發(fā)酵，天然的（+）-酒石酸銨逐漸被消耗，而經(jīng)過一段時(shí)間之后，從發(fā)酵液中分離出純的（-）-酒石酸銨。這是微生物代謝了天然的（+）-酒石酸，而留下了（-）-酒石酸。圖5D,L－苯基甘氨酸外消旋體的酶拆分

生物拆分特點(diǎn)：立體專一性強(qiáng)、拆分效率高和生產(chǎn)條件溫和。目前，酶法拆分已從水溶液向有機(jī)介質(zhì)發(fā)展。D,L-苯基甘氨酸(PG)(CH3C)2-OOD,L-乙酰PGL-氨肽酶L-PGD-乙酰PG水解/H+D-PGD,L-PGH2SO4/加熱(外消旋化)

用微生物酶拆分外消旋體，比化學(xué)拆分法具有明顯的優(yōu)越性：（1）酶催化反應(yīng)通常具有高度立體專一性；（2）副反應(yīng)少，產(chǎn)率高，產(chǎn)品分離提純簡(jiǎn)單；（3）反應(yīng)條件較溫和，如0~50℃，pH接近中性；（4）酶無毒，易降解，不會(huì)造成環(huán)境污染，適于規(guī)模生產(chǎn)。用酶拆分外消旋體氨基酸特別重要。因?yàn)槎鄶?shù)合成氨基酸消旋體不易用化學(xué)方法拆分，而酶法拆分卻非常有效，可用于制備旋光性氨基酸。2.3化學(xué)拆分法

化學(xué)分離的原理：利用合適的分離性質(zhì)差異來進(jìn)行分離。

常見的化學(xué)分離方法：●沉淀與結(jié)晶：溶解度●蒸餾：蒸氣壓●萃?。悍峙湎禂?shù)●色譜：分配系數(shù)這些化學(xué)分離方法可用于對(duì)映體的拆分嗎？化學(xué)拆分法原理

如果外消旋體的分子含有某些活性基團(tuán)，如羧基、氨基、羥基和雙鍵等，可讓其與某種旋光活性的化合物（稱為拆分劑）進(jìn)行反應(yīng)，生成兩種非對(duì)映體。利用非對(duì)映體在分離性質(zhì)上的差別可將其分開。換句話說，化學(xué)拆分的原理是將具有相同性質(zhì)的對(duì)映體轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂胁煌再|(zhì)的非對(duì)映體來進(jìn)行分離。拆分過程一般包括如下三個(gè)步驟：

(+)-酸(-)-酸+(-)-堿(+)-酸·(-)-堿(-)-酸·(-)-堿(+)-酸·(-)-堿(-)-酸·(-)-堿(-)-堿(-)-酸手性試劑衍生分離非對(duì)映體分解或還原單個(gè)對(duì)映體

化學(xué)拆分的關(guān)鍵是選擇合適的拆分劑和拆分溶劑◆拆分劑（1）容易與外消旋體中的兩個(gè)對(duì)映體結(jié)合生成非對(duì)映異構(gòu)體。拆分后，又容易再生出原來的對(duì)映體。如酸堿反應(yīng)。（2）所形成的非對(duì)映異構(gòu)體溶解度有較大的差別，其中之一容易結(jié)晶。（3）拆分劑應(yīng)達(dá)到旋光純。從原理上，拆分后對(duì)映體純度不會(huì)超過拆分劑純度。假定拆分劑(-)-B堿的旋光純度為90%（即含有10%的(+)-B），被用來拆分(±)-A酸，那么所形成的鹽中將有10%的含量。(+)-A酸·(-)-B堿(-)-A酸·(+)-B堿(-)-A酸·(-)-B堿(+)-A酸·(+)-B堿和10%新對(duì)映體（4）拆分劑應(yīng)廉價(jià)易得，或可方便回收

一些常見的手性拆分劑：

堿性拆分劑：（-）-馬錢子堿、（-）-番木鱉堿、D-（-）-麻黃堿等；

“管制藥品！”

酸性拆分劑：（+）-酒石酸、（+）-樟腦酸、（+）-樟腦酸-10-磺酸、L-（+）-谷氨酸等。

醇類化合物可以用異腈酸酯轉(zhuǎn)變?yōu)榉菍?duì)映異構(gòu)的氨基甲酸酯，也可以用手性酰氯（或酸酐）轉(zhuǎn)變成酯拆分。

醛、酮?jiǎng)t常用氨或胺的衍生物轉(zhuǎn)變?yōu)殡辍⒖s氨脲、肼亞胺等非對(duì)映體拆分。DutchResolution（家族拆分劑法）

99年9月在英國(guó)劍橋召開的國(guó)際手性學(xué)術(shù)會(huì)議上，VriesT發(fā)展了一種稱為“DutchResolution”的新的非對(duì)映體結(jié)晶方法，大大地?cái)U(kuò)展了化學(xué)拆分方法實(shí)際應(yīng)用。這是一種組合拆分方式，即采用一組類似的拆分劑家族(familiesofresolvingagents)，同時(shí)加入到一待拆分的外消旋體樣品溶液中。經(jīng)過沉淀過程，這時(shí)析出的非對(duì)映體晶體比使用單一拆分劑大得多，甚至其中的一部分拆分劑可采用消旋化合物。

