廣西野生大豆種質(zhì)資源ssr遺傳多樣性分析

廣西野生大豆種質(zhì)資源ssr遺傳多樣性分析

野生大豆是培育大豆的近緣種植的祖先，是大豆的自然基因庫。經(jīng)過長期的自然選擇，它形成了豐富的變異類型，具有抗病、抗旱、抗寒、耐鹽、抗不育、汞柱多、葉厚等有利基因。這是中國乃至世界上最寶貴的植物遺傳資源。若在種內(nèi)雜交的同時,廣泛利用野生大豆進行基因交換,即可擴大并豐富栽培大豆種質(zhì)資源。因此,對野生大豆資源進行遺傳多樣性研究,不僅對保護中國珍貴的野生大豆基因資源具有重要意義,同時對利用野生大豆材料的優(yōu)異基因改良栽培大豆也具有重大意義。許東河等選用來自全國各地的200余份一年生野生大豆材料,從形態(tài)、性狀、等位酶標(biāo)記和細胞DNARFLP標(biāo)記的遺傳豐富度和遺傳離散度2方面分析中國野生大豆群體的遺傳多樣性,結(jié)果表明:中國野生大豆天然群體存在遺傳分化,各地理生態(tài)群體間的遺傳多樣性水平不同,南方群體最高,黃淮海群體次之,東北群體最低,南方為一年生野生大豆的遺傳多樣性中心,也可能是起源中心。董英山等采用群體遺傳學(xué)方法分析了6172份中國野生大豆資源的數(shù)量、遺傳多樣性指數(shù)(Shannon指數(shù))、12個性狀的綜合變異系數(shù)及其地理分布,結(jié)果表明:42°N~47°N×122°E~127°E的東北中南部野生大豆資源分布極廣、遺傳多樣性豐富、綜合變異系數(shù)高;34°N~35°N×113°E~115°E、38°N~39°N×113°E~115°E和34°N~35°N×107°E~109°E的黃河中下游和秦嶺山區(qū)野生大豆次之;26°N~27°N×119°E~121°E的東南沿海地區(qū)野生大豆遺傳多樣性、綜合變異系數(shù)均很高,但分布較少。趙洪琨等采用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)對我國不同緯度的20份野生大豆(Glycinesoja)和栽培大豆(G.max)進行多樣性分析,結(jié)果表明:(1)我國野生大豆的遺傳多樣性較栽培大豆更為豐富;(2)根據(jù)AFLP分析結(jié)果,將野生大豆和栽培大豆完全劃分為2類,并發(fā)現(xiàn)野生大豆和栽培大豆的種特異譜帶,說明野生大豆和栽培大豆作為2個種是有遺傳基礎(chǔ)的;(3)野生大豆和栽培大豆不同緯度品種間緯度相近的首先聚在一起,表明不同進化類型的大豆遺傳距離與緯度可能存在一定的相關(guān)性。趙洪琨等采用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對我國不同緯度的野生大豆和栽培大豆(各22份)進行多樣性分析,野生大豆和栽培大豆的平均遺傳距離分別為0.176、0.150,表明野生大豆的多態(tài)性比栽培大豆較為豐富;在遺傳距離0.300處,野生大豆和栽培大豆被明顯分為2類,與以往大豆屬Soja亞屬的形態(tài)學(xué)分類結(jié)果相一致,為野生大豆和栽培大豆分為2個種提供了分子水平上的證據(jù)。周曉馥等利用RAPD和SSR技術(shù)對25°N野生大豆種群16個樣本進行分子標(biāo)記,通過聚類分析將這16個樣本分成5類,表明種群內(nèi)存在大量的遺傳變異,為研究野生大豆種群內(nèi)及種群間的遺傳多樣性探索了有效方法,并提出野生大豆核心種質(zhì)資源的保存及取樣對策。近年來,SSR技術(shù)應(yīng)用較多,在研究中效果很好,而且大豆的SSR技術(shù)也很成熟。但應(yīng)用分子標(biāo)記對廣西野生大豆進行遺傳多樣性的研究還是個空白,本研究擬利用SSR標(biāo)記從分子水平上對廣西1980—1981年收集的野生大豆資源進行遺傳多樣性分析,根據(jù)分子標(biāo)記結(jié)果對野生大豆進行聚類分析,建立這些材料間的遺傳關(guān)系圖,對今后野生大豆的種質(zhì)保存、收集和創(chuàng)新利用等具有十分重要的意義,且為研究廣西栽培大豆起源、進化、分類、遺傳,挖掘野生大豆優(yōu)良基因奠定理論基礎(chǔ)。