毛細(xì)管電泳法測(cè)定梔子金花丸中黃芩苷的含量

毛細(xì)管電泳法測(cè)定梔子金花丸中黃芩苷的含量【摘要】目的建立梔子金花丸中黃芩苷的含量測(cè)定方法。方法采用未涂層彈性融硅石英毛細(xì)管柱(60cm×75μm，有效長(zhǎng)度52cm)，以40mmol·L-1硼砂溶液()為運(yùn)行緩沖液;分離電壓為12kV;重力進(jìn)樣10s(高度15cm);檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm;以對(duì)硝基苯甲酸為內(nèi)標(biāo)。結(jié)果黃芩苷質(zhì)量濃度在～μg·mL-1范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系(r=6)，黃芩苷平均回收率為%，RSD值為%(n=6)。結(jié)論該方法專屬性強(qiáng)，結(jié)果準(zhǔn)確可靠、重現(xiàn)性好，可用于梔子金花丸的質(zhì)量控制。

【關(guān)鍵詞】毛細(xì)管電泳法;梔子金花丸;黃芩苷

Abstract:ObjectiveToestablishthemethodforthedeterminationofbaicalininZhizijinhuapillsbycapillaryelectrophoresis.MethodsTheseparationwasperformedinanuncoatedfusedsilicacapillaryof60cm×75μmID(52cmeffectivelength).Therunningbufferwes40mmol·L-1Na2B4O7buffersolution().Thevoltageappliedwas12kV.Thesamplewasinjectedbygravity(10s，15cm).Thedetectionwavelengthwas280nm,andtheinternalstandardwaspnitrobenzoicacid.ResultsThelinearrangeofbaicalinwasμg·mL-1(r=6).Theaveragerecoveryforbaicalinwas%(RSD=%,n=6).ConclusionThemethodprovedtobeexclusive,convenient,rapidandwellrepeatable，andcanbeusedforquantitativedeterminationofZhizijinhuapills.

Keywords:capillaryelectrophoresis;Zhizijinhuapills;baicalin

梔子金花丸是由梔子、黃芩、黃連、黃柏等8味藥材制成的中藥成方制劑，具有清熱瀉火、涼血解毒之功效。用于肺胃熱盛，口舌生瘡，牙齦腫痛，目赤眩暈，咽喉腫痛，吐血衄血，大便秘結(jié)等的治療。梔子金花丸的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)采用HPLC法測(cè)定制劑中梔子苷的含量，亦有其他文獻(xiàn)報(bào)道采用HPLC法測(cè)定其中黃芩苷、梔子苷、綠原酸等成分的含量[2～6]，但采用毛細(xì)管電泳法對(duì)梔子金花丸進(jìn)行質(zhì)量控制的方法尚未見(jiàn)報(bào)道。本文采用毛細(xì)管電泳法測(cè)定梔子金花丸中黃芩苷的含量，為更好地控制梔子金花丸質(zhì)量提供了依據(jù)。

1儀器與試藥

儀器

CL1030型高效毛細(xì)管電泳儀(北京彩陸科學(xué)儀器有限公司)，KNAUERK2501紫外-可見(jiàn)檢測(cè)器(德國(guó))，HW2000色譜站版(南京千譜有限公司)。ORIONMODEL828型pH計(jì)(美國(guó))。DL360超聲波清洗器[寧波石浦海天電子儀器廠，頻率(±)kHZ，功率240W]。未涂層彈性融硅石英毛細(xì)管柱(河北銳年永灃色譜器件有限公司)。

試藥

黃芩苷(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110715-200815)。梔子金花丸(山東孔圣堂制藥有限公司，批號(hào)090457、090546、090741，規(guī)格9g·袋-1)。甲醇為色譜純;硼砂、對(duì)硝基苯甲酸、NaOH均為分析純;水為雙蒸水。

2方法與結(jié)果

溶液的制備

內(nèi)標(biāo)溶液的制備精密稱取對(duì)硝基苯甲酸適量，加水制成100μg·mL-1的內(nèi)標(biāo)貯備液。

對(duì)照品貯備液的制備精密稱取在60℃減壓干燥4h的黃芩苷對(duì)照品15mg，置100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備液(黃芩苷質(zhì)量濃度為150μg·mL-1)。

供試品溶液的制備取梔子金花丸樣品，研碎，取約1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%(體積分?jǐn)?shù))甲醇50mL，稱定重量，超聲處理40min，放冷，再稱定重量，用70%(體積分?jǐn)?shù))甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液10mL至蒸發(fā)皿中，水浴揮干，再用70%(體積分?jǐn)?shù))甲醇溶解轉(zhuǎn)移至10mL量瓶中，加入內(nèi)標(biāo)溶液mL，用70%(體積分?jǐn)?shù))甲醇稀釋至刻度，搖勻，μm微孔濾膜濾過(guò)，作為供試品溶液。