參見VriesTet.al.,Angew.Chem.Int.Ed.1998,37:23492.4色譜拆分法

如何獲得高對(duì)映體純的手性物質(zhì)在許多領(lǐng)域都是很重要的。色譜法不僅是對(duì)映體分析和純度測(cè)定的有力工具，而且液相色譜拆分法還是制備和純化的重要手段。歷史上，曾采用一些天然手性吸附劑，如淀粉、蔗糖、羊毛等成功拆分一些外消旋體?，F(xiàn)代制備色譜在拆分外消旋體方面更是發(fā)揮更大的作用。如選用拆分能力很強(qiáng)的手性固定相填充劑，用大柱子，一次已能拆分幾十克量的外消旋體，并達(dá)到99%的旋光純度。

3、高效手性分離技術(shù)

色譜法和電泳法是一類高效分離方法，但常規(guī)的色譜/電泳方法仍不能直接分離對(duì)映體。（為什么？）

因?yàn)樵诜鞘中原h(huán)境中，對(duì)映體的分離性質(zhì)（如沸點(diǎn)、蒸氣壓、溶解度、分配系數(shù)、吸附特性以及淌度）完全相同。

如何運(yùn)用高效色譜和毛細(xì)管電泳分離分析對(duì)映體化合物？——熱力學(xué)/分離性質(zhì)上的差異3.1

手性分離基本策略

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手性消除采用手性試劑衍生對(duì)映體，使之轉(zhuǎn)化為非對(duì)映體，利用非對(duì)映體間的性質(zhì)差異采用常規(guī)分離方法分離。

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構(gòu)建手性分離環(huán)境將手性分離介質(zhì)引入分離器中構(gòu)建手性分離環(huán)境，使得原本沒有分離性質(zhì)差異的對(duì)映體產(chǎn)生分離差異。

這些策略也是其他分析技術(shù)如波譜法研究手性識(shí)別的思路。

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結(jié)合高效分離技術(shù)3.2

手性分離原理1）

手性試劑衍生法手性消除采用柱前衍生技術(shù)，即用光學(xué)純的手性試劑，將對(duì)映體衍生成非對(duì)映體復(fù)合物，這些非對(duì)映體復(fù)合物具有不同的理化性質(zhì)，便能使用常規(guī)的色譜技術(shù)分離。其優(yōu)點(diǎn)是可將手性消除和檢測(cè)衍生反應(yīng)結(jié)合起來。除了滿足一般的色譜衍生要求的條件外，還要注意：所用的衍生劑應(yīng)盡可能達(dá)到對(duì)映體純；衍生劑不能選擇性地與兩種基質(zhì)對(duì)映體反應(yīng)；生成分離性大的穩(wěn)定的非對(duì)映體。

衍生后兩種非對(duì)映體的檢測(cè)器響應(yīng)可能不同，不宜按歸一化計(jì)算對(duì)映體純度。

手性試劑衍生位置應(yīng)靠近對(duì)映體樣品的手性中心，以求獲得最大的分離效果。過大的衍生試劑可能會(huì)縮小樣品理化性質(zhì)的差異，造成分離困難。作制備用的手性衍生劑要求它的衍生化和去衍生化反應(yīng)都容易進(jìn)行，且總收率要高，生成的非對(duì)映體具有更大的分離性（有利于提高制備量）。2)

手性色譜

手性色譜的原理是通過待拆分對(duì)映體與手性固定相之間的瞬間可逆相互作用，根據(jù)形成瞬間締合物的難易程度和穩(wěn)定程度，經(jīng)過多次質(zhì)量交換后，達(dá)到對(duì)映體間的分離。

近年來，高效手性分離技術(shù)的發(fā)展，導(dǎo)致與有機(jī)立體化學(xué)相關(guān)的手性藥物學(xué)、分子生物學(xué)、材料化學(xué)、地球化學(xué)、天然有機(jī)化學(xué)等前沿領(lǐng)域取得許多突破性的發(fā)現(xiàn)和發(fā)展。衍生法：非對(duì)映體的形成是“固定的、永久的”如果設(shè)法把手性試劑引入固定相，外消旋體樣品流過柱子是否會(huì)形成非對(duì)映體？

與手性衍生法色譜分析不同，對(duì)映體組成的測(cè)定精度與手性固定相所用的對(duì)映體純度無關(guān)（固定相的對(duì)映體純度只影響拆分因子α的大小）。手性色譜可以通過兩種方式進(jìn)行：手性固定相法手性添加劑法手性拆分原理包括主-客體作用、絡(luò)合作用、配體交換、相分離、離子交換等。核心是分子手性識(shí)別作用，即對(duì)映體與固定相（或添加劑）間的相互作用涉及到分子立體選擇性。三點(diǎn)作用模型

