高效液相色譜法測定柴胡中黃酮類化合物

高效液相色譜法測定柴胡中黃酮類化合物

柴胡是傘科植物，主要是根和草本植物。它是中國四大缺陷藥物之一。它又苦又平。具有內(nèi)外和解、舒肺解郁、升福陽氣的功能。主要用于散熱、胸悶、胸痛、月經(jīng)不調(diào)等疾病。柴胡的有效成分為柴胡醇、酒精、乙醇（柴胡醇、丁香酚等）、脂肪油（油酸、亞麻油酸、棕櫚酸、硬脂酸等）和多糖等。此外，它還包括氨基酸、黃酮類、氨基酸、葡萄糖、氨基酸等。黃酮類化合物對人體腫瘤、老人和心血管疾病的治療和預防具有重要意義。例如，類黃酮類化合物具有抗逆性、抗突變、減少毛細血管異常滲透性和脆弱性等作用。它被用來治療各種由血管干燥引起的出血疾病。它也可以用來治療高血壓和年老炎癥性疾病。類黃酮類化合物的選擇性抗劑劑，能降低血管的滲透性和脆弱性，抑制血小板聚集，防止血栓形成。這是治療閉塞性腦病的常用藥物，具有清熱解毒、擴張心腦血管、改善體內(nèi)微循環(huán)等作用。黃酮類化合物具有代表性。據(jù)研究，它具有抗自由基、氧化、抗癌、糖尿病并發(fā)癥和其他生物活性和藥理。它對呼吸道疾病，尤其是哮喘和支氣管炎疾病有很好的治療效果。目前已報道的測定黃酮類藥物的方法很多,主要有化學發(fā)光分析法、毛細管電泳法、高效液相色譜法、分光光度法、等吸收紫外光度法等,但一般都是分析一種或兩種黃酮類成分,同時分析蘆丁、曲克蘆丁、黃芩苷、槲皮素四種成分還未見報道.本文采用反相高效液相色譜法,同時分離和測定了柴胡中蘆丁、曲克蘆丁、黃芩苷和槲皮素四種黃酮類成分的含量.操作方法簡單易行,結(jié)果準確可靠,為柴胡中黃酮類成分的含量測定和質(zhì)量監(jiān)控提供了科學依據(jù).1實驗部分1.1藥品、化學品和相對品日本島津(SHIMADZU)LC-10A高效液相色譜儀系統(tǒng);CLASS-VP色譜工作站;Milli-Q純水器(Millipore公司);HANGPINGSB2200電子天平(上海天平儀器廠);0.45μm微孔過濾器;高速萬能粉碎機(北京市永光明醫(yī)療儀器廠).蘆丁對照品(中國藥品生物制品檢定所,批號:100080-200306);曲克蘆丁對照品(中國藥品生物制品檢定所,批號:100416-200503);黃芩苷對照品(中國藥品生物制品檢定所,批號:110715-200514);槲皮素對照品(中國藥品生物制品檢定所,批號:100081-200406);柴胡(產(chǎn)地:河北祁州,生產(chǎn)廠家:河北安國興旺制藥飲片公司).甲醇、乙腈為色譜純,水為Milli-Q純水器處理的超純水,其它試劑為分析純.1.2方法和結(jié)果1.2.1標準溶液的配制稱取蘆丁、曲克蘆丁、黃芩苷、槲皮素對照品各10mg于四支比色管中,用甲醇溶解并定容至10mL,配制成濃度為1mg·mL-1的標準溶液.取上述標準溶液各100μL于一支10mL比色管中,然后用甲醇定容至刻度,配制成濃度為0.01mg·mL-1的標準混合溶液.測定時取上述標準溶液稀釋成適宜度的標準溶液.1.2.2乙醇的提取柴胡用粉碎機粉碎后,過4號篩,稱取5g置于圓底燒瓶中,加70mL乙醇和30L水回流2.5h.待冷卻、過濾后,于78℃蒸餾回收乙醇.浸膏用水飽和的乙酸乙酯萃取3次(20:15:10),合并乙酸乙酯層,于77℃蒸餾回收乙酸乙酯.殘渣用甲醇定容至10mL比色管中,搖勻,過濾,棄去初濾液,取續(xù)濾液再用0.45μm微孔濾膜過濾即得.1.2.3保護柱和流動相柱色譜柱:Shim-packVP-ODS柱(150mm×4.6mm,5μm);保護柱:Shim-packGVP-ODS柱(4.6mm×10mm,5μm);流動相:0.5%的磷酸溶液-甲醇(63:37);流速:0.8mL·min-1;檢測波長:333nm;進樣量:20μL;柱溫:40℃.