陰性對(duì)照液的制備取處方組成中除黃芩外的其余藥材，制成不含黃芩的陰性對(duì)照品，按“”項(xiàng)下方法處理，即得。

運(yùn)行緩沖液的制備精密稱取硼砂適量，加水制成40mmol·L-1硼砂溶液(pH=)，μm微孔濾膜濾過(guò)，作為運(yùn)行緩沖液。

電泳條件

采用未涂層彈性融硅石英毛細(xì)管柱(60cm×75μm，有效長(zhǎng)度52cm);以40mmol·L-1硼砂溶液()為運(yùn)行緩沖液;分離電壓為12kV;重力進(jìn)樣10s(高度15cm);檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm;溫度為室溫，濕度小于70%。毛細(xì)管柱在使用前依次用mol·L-1NaOH溶液和水沖洗15～20min，再用運(yùn)行緩沖液沖洗約5min。以對(duì)硝基苯甲酸為內(nèi)標(biāo)。在此條件下進(jìn)行測(cè)定，對(duì)照品、供試品、陰性對(duì)照溶液色譜見(jiàn)圖1。

方考察

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備分別吸取對(duì)照品貯備液適量，加甲醇稀釋成黃芩苷質(zhì)量濃度為、、、、、、μg·mL-1，內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度為μg·mL-1的溶液。依次重力進(jìn)樣10s，每個(gè)濃度測(cè)定3次以上。以對(duì)照品與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)(Y)，黃芩苷質(zhì)量濃度(ρ)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=ρ-，r=6。表明黃芩苷在～μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)取質(zhì)量濃度為g·mL-1的黃芩苷對(duì)照品溶液，按“”項(xiàng)下電泳條件，連續(xù)測(cè)定5次，記錄峰面積并計(jì)算RSD值。結(jié)果黃芩苷峰面積的RSD=%，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)取供試品溶液(批號(hào)090741)，在0、2、4、6、8、12h分別重力進(jìn)樣10s，記錄峰面積并計(jì)算RSD。結(jié)果黃芩苷峰面積的RSD=%，表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)取同一批號(hào)(批號(hào)090741)的梔子金花丸樣品6份，按“”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法測(cè)定。結(jié)果梔子金花丸中黃芩苷的平均含量為mg·g-1，RSD=%(n=6)。表明重復(fù)性良好。

加樣回收率試驗(yàn)精密稱取梔子金花丸樣品(批號(hào)090741)共6份，加入黃芩苷對(duì)照品適量，按“”項(xiàng)下方法處理并依法測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。梔子金花丸中黃芩苷的平均回收率為%,RSD=%。表1加樣回收率試驗(yàn)

樣品測(cè)定

取梔子金花丸樣品3批，按“”項(xiàng)下方法處理后依法測(cè)定，記錄峰面積，代入回歸方程計(jì)算樣品中黃芩苷的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。表2樣品含量測(cè)定

3討論

提取方法的選擇參考有關(guān)文獻(xiàn)[7，8]中黃芩苷的提取方法，本實(shí)驗(yàn)先后以50%(體積分?jǐn)?shù))甲醇、70%(體積分?jǐn)?shù))甲醇、甲醇為溶劑進(jìn)行超聲提取。結(jié)果表明，樣品采用70%(體積分?jǐn)?shù))甲醇超聲提取基本完全，且黃芩苷與雜質(zhì)峰分離度較好。同時(shí)考察了不同提取時(shí)間(30、40、50min)對(duì)提取效率的影響，結(jié)果顯示超聲40min時(shí)提取率已達(dá)最高，超聲時(shí)間延長(zhǎng)而提取率并未提高。因此，確定以70%(體積分?jǐn)?shù))甲醇為提取溶劑，超聲提取40min。

內(nèi)標(biāo)物的選擇毛細(xì)管電泳有重現(xiàn)性差的缺點(diǎn)，因此采用內(nèi)標(biāo)法定量。苯甲酸鈉、對(duì)氨基苯甲酸以及對(duì)硝基苯甲酸在280nm波長(zhǎng)處均有吸收。預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，苯甲酸鈉在體系中不出峰;對(duì)氨基苯甲酸靈敏度低，且出峰時(shí)間與黃芩苷過(guò)于接近，容易產(chǎn)生干擾;對(duì)硝基苯甲酸峰型好，雖出峰時(shí)間與黃芩苷接近，但在樣品中無(wú)干擾，故選其作為內(nèi)標(biāo)物。