相互作用強(qiáng)，保留長(zhǎng)，后出峰相互作用弱，保留短，先出峰基體(S)-選擇子(R)-溶質(zhì)②③①基體(S)-溶質(zhì)(S)-選擇子①②

手性固定相具有很強(qiáng)的特征性，一個(gè)固定相往往只能拆分一類或幾類對(duì)映體。手性色譜的另一個(gè)特點(diǎn)是將Pirkle型手性固定相的手性變成相反構(gòu)型，可使對(duì)映體洗脫順序顛倒過來。研制新的手性固定相，解決不同類型手性化合物的分離是手性色譜發(fā)展的前沿領(lǐng)域。過去100年：拆分約7000種手性化合物手性色譜：已拆分近萬種手性化合物液相色譜中的手性固定相已研制100多種手性添加劑法

在液相色譜流動(dòng)相或毛細(xì)管電泳的緩沖溶液中加入手性添加劑（CA），CA與對(duì)映體溶質(zhì)通過靜電引力和氫鍵等非共價(jià)鍵結(jié)合方式，形成可逆的不同穩(wěn)定性的非對(duì)映體配合物，在非手性分離器中實(shí)現(xiàn)對(duì)映異構(gòu)體的分離。手性添加劑是一種直接拆分法，其優(yōu)點(diǎn)在于不需要化學(xué)衍生，也不需要特殊的手性固定相。CA必須能提供有效的基團(tuán)和位置以便與溶質(zhì)對(duì)映體形成非對(duì)映的配合物，也必須具有合適的結(jié)構(gòu)以改善分離性能和提高其立體選擇性。常見的CA可分為手性對(duì)離子添加劑、手性配位添加劑和環(huán)糊精添加劑。TLC分離芳香醇胺對(duì)映體

用D-10-樟腦磺酸銨作為手性離子對(duì)試劑添加到流動(dòng)相中，在普通的GF254薄層硅膠板(2.5×10cm)2~4℃展開，拆分拉貝樂爾(Labarol)和倍他樂克(Batarock)兩種芳香醇胺藥物對(duì)映體。LabarolCH2Cl2-CH3OH(67:33)，含D-樟腦磺酸銨6.8mmol/LBatarockCH2Cl2-CH3OH(60:40)，含D-樟腦磺酸銨6.8mmol/L（李高蘭等，色譜，1999，17：216）a.Labarolb.BatarockHPLC拆分氧氟沙星

國(guó)內(nèi)使用外消旋的OFLOXCIN,而日本已開發(fā)左旋氧氟沙星（LEVOFLOXCIN）,商品名Cravit。6mmol/Ll-phen+CuSO4+15%CH3OH(pH3.5)，Shim-ParkPREPODS(20mm×25cm),4.6mL/min,293nm,0.5ml15g/L(±)-OFLS-(-)-OFLR-(+)-OFL若改用d-phen,出峰順序可能發(fā)生逆轉(zhuǎn)！環(huán)糊精結(jié)構(gòu)OHOHHO甲基化3.3

手性色譜技術(shù)★氣相色譜★高效液相色譜★毛細(xì)管電泳★超臨界色譜3.3.1氣相色譜

GC具有快速、靈敏、簡(jiǎn)便和定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。手性GC特別適合于不對(duì)稱合成的樣品分析。因?yàn)榉治鰳悠芬话銦o需衍生，反應(yīng)產(chǎn)物可直接進(jìn)樣分析，用量極微（10-8g），特別適合于跟蹤不對(duì)稱反應(yīng)的全過程。對(duì)于那些對(duì)映體純度>95%的產(chǎn)物，一般要用GC或HPLC代替旋光測(cè)定。

氣相色譜手性固定相主要分為：●

氫鍵型手性固定相：如某些氨基酸衍生物固定相，主要用于分離氨基酸、羧酸、醇、胺、內(nèi)酯、內(nèi)酰胺等對(duì)映體化合物，氫鍵作用是對(duì)映體分離的主要作用力●

形成包合物的手性固定相：環(huán)糊精衍生物手性固定相用于分離稠環(huán)烷烴、沒有取代的烯烴、鹵代烴、醇、醛、酮、胺、氰類、環(huán)氧化合物、羧酸、鹵代酸、羥基酸、內(nèi)酯和氨基酸等化合物的對(duì)映體。●

金屬配體交換手性固定相：一些金屬離子(Eu、Rh、Ni、Mn、Cu等)與手性試劑(如樟腦酸衍生物，水楊酸與手性胺形成的西佛堿等)所形成的配位化合物。將這類固定相與某些色譜固定液（如鯊魚烷）混合，涂到毛