豬圓環(huán)病毒的診斷與控制

豬圓環(huán)病毒的診斷與控制

豬環(huán)病毒（pcv）屬于環(huán)病科和環(huán)病科，是單帶負鏈環(huán)形dna病毒。該病毒粒子直徑為14nm~25nm,為二十面體對稱結構,無囊膜,是獸醫(yī)學上已知動物病毒中最小的病毒之一。根據PCV的致病性、抗原性及核苷酸序列,將其分為PCV-1和PCV-2兩型。有關PCV引起疾病的最早報道發(fā)生在1991年的加拿大,是由PCV-2引起的斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Post-weaningmultisystemicwastingsyndrome,PMWS)。至1994年PMWS已呈廣泛性流行,法國、美國、西班牙、北愛爾蘭及日本相繼報道了該病的發(fā)生,此后韓國、意大利、德國、丹麥、荷蘭、墨西哥等國家也證實了該病的存在。我國雖然自2000年才有對圓環(huán)病毒感染豬的報道并引起重視,但對于豬血清中豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)抗體所作的回顧性檢測以及對豬的組織樣本所作的回顧性檢測結果表明,PCV-2抗體至少從1969年起就已經存在于豬群中了。臨床上豬感染PCV-1很常見,普遍認為廣泛存在于豬體內及豬源傳代細胞系,由于其無致病性,所以無法通過臨床癥狀或病理診斷來確定是否感染PCV-1。但PCV-2與豬群中發(fā)生的多種疾病相關,有其相應的臨床癥狀和病理表現,在臨床上主要引起PMWS、豬皮炎腎病綜合征(Porcinedermatitisandnephropathysyndrome,PDNS)、豬呼吸道疾病復合征(Porcinerespiratorydiseasecomplex,PRDC)及A2型先天性震顫(Congenitaltremor,CT)。PCV-2與豬細小病毒(Porcineparvovirus,PPV)、豬流感病毒(Swineinfluenzavirus,SIV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,PRRSV)等病原可以混合感染,致病性增強。本文綜述了豬圓環(huán)病毒診斷學方法的研究進展,以供借鑒。1豬一般情況的發(fā)生情況豬感染PCV-2后主要表現為漸進性消瘦,生長遲緩,采食量下降,被毛粗亂,精神差,相當一部分豬只出現呼吸困難呈腹式呼吸,少數豬只有拉稀癥狀,有的豬出現貧血,個別豬出現黃疸癥狀;PCV-2感染豬引起的CT,震顫為雙側,影響骨骼肌肉,當臥下或睡覺時震顫消失,外界刺激可引發(fā)或加重震顫,有的在整個生長和發(fā)育期間都不斷發(fā)生震顫;PCV-2感染豬引起PDNS的臨床癥狀常見為皮膚發(fā)生圓型或不規(guī)則的隆起,呈現紅色或紫色中央為黑色病灶。2肺長期感染型感染豬感染PCV-2后,最顯著的剖檢病變是全身淋巴結,特別是腹股溝淋巴結、縱隔淋巴結、肺門淋巴結、腸系膜淋巴結及下頜淋巴結腫大2倍~5倍,有時可達10倍;肺臟腫脹、堅硬或似橡皮,部分病例形成固化、致密的病灶。嚴重病例肺泡出血,肺呈紫褐色,有的肺尖葉和心葉萎縮或實質性病變;半數病例為輕度到中度的肝萎縮,花斑肝。肝小葉間結締組織增生明顯;脾臟常腫大,呈肉樣變化;腎為花斑腎,水腫,呈灰白色,被膜下有時有白色壞死灶;胃的食管部黏膜水腫和非出血性潰瘍;回腸和結腸段腸壁變薄,盲腸和結腸黏膜充血和出血。另外,經常見到由繼發(fā)感染引起的胸膜炎、腹膜炎、心包炎(心包膜內有大量炎性滲出物)和關節(jié)炎。當發(fā)現豬全身淋巴結腫大,肺退化不全或形成固化、致密病灶時,應懷疑為PCV-2感染。如病理組織學檢查可見全身淋巴組織的淋巴細胞減少,單核巨噬細胞浸潤及形成多核巨細胞,并在這些細胞中觀察到嗜堿性或兩性染色的細胞質內包涵體,則基本可以確診。