污染土壤微生物多樣性分析的分子生物學(xué)方法

污染土壤微生物多樣性分析的分子生物學(xué)方法

土壤中存在大量微生物對整個生態(tài)系統(tǒng)有重要影響。它們不僅是自然界的有機化合物分解人，而且是鏈中的主要創(chuàng)造者，在碳、氮、硫、磷等自然界因素的循環(huán)中發(fā)揮著重要作用。然而,隨著近代工農(nóng)業(yè)的發(fā)展,大面積土壤受到嚴(yán)重污染,在新的選擇壓力下可能導(dǎo)致土壤微生物群落多樣性和結(jié)構(gòu)的變化。以往對于土壤微生物多樣性的研究是建立在傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)和分離技術(shù)上的,然而在自然界中可培養(yǎng)的微生物僅占很小的一部分(土壤中約為0.3%),為了擺脫對培養(yǎng)技術(shù)的依賴,20世紀(jì)80年代末至90年代初發(fā)展起來的一系列分子生物學(xué)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于土壤微生物多樣性的研究。本文綜述了近年來應(yīng)用于污染土壤微生物多樣性分析的各種分子生物學(xué)技術(shù),這些方法大多基于對土壤中直接提取的DNA或RNA分子的分析,包括DNA中mol%G+C豐度的分析、核酸雜交技術(shù)、DNA復(fù)性動力學(xué)研究及基于PCR技術(shù)的DNA指紋圖譜分析等方法,闡述了這些方法的主要應(yīng)用及各自的優(yōu)勢和局限性。1復(fù)合復(fù)性動力曲線不同種微生物含有不同的核酸比例,G+Cmol百分含量在24%~76%之間波動,因此總DNA分子中mol%G+C豐度的變化能夠作為測定微生物群落多樣性變化的一個敏感指標(biāo)。測定mol%G+C豐度的主要方法有熱變性法、密度梯度離心、不同DNA樣本雜交、變性DNA(單鏈DNA)復(fù)性動力曲線分析等。Griffiths等應(yīng)用此技術(shù)測定了被各種重金屬(Cd,Cu,Ni,Pb,Zn)污染的土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)的變化,分析結(jié)果表明被Cd污染的土壤中微生物群落組成與其他重金屬污染有明顯不同。但是這項技術(shù)也存在著一定的局限性,當(dāng)mol%G+C相同時,不能判定是微生物群落組成相同還是組成不同而含有相同的mol%G+C;當(dāng)mol%G+C不同時,也不能斷定是微生物群落組成不同還是群落組成相同而所含各個菌種的比例不同。例如Sandaa等在比較低濃度重金屬污染、高濃度重金屬污染和未受污染的土壤中細(xì)菌DNA的mol%G+C含量時,并未發(fā)現(xiàn)mol%G+C的明顯變化。因此,單獨使用此技術(shù)并不能準(zhǔn)確說明微生物群落多樣性的變化,還需要結(jié)合核酸雜交等專一性更強的技術(shù)。2土壤微生物多樣性分析核酸分子雜交技術(shù)是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來的一種新的分子生物學(xué)技術(shù)。它是基于核酸分子堿基互補配對的原理,用特異性探針與待測樣品的DNA或RNA形成雜交分子的過程。由于它的高度特異性和靈敏性,近年來被廣泛應(yīng)用于土壤微生物多樣性的研究。用于微生物多樣性研究常用的探針主要有rRNA基因探針、抗性基因探針和編碼代謝酶基因探針等。特別是近年來發(fā)展起來的熒光原位雜交技術(shù)是研究環(huán)境中不可培養(yǎng)微生物群落多樣性最為常用和有效的手段。2.1探針的設(shè)計和鑒定具有種屬特異性的16SrRNA或23SrRNA探針是微生物多樣性分析中最為常用的探針。目前通過比較16SrRNA序列與數(shù)據(jù)庫中的序列,已經(jīng)設(shè)計出許多探針用于鑒定不同的微生物,如表1所示。