對照品和樣品的色譜圖見圖1.1.2.4標準工作曲線和檢出限取適宜濃度的標準溶液,用甲醇稀釋并定容于10mL比色管中,配制濃度分別為10μg·mL-1,5μg·mL-1,2.5μg·mL-1和1μg·mL-14個水平黃酮類藥物的標準混合液,每個溶液分別進樣3次,以峰面積對濃度作工作曲線,用稀釋法測定四種黃酮類藥物的檢出限.四種黃酮類藥物的標準工作曲線線性范圍、線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限列于表1,其中X表示黃酮類藥物的濃度,Y表示黃酮類藥物的峰面積.1.2.5穩(wěn)定性試驗稱取柴胡樣品5g,按1.1.2法操作制備供試品溶液,分別在1,2,3,4d于上述色譜條件下測定,以峰面積計算蘆丁、曲克蘆丁、黃芩苷、槲皮素的RSD分別為2.1%,2.2%,3.5%,4.7%.結(jié)果顯示供試品溶液在4d內(nèi)穩(wěn)定.1.2.6rsd的測定稱取柴胡樣品5g共6份,按1.1.2法操作制備供試品溶液,于上述色譜條件下測定,以峰面積計算蘆丁、曲克蘆丁、黃芩苷、槲皮素的RSD分別為1.1%,3.5%,2.7%,4.3%.1.2.7進樣檢測取上述對照品溶液20μL,按照上述色譜條件重復進樣6次,以峰面積計算蘆丁、曲克蘆丁、黃芩苷、槲皮素的RSD分別為1.6%,2.1%,3.0%,1.1%..1.2.8加標回收試驗取已知含量的柴胡供試品溶液各1mL分別于三支10mL比色管中,再分別加入4μL,6μL,8μL的1mg·mL-1蘆丁、曲克蘆丁、黃芩苷,(槲皮素因含量較高,標準品加入量增加10倍),配制成4μg·mL-1,6μg·mL-1,8μg·mL-1的加標溶液.在最佳色譜條件下進樣,做加標回收試驗,回收率見表2.1.2.9樣品測定結(jié)果將柴胡供試品溶液直接進樣分析,發(fā)現(xiàn)柴胡中槲皮素含量較高,故采用單點校正法定量,其它三種組分含量較低,采用標準加入法定量,樣品測定結(jié)果見表3.2討論2.1流動相的可以添加量考察采用甲醇和水、甲醇和磷酸或磷酸鹽、乙腈和磷酸、四氫呋喃(THF)和磷酸五種不同體系作為流動相時蘆丁、曲克蘆丁、黃芩苷、槲皮素四種黃酮成分的分離情況,結(jié)果表明:采用CH3OH-KH2PO4(40:60)為流動相時,黃芩苷和槲皮素拖尾比較嚴重;選擇H3PO4-CH3CN(54:46)為流動相時,各組分分離情況不佳;當用H3PO4-THF(67:33)為流動相時,雖然峰形比較好,但蘆丁和曲克蘆丁分不開;選擇CH3OH-H2O(37:63)為流動相時柱壓很高;而選用CH3OH-H3PO4(37:63)時,峰形好又可以使四個組分在35min內(nèi)達到完全分離,而且柱壓也不高.綜合考慮以上因素,最后選CH3OH-H3PO4(37:63)為分離四種黃酮類藥物的流動相.2.2甲醇比例的影響考察流動相中甲醇比例不同時,對四種黃酮組分保留時間的影響.以混合標準溶液進樣分析,結(jié)果顯示:隨著甲醇比例增加,流動相的極性增強,各組分的保留時間相應縮短.當甲醇比例超過37%時,各峰的峰形不太好;當甲醇的比例小于37%時,流動相極性減弱,各組分的保留時間相應增加,導致分析時間大大延長,且柱壓增大;當甲醇比例為37%時,在35min內(nèi)四種組分達到基線分離.2.3最大吸收的測定波長取20μL的0.01mg·mL-1標準混合溶液進樣,由紫外光譜可知:蘆丁在350nm和260nm時有最大吸收;曲克蘆丁在354nm和255nm時有最大吸收;黃芩苷在318nm和274nm處有最大吸收;槲皮素在370nm和254nm處有最大吸收.結(jié)果顯示:當檢測波長