3豬圓形感染的實驗室診斷3.1超微結構的觀察利用電鏡技術可以直觀、準確的鑒別病毒,根據病毒本身所具有的形態(tài)、結構和大小等不同特征,可即刻做出診斷。Stevenson首次在透射電鏡下對被PCV-2持續(xù)感染的PK-15細胞內的PCV-2進行超微結構的觀察,并詳細描述了在細胞的細胞漿與細胞核內的病毒包涵體及病毒粒子的形態(tài)。郎洪武從發(fā)病豬的脾臟和淋巴結組織的超薄切片中觀察到了大量直徑17nm、圓形、無囊膜的PCV病毒粒子。3.2家兔的免疫鑒定Sorden等采用純化的PCV-2抗原免疫兔子,得到兔抗PCV-2高免血清。利用此高免血清結合福爾馬林固定石蠟包埋組織中的PCV-2抗原,再采用生物素標記的抗兔二抗與兔血清結合,最后用過氧化物酶標記的鏈霉素染色。他們應用此法發(fā)現陽性細胞內存在大量濃染的圓形結構,大小和形狀與包涵體相似。Chianini等也用兔抗PCV-2的陽性血清建立了免疫組織化學(immunohistochemistry)檢測技術。Magar等為了克服內源性過氧化物酶對檢測結果的影響,將過氧化物酶標記的第二抗體改用免疫膠體銀標記,取得了更好的檢測效果。3.3接種免疫熒光檢測pcv免疫熒光技術(immunofluorescenceassay,IFA)可用于PCV的抗體檢測及抗原組織定位的研究。Allan利用接免疫熒光來檢測PCV,就是將組織病料以蓋玻片在PK-15細胞中培養(yǎng),丙酮固定,用兔抗PCV高免血清與細胞培養(yǎng)物中的PCV反應,可對PCV進行檢測和分型。崔尚金等將接種PCV-2且經多次傳代的PK-15細胞分散到96孔細胞培養(yǎng)板上,制成抗原診斷板,檢測血清中PCV-2的抗體?，F在一般認為IFA是實驗室檢測PCV-2的一種快速、靈敏、成本低的方法,但操作上較復雜,不宜作為臨床快速診斷。3.4elisa檢測和基因原核表達酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)可以檢測抗體,也可以檢測抗原,具有靈敏、簡單、快捷的特點。采用Walker等的競爭ELISA來檢測PCV-2抗體,此法的檢出率為99.58%。Allan等也利用單抗建立了抗原捕獲ELISA來檢測PCV-2特異性抗體。琚春梅等利用PCV-2-ORF2基因原核表達產物建立了ELISA檢測方法。崔尚金等以重組桿狀病毒表達PCV衣殼蛋白作為ELISA抗原,提高了HRP標記的二抗的稀釋倍數,降低了背景的非特異性。林彥星等應用原核表達的PCV-2Cap蛋白建立了間接ELISA。張曉勇等利用巴斯德畢赤酵母高效表達PCV-2-ORF2基因編碼蛋白建立了ELISA。3.5檢測抗體的方法Dulac等首先報道了免疫過氧化物酶單層細胞試驗(Immunoperoxidasemonolayerassay,IPMA),方法是將生長有PCV的PK-15細胞在96孔板上長成單層后檢測血清中的抗體。劉長明等在優(yōu)化IPMA檢測方法的基礎上,研制出一種新的IPMA抗體檢測試劑盒,用于豬血清中PCV-2抗體檢測,具有特異、敏感、操作簡便、實用性強等特點。3.6膠體金標記物作免疫快速檢測劑免疫膠體金技術(immunecolloidalgoldtechnique,ICGT)產生于20世紀60年代,最先用作電鏡的示蹤標記物,1971年Faulk將膠體金引入免疫化學后發(fā)展成為一種新的免疫學快速檢測技術。其原理是以微孔濾膜為載體,以紅色膠體金為標記物,通過滲濾而逐步反應,整個過程3min~5min即可完成。王慧杰等通過對Cap蛋白基因的羧基端進行克隆和表達研究,結合膠體金標記技術,建立了PCV-2Cap抗體膠體金診斷體系。3.7多重pcr檢測聚合酶鏈反應(Polymerasechainreaction,PCR)是一種快速、簡便、特異的診斷方法,可直接檢測病毒核酸。