1材料和方法1.1野生大豆資源本研究選取1980—1981年在廣西桂林市全州、興安、灌陽、恭城、荔浦、靈川等6個縣的23個鄉(xiāng)鎮(zhèn)收集的68份野生大豆資源(表1),于2009年3月種植野生大豆,待長出三出復(fù)葉時取嫩葉片,-80℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?.2測試方法1.2.1組織研磨棒研磨取2g左右新鮮葉片放入研缽中,加入PVP和液氮,用組織研磨棒研磨,直至葉片成粉末狀。葉片DNA提取方法參考周恩君的SDS法,在一些具體操作上略有改進。1.2.2核心引物篩選謝華等利用中國秋大豆資源篩選出一套適用于大豆種質(zhì)資源遺傳多樣性研究的SSR核心引物。為更好地揭示野生大豆的遺傳多樣性,本研究利用10份1980—1981年收集的和12份新收集的廣西野生大豆材料對這套核心引物進行篩選,共篩選出23對擴增條帶清晰、等位變異較為豐富、適用于廣西野生大豆資源遺傳多樣性研究的SSR引物。SSR引物序列來自美國農(nóng)業(yè)部大豆基因組數(shù)據(jù)庫(4/SSR.html),SSR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。1.2.3pcr擴增dntpsPCR反應(yīng)在Bio-rad公司的擴增儀上進行,反應(yīng)體系為15.0μL,其中10×PCR反應(yīng)緩沖液1.36μL、2.0mmol/LMgCl20.8μL、10mmol/LdNTPs0.24μL、5UTaqDNA聚合酶0.1μL、0.2μmol/LSSR引物3.0μL、DNA模板50~100ng,最后加ddH2O至15.0μL。PCR反應(yīng)程序為:95℃預(yù)變性5min;94℃變性30s,55℃退火30s,72℃延伸30s,30個循環(huán);72℃延伸5min,10℃保溫。擴增產(chǎn)物在8%聚丙烯酰胺非變性凝膠上電泳分離2h(恒定功率40W),銀染檢測。1.2.4群體平均遺傳多樣性指數(shù)所有材料的SSR位點不同等位變異在銀染過的聚丙烯酰胺凝膠上都表現(xiàn)為譜帶的“有”和“無”,將“有”賦值為“1”,“無”賦值為“0”,建立材料SSR標(biāo)記的0、1矩陣,然后計算各對SSR引物的Shannon遺傳多樣性指數(shù)和Simpson遺傳多樣性指數(shù)。Shannon遺傳多樣性指數(shù)Hi=-∑Pij·lbPij;Simpson指數(shù)=1-∑Pij;群體平均遺傳多樣性指數(shù)則為H=∑Hi/n,其中Pij為i位點第j個等位變異的頻率,n為調(diào)查位點數(shù)。利用NTSYS2.10軟件計算材料間的Nei’s標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離(D),以非加權(quán)類平均法(UPGMA)進行聚類分析,建立樹狀聚類圖。2結(jié)果與分析2.1ssr引物多態(tài)性信息提取數(shù)據(jù)的模擬由表2可見,23對SSR引物都表現(xiàn)為多態(tài)性,在68份野生大豆資源中共檢測到157個等位基因變異,平均每個位點6.83個;等位變異數(shù)目范圍為4~11個,其中satt226(位于D2連鎖群)和satt146(位于F連鎖群)最少(4個),satt462(位于L連鎖群)的最多(11個),說明satt462變異豐富;等位變異數(shù)介于6~11個的引物有18對,5個及以下的有5對,不同位點等位變異數(shù)不等。在遺傳多樣性研究中,常用Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)來衡量群體遺傳多樣性大小。根據(jù)SSR標(biāo)記結(jié)果計算各對引物Simpson遺傳多樣性指數(shù)和Shannon遺傳多樣性指數(shù),不同的SSR引物多態(tài)性信息量存在一定的差異,Simpson指數(shù)分布范圍為0.539~0.835,平均為0.703,其中satt226(位于D2連鎖群)的最低(0.539),satt243(位于O連鎖群)的最高(0.835);Shannon指數(shù)分布范圍為0.624~0.941,平均為0.714,其中satt226(位于D2連鎖群)的最低(0.624),satt243(位于O連鎖群)的最高(0.835)。