Sandaa等用原位雜交的方法分析了受重金屬污染的土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)變化,用探針ARCH915、BET42a、GAM42a、SRB385、CF319a、LGCb和HGC69a檢測的細(xì)胞數(shù)量減少,而用探針ALF1b檢測的細(xì)胞數(shù)量顯著增加,表明變形菌(Proteobacteria)α-亞群在重金屬污染的土壤中具有選擇性優(yōu)勢。2.2英美法上的mera和cu抗性基因片段的分析應(yīng)用抗性探針對污染土壤樣品進(jìn)行雜交也是檢測污染土壤微生物種群的有效方法之一,這些抗性探針目前研究和應(yīng)用較多的是各種重金屬抗性探針。Hart等以菌株RC607中的抗Hg基因merA作為探針檢測英國西北部受Hg污染的土壤樣品,雜交結(jié)果表明,從土壤中分離出的98%的桿菌染色體DNA上存在與merA同源的序列。Yang等以Cu抗性操縱子(cop)對Cu污染土壤樣品中的熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)進(jìn)行雜交,研究其在污染土壤中競爭存活的機理。Lee等用抗性基因雜交的方法研究了惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)中Cd抗性基因片段。此外,還有其他許多編碼抗性基因的探針用于污染土壤微生物種群的檢測,如chr(CrR)、cnr/ncc(CoR)等。2.3goa和gio中活性酶基因片段的雜交分析除了上述兩種常用的探針以外,也可以使用編碼活性酶基因的探針對特定土壤樣品進(jìn)行雜交。Guo等應(yīng)用一系列編碼代謝燃油的活性酶基因片段,與被燃油污染的土壤樣品進(jìn)行雜交,發(fā)現(xiàn)很強的雜交信號。還有一些活性酶基因探針用于研究人造化合物四氯乙烯(PCE)和三氯乙烯(TCE)污染土壤中降解菌的組成和豐度。2.4土壤微生物多樣性分析在核酸雜交技術(shù)中引入熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針具有里程碑式的重要意義,使得這種技術(shù)既可用于鑒定細(xì)胞形態(tài)和微生物種群組成,也可用于鑒定細(xì)胞活性和計數(shù)。FISH(Fluorescentinsituhybridization)方法首先從土壤中提取微生物細(xì)胞并將其固定,然后在緩沖液中進(jìn)行雜交、染色,在熒光顯微鏡下觀察雜交結(jié)果。Yang等用FISH方法檢測了四氯乙烯(PCE)污染地區(qū)降解菌Dehalococcoides的豐度。但是也有實驗表明FISH方法對于土壤樣品的靈敏度較低。以上所述及的各種核酸雜交技術(shù)雖然被廣泛應(yīng)用于污染土壤微生物多樣性的研究,但仍有許多因素限制其應(yīng)用和發(fā)展。比如報告基因(包括16SrRNA基因和各類功能基因)數(shù)據(jù)庫中信息量還比較少,限制了探針的設(shè)計,并且隨著DNA復(fù)雜程度的提高雜交信號明顯減弱,因此核酸雜交技術(shù)僅適用于分析土壤中特定的微生物種群或者用限制酶消化了的DNA片段。3對重金屬污染土壤細(xì)菌群落多樣性的復(fù)性動力學(xué)分析樣品中DNA的序列復(fù)雜性也反映了微生物的多樣性,可用于土壤中總的微生物多樣性的研究。DNA的序列復(fù)雜性可以用一定條件下單鏈DNA的復(fù)性率來表示,DNA復(fù)性率與樣品中同源DNA濃度的平方成正相關(guān)。微生物多樣性越復(fù)雜,DNA的同源性越差,復(fù)性率也越低。Sandaa等用這種方法研究了受不同程度重金屬污染的土壤中微生物多樣性的變化。DNA復(fù)性動力學(xué)分析表明未受污染的對照土壤含有16000個細(xì)菌基因組,受低濃度重金屬污染的土壤含有6400個細(xì)菌基因組,而受高濃度重金屬污染的土壤含有2000個細(xì)菌基因組,分別比對照下降了60%和90%。Atlas等用復(fù)性的方法也發(fā)現(xiàn)被除草劑三氯苯氧乙酸(2,4,5-T)污染的土壤中細(xì)菌基因多樣性的減少。