目前已報道的PCR方法有很多,常用的有套式PCR、多重PCR、實時定量PCR等。3.7.1常規(guī)PCRMorozov從PCV-PK-15DNA鏈上設計特異性引物進行PCR反應,可直接檢測組織病料及其細胞培養(yǎng)物中的病毒核酸。Liu等建立了用競爭PCR方法以檢測仔豬血清中的PCV病毒DNA。3.7.2多重PCR(MultiplexPCR)Larochelle等建立了多重PCR方法來檢測和區(qū)分PCV-1和PCV-2。LeeCS等建立了可以檢測和區(qū)分PCV、PRV和PCMV的多重PCR,并具有較高的靈敏度。GiammarioliM等建立了熱啟動多重PCR,可以同時檢測ASFV、PRRSV、CSFV、PCV-2、PPV。崔尚金等建立的檢測豬圓環(huán)病毒的多重PCR方法可以同時區(qū)分PCV-1和PCV-2。3.7.3套式PCR(Nested-PCR)Wijit等用套式PCR來檢測PCV-2。Celera等通過設計3個寡核苷酸引物進行半套式PCR來檢測PCV-2的DNA,并證實該方法是特異的。Kim等建立了檢測和區(qū)分PCV-1和PCV-2的多重套式PCR方法。KimJ等運用多重套式PCR來同時檢測PCV-1、PCV-2及PPV。呂艷麗等設計合成了PCV-2特異性引物和PCV通用引物,建立了能夠區(qū)分PCV-1和PCV-2的檢測方法。3.7.4實時定量PCR(Real-timequantitativePCR)與普通PCR相比,實時定量PCR特異性和靈敏度都更高一些,而且便于觀測,能實時地監(jiān)測反應全過程。BrunborgIM等建立了以TaqMan為基礎的實時定量PCR方法,用于血清、血漿及組織樣品中的PCV-2的定量檢測。ChungWB等也建立了實時定量PCR方法用于PRRSVcDNA和PCV-2DNA的定量檢測。羅玉均等建立了TaqMan實時熒光定量PCR方法,檢測PCV-2。YangZZ等利用SYBRGreenI建立了實時熒光定量PCR檢測PCV-2,80個樣品中PCV-2陽性為68個,而用常規(guī)PCR方法只能檢測出56個。3.7.5PCR-限制性長度多態(tài)性(RFLP)分析方法Hamel等借助于RFLP建立了可以分型的PCR診斷方法,很容易檢測PCV-1和PCV-2。Fenaux等根據已有的PCV株的基因序列,建立了通用的PCR-RFLP分析方法,該方法不但可以用于PCV-2的致病性研究,而且可以用來檢測來自不同地理區(qū)域的PCV-2的感染情況。王新等借助RFLP方法,對PK-15細胞、IBRS-2細胞以及疑似豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)、豬皮炎腎炎綜合征(PDNS)的病料進行了PCV檢測以及血清型的鑒定。3.8正、負鏈探針檢測ChoiC等用地高辛標記的探針做原位雜交檢測PCV,研究PCV-2和豬細小病毒在豬體內的分布狀況。NawagitgulP等根據PCV的基因序列,設計了一組探針,包括ORF1及ORF2的正、負鏈探針,可鑒別PCV-1和PCV-2兩種基因型。Sirinarumitr等應用快速加強雜交(rateenhancementhybridization,REH),僅用7h~8h,比傳統(tǒng)的雜交方法(用時2d)檢測時間大大縮短,更適用于對PCV-2的診斷。Sirinarumitr等建立了雙雜交方法同時檢測豬PRRSV和PCV,而且可確定這兩種病毒是否共同感染同一細胞。姚鑫等利用地高辛標記的核酸探針建立了直接從組織中檢測和定位PCV-2的原位雜交檢測方法。3.9項高新技術dna芯片檢測基因芯片技術是近年來分子生物學與微電子學等多學科交叉融合而成的一項高新技術DNA芯片技術檢測疾病具有高通量、并行性和結果判讀客觀、準確和信息化的特點。肖馳等建立了CSF-PRRS-PCV2診斷DNA芯片,能同時檢測PR