從表2可見,satt243的Simpson指數(shù)與Shannon指數(shù)均最高,它的等位變異數(shù)為10個;而satt226的Simpson指數(shù)與Shannon指數(shù)最低,它的等位變異數(shù)為4個。這3個評價遺傳多樣性水平的指標(biāo)具有很大程度的一致性,也就是說當(dāng)某一引物的等位變異數(shù)較多時,其Simpson指數(shù)與Shannon指數(shù)也較高。如satt243、satt462、satt577和satt197引物的等位變異數(shù)也較多,Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)也較大;satt226、satt146、satt345和satt259引物的等位變異數(shù)也較少,Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)也較小。2.2野生大豆材料被聚同圖1可見,聚類分析把68份材料分為兩大類,可以有效地將各地區(qū)野生大豆區(qū)分開,3份收集于興安縣的無泥膜野生大豆被聚為一類;其他來自全州、興安、灌陽、恭城、荔浦、靈川等6縣的65份有泥膜野生大豆材料被聚為第二類,第二類在相似性系數(shù)為0.77處又聚為3個亞類。從聚類結(jié)果也可以看出,68份野生大豆在分子水平發(fā)生了一定的遺傳分化,聚類結(jié)果與野生大豆材料生長的地理環(huán)境、表型性狀等具有一定的相關(guān)性,同一區(qū)域內(nèi)收集到的野生大豆也表現(xiàn)出遺傳分化。3半野生大豆表型性狀的穩(wěn)定性本研究利用23對SSR引物對廣西1980—1981年收集的68份野生大豆資源進行遺傳多樣性分析,23個SSR位點共擴增出157條多態(tài)性帶,等位變異數(shù)目范圍為4~11,平均為6.83個;Simpson指數(shù)分布范圍為0.539~0.835,平均為0.703;Shannon指數(shù)分布范圍為0.624~0.941,平均為0.714。根據(jù)分子標(biāo)記結(jié)果對野生大豆進行聚類,68份材料分為兩大類,可以有效地將有泥膜野生大豆與無泥膜野生大豆材料區(qū)分開,其中3份無泥膜野生大豆被聚為一類,其他65份有泥膜野生大豆材料被聚為第二類。結(jié)果表明,野生大豆材料地區(qū)內(nèi)存在著明顯的遺傳分化,野生大豆的遺傳多樣性與地理來源、野生大豆的表型性狀具有一定相關(guān)性。海林等利用12對SSR引物對67份半野生大豆種質(zhì)進行了遺傳多樣性分析,共檢測到184個等位基因變異,平均每個位點等位基因數(shù)目為15.41個。王果利用33對SSR引物分析河南省268份野生大豆材料,共檢測到443個等位變異,每個SSR位點的等位變異范圍為6~22個,平均為13.4個,SSR引物Simpson指數(shù)為0.7196;Shannon指數(shù)的平均值為1.7741。王果等利用30對SSR引物分析了49份山西太原野生大豆材料,共檢測到208個等位變異,每個SSR位點的等位變異范圍為4~11個,平均為7個;引物的Shannon指數(shù)的分布范圍為0.7451~2.1081,平均為1.5030;位點多態(tài)信息量(PIC)值的分布范圍為0.3813~0.8575,平均為0.7007。嚴(yán)茂粉等使用40對SSR引物分析北京地區(qū)野生大豆天然種群的遺傳結(jié)構(gòu)與遺傳多樣性,10個種群共檢測到526個等位變異,平均每對引物等位基因數(shù)為13.15個,種群平均Shannon指數(shù)為0.658。王丹等利用27對SSR引物對冀東沿海地區(qū)的370份及黑龍江省的2份野生大豆進行遺傳多樣性分析,27個SSR位點擴增出209條多態(tài)性帶,平均每個位點等位基因數(shù)目為7.74個,SSR位點Simpson指數(shù)為0.3998~0.8358,Shannon指數(shù)為0.7567~1.9879。本研究的68份材料雖然表現(xiàn)出較高的遺傳多樣性,Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)分布范圍雖比嚴(yán)茂粉等的結(jié)果略高,但遺傳變異相