雖然復(fù)性動力學(xué)分析提供了土壤樣品中微生物群落總體遺傳多樣性的數(shù)據(jù),但單獨使用此技術(shù)并不能揭示多樣性的結(jié)構(gòu),需結(jié)合mol%G+C豐度分析和16SrRNA序列分析等技術(shù)才能得到微生物群落組成的具體信息。要想進(jìn)一步對比不同微生物群落的結(jié)構(gòu)并對某些特定種群進(jìn)行精確測定,還需要依賴于群落總DNA的指紋圖譜技術(shù)。4微生物群落多樣性分析最早應(yīng)用于微生物多樣性分析的技術(shù)是通過對某些低分子量rRNA(5SrRNA,tRNA)電泳圖譜的分析,但是由于低分子量rRNA基因相對較小(約120個核苷酸),攜帶信息較少,因而揭示微生物群落多樣性的能力有限。16SrDNA在原核微生物中普遍存在,并且含有相對保守區(qū)域和可變區(qū)域,大小也適合電泳技術(shù)分析,目前主要應(yīng)用16SrDNA序列分析來研究原核微生物群落多樣性,通過與已建立的微生物16SrDNA序列數(shù)據(jù)庫比較,可以確定微生物系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。此外,核糖體間隔區(qū)序列和染色體上的回文序列等近年來也被廣泛應(yīng)用于微生物群落多樣性研究。群落總DNA指紋圖譜分析的通用技術(shù)路線為:1)從土壤樣品中提取微生物總DNA;2)聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerasechainreaction/PCR)擴增特定基因序列;3)對特定基因序列擴增產(chǎn)物進(jìn)行分析。根據(jù)PCR擴增片段的不同及擴增產(chǎn)物分離、分析方法的差異可分為以下幾種實用技術(shù)。4.1不同ph值的s自1993年Muyzer等將DGGE(Denaturinggradientgelelectrophoresis)的方法應(yīng)用于微生物生態(tài)學(xué)研究以來,DGGE迅速成為一項簡便而有效的DNA擴增片段檢測技術(shù)。DGGE和TGGE(Tempreturegradientgelelectrophoresis)的原理是根據(jù)含有不同序列的DNA片段在具有變性劑梯度或溫度梯度的凝膠上由于其解鏈行為的不同而導(dǎo)致遷移率的不同。這種方法的靈敏度非常高,能將僅有1個堿基差異的DNA片段分開。Lasse等用DGGE的方法研究了模擬Hg污染土壤中微生物遺傳多樣性的改變,結(jié)果表明,當(dāng)剛加入Hg時微生物多樣性迅速減少,并且抗Hg菌株數(shù)量有明顯增加。Stephen等檢測了飛機燃油污染土壤中的微生物群落結(jié)構(gòu),DGGE圖譜顯示污染土壤中僅含有很少的微生物物種,并且這些物種很難歸類。Brim等用TGGE的方法研究了Zn污染土壤中微生物群落組成的變化,隨著Zn污染程度的減輕,原來在群落組成中占主要位置的金屬抗性菌Raistoniaeutropha逐漸減少,而節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)在群落中逐漸占據(jù)主要位置。Cheung等應(yīng)用TGGE的方法檢測了原油污染土壤中分枝桿菌(Mycobacterium)的多樣性變化,DGGE圖譜表明污染嚴(yán)重地區(qū)的多樣性明顯減少。DGGE/TGGE技術(shù)在土壤微生物多樣性分析上已有很多應(yīng)用實例。4.2抗cu污染的機制研究這是對16SrRNA基因擴增產(chǎn)物進(jìn)行分析的另一種簡便有效的方法,將16SrRNA擴增產(chǎn)物用限制酶切割,然后再進(jìn)行電泳。Smit等用ARDRA(AmplifiedribosomalDNArestrictionanalysis)的方法研究了Cu污染對土壤微生物群落多樣性的影響,ARDRA圖譜顯示在Cu污染土壤中微生物多樣性明顯減少并且群落結(jié)構(gòu)發(fā)生很大變化,但是Cu污染對氨氧化菌的多樣性沒有影響。