運(yùn)行緩沖液的選擇黃芩苷極性較強(qiáng)，容易離子化;而在硼砂溶液中，黃芩苷中鄰二羥基基團(tuán)更易形成絡(luò)離子[10]，加快離子化。因此選擇硼砂溶液為運(yùn)行緩沖液，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定其最佳濃度為40mmol·L-1。

采用毛細(xì)管電泳法測(cè)定梔子金花丸中黃芩苷含量，與高效液相色譜法相比[1，5，6]具有樣品用量少，分析成本低等優(yōu)點(diǎn)，并減少了對(duì)的污染，可用于梔子金花丸的質(zhì)量控制。

【參考文獻(xiàn)】

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方考察

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備分別吸取對(duì)照品貯備液適量，加甲醇稀釋成黃芩苷質(zhì)量濃度為、、、、、、μg·mL-1，內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度為μg·mL-1的溶液。依次重力進(jìn)樣10s，每個(gè)濃度測(cè)定3次以上。以對(duì)照品與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)(Y)，黃芩苷質(zhì)量濃度(ρ)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=ρ-，r=6。表明黃芩苷在～μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)取質(zhì)量濃度為g·mL-1的黃芩苷對(duì)照品溶液，按“”項(xiàng)下電泳條件，連續(xù)測(cè)定5次，記錄峰面積并計(jì)算RSD值。結(jié)果黃芩苷峰面積的RSD=%，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)取供試品溶液(批號(hào)090741)，在0、2、4、6、8、12h分別重力進(jìn)樣10s，記錄峰面積并計(jì)算RSD。結(jié)果黃芩苷峰面積的RSD=%，表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)取同一批號(hào)(批號(hào)090741)的梔子金花丸樣品6份，按“”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法測(cè)定。結(jié)果梔子金花丸中黃芩苷的平均含量為mg·g-1，RSD=%(n=6)。表明重復(fù)性良好。

加樣回收率試驗(yàn)精密稱取梔子金花丸樣品(批號(hào)090741)共6份，加入黃芩苷對(duì)照品適量，按“”項(xiàng)下方法處理并依法測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。梔子金花丸中黃芩苷的平均回收率為%,RSD=%。表1加樣回收率試驗(yàn)

樣品測(cè)定

取梔子金花丸樣品3批，按“”項(xiàng)下方法處理后依法測(cè)定，記錄峰面積，代入回歸方程計(jì)算樣品中黃芩苷的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。表2樣品含量測(cè)定

3討論

提取方法的選擇參考有關(guān)文獻(xiàn)[7，8]中黃芩苷的提取方法，本實(shí)驗(yàn)先后以50%(體積分?jǐn)?shù))甲醇、70%(體積分?jǐn)?shù))甲醇、甲醇為溶劑進(jìn)行超聲提取。結(jié)果表明，樣品采用70%(體積分?jǐn)?shù))甲醇超聲提取基本完全，且黃芩苷與雜質(zhì)峰分離度較好。同時(shí)考察了不同提取時(shí)間(30、40、50min)對(duì)提取效率的影響，結(jié)果顯示超聲40min時(shí)提取率已達(dá)最高，超聲時(shí)間延長(zhǎng)而提取率并未提高。因此，確定以70%(體積分?jǐn)?shù))甲醇為提取溶劑，超聲提取40min。

內(nèi)標(biāo)物的選擇毛細(xì)管電泳有重現(xiàn)性差的缺點(diǎn)，因此采用內(nèi)標(biāo)法定量。苯甲酸鈉、對(duì)氨基苯甲酸以及對(duì)硝基苯甲酸在280nm波長(zhǎng)處均有吸收。預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，苯甲酸鈉在體系中不出峰;對(duì)氨基苯甲酸靈敏度低，且出峰時(shí)間與黃芩苷過(guò)于接近，容易產(chǎn)生干擾;對(duì)硝基苯甲酸峰型好，雖出峰時(shí)間與黃芩苷接近，但在樣品中無(wú)干擾，故選其作為內(nèi)標(biāo)物。

運(yùn)行緩沖液的選擇黃芩苷極性較強(qiáng)，容易離子化;而在硼砂溶液中，黃芩苷中鄰二羥基基團(tuán)更易形成絡(luò)離子[10]，加快離子化。因此選擇硼砂溶液為運(yùn)行緩沖液，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定其最佳濃度為40mmol·L-1。

采用毛細(xì)管電泳法測(cè)定梔子金花丸中黃芩苷含量，與高效液相色譜法相比[1，5，6]具有樣品用量少，分析成本低等優(yōu)點(diǎn)，并減少了對(duì)的污染，可用于梔子金花丸的質(zhì)量控制。

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