Tiedje等用該法檢測了除草劑二氯苯氧乙酸(2,4-D)對土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)的影響。Brim等用ARDRA比較了從土壤中分離出的抗Zn菌株的遺傳特征,結(jié)果表明,盡管這些菌株來源不同,但都與Raistonia屬細(xì)菌有很近的親緣關(guān)系。ARDRA所獲得的譜帶更為簡單,易于分析,但是所能獲得的信息量也相對較少,并且難以用來評估物種的豐度和均度。4.3t-rflp算法T-RFLP(Terminalrestrictionfragmentlengthpolymorphism)方法是ARDRA方法的進(jìn)一步發(fā)展,所不同的是在PCR擴增16SrRNA基因過程中,其中一個引物用熒光標(biāo)記,在計算機程序自動分析時僅分析熒光標(biāo)記的末端限制片段,這樣使得限制片段長度多態(tài)性圖譜更為簡化并且每個可見的條帶都代表一個“核型”或一個分類單元。這種方法能夠得到一個群落的特征指紋圖譜,可用于比較不同群落的相似性和由于污染壓力造成的群落結(jié)構(gòu)在時間和空間上的改變。Clement等成功地用T-RFLP方法比較了未受污染沙地、石油污染沙地和鹿糞中的微生物群落多樣性。Tokunaga等用此法研究了Cr污染土壤中微生物群落組成和活性的變化。Lord等用T-RFLP方法研究了原油污染土壤中真菌多樣性的變化。4.4細(xì)菌鑒定和分類該方法是用PCR擴增核糖體上16SrRNA和23SrRNA之間的基因序列,然后對擴增產(chǎn)物進(jìn)行長度多態(tài)性分析。16S~23SrRNA間區(qū)由于沒有特定功能并且進(jìn)化速率比16SrRNA大,近幾年來在細(xì)菌鑒定和分類方面倍受關(guān)注。Ranjard等用這種方法研究了Hg污染土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)的變化,RISA(Ribosomalintergenicspaceranalysis)圖譜顯示污染土壤樣品中Hg敏感種群的減少和適應(yīng)種群的增加。4.5菌株間的電泳圖譜分析REP-PCR(Repetitiveextragenicpalindromic-PCR)通過使用特定的引物(REP,BOX,ERIC)與染色體上的DNA重復(fù)序列隨機結(jié)合,得到的電泳圖譜能夠顯示種內(nèi)各個菌株之間DNA指紋圖譜的微小差異,因此適合做特定種內(nèi)不同菌株的差異分析。Roane和Pepper用ERIC-PCR的方法分析了從Cd污染土壤中分離出的若干菌株的遺傳特征,通過16SrRNA測序,分別鑒定為節(jié)桿菌(Arthrobacter)、芽孢桿菌(Bacillus)和假單胞菌(Pseudomonas)。Dhruva等應(yīng)用REP-PCR的方法對總石油烴(TPH)污染土壤中降解菌香茅醇假單胞菌(P.citronellolis)進(jìn)行了種內(nèi)的細(xì)致分類,29株香茅醇假單胞菌被分為12個不同的基因組型。4.6rapd分子檢測RAPD(RandomlyamplifiedpolymorphicDNA)以隨機寡核苷酸做引物,得到的多態(tài)性片段較短,更方便檢測兩個同源或異源等位基因的有無,適用于種內(nèi)和亞種更為細(xì)致的分類。姚健和王勐騁等應(yīng)用RAPD分子遺傳標(biāo)記技術(shù)研究了農(nóng)用化學(xué)品污染對土壤中微生物群落DNA多樣性的影響。以上所述及的基于PCR技術(shù)的總DNA指紋圖譜分析方法可以用圖1來歸納,通過這些分析能夠得到關(guān)于土壤中微生物群落多樣性、群落組成、豐度和均度等信息。5與傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)的聯(lián)合使用本文所述及的各種分子生物學(xué)方法為分析污染土壤微生物多樣性提供了更為廣泛和有力的工具,但是也應(yīng)該看到每種技術(shù)都有其特定的優(yōu)點和局限性,在實驗室中使用這些技術(shù)時應(yīng)根據(jù)樣