原位雜交技術(shù)在微生物生態(tài)研究中的應(yīng)用

原位雜交技術(shù)在微生物生態(tài)研究中的應(yīng)用

在過去的污水處理研究和實(shí)際污水處理廠運(yùn)行中，污水處理效果的主要途徑是確定污染物的進(jìn)水量和去除率，然后描述原生動(dòng)物和后代動(dòng)物的數(shù)量、組成和活性。但這類方法難以對污水處理裝置內(nèi)生態(tài)系統(tǒng)的微生物結(jié)構(gòu)做深入的剖析和適時(shí)動(dòng)態(tài)的監(jiān)測。近年來,對污水生物法除磷、脫氮機(jī)理的深入研究,以及對污水處理裝置的不斷優(yōu)化,迫切需要更加快速、準(zhǔn)確和精細(xì)的分析手段來定性、定量處理系統(tǒng)中特定細(xì)菌并剖析其群落結(jié)構(gòu)。污水處理領(lǐng)域的一些研究者開始嘗試將熒光原位雜交技術(shù)(FISH)用于脫氮細(xì)菌和除磷細(xì)菌的分析,并取得了初步成功。研究表明,對特定微生物種群定性和定量時(shí),應(yīng)采用FISH一類以微生物學(xué)為基礎(chǔ)的方法而不是以活性為基礎(chǔ)的測定方法,而且FISH技術(shù)具有獲得結(jié)果更快,可自動(dòng)讀取、保存和回顧載物片信息等優(yōu)勢[1~2]。1微生物數(shù)量信息熒光原位雜交技術(shù)(FISH)提供了考察微生物數(shù)量和特性的手段。運(yùn)用特定軟件分析處理特異性探針與微生物結(jié)合后發(fā)出的熒光,可計(jì)算出相應(yīng)微生物在活性污泥生物量中所占比例,得出系統(tǒng)中微生物的數(shù)量信息。由于FISH具有種屬特異性,只與目標(biāo)細(xì)菌的遺傳保守區(qū)———16SrRNA或23SrRNA結(jié)合,在活性污泥眾多的生物量中不會與其他微生物錯(cuò)配,通過結(jié)合的探針就可以來鑒定微生物的種類。與其他可以將微生物量化的方法(如定量PCR)相比,FISH技術(shù)可以在考察微生物群落結(jié)構(gòu)的同時(shí)反映出其數(shù)量信息。1.1fish探針的選擇背景熒光原位雜交技術(shù)是首先使核酸分子變性,再利用熒光標(biāo)記的特異寡核苷酸片段作為探針,依據(jù)堿基互補(bǔ)原理,與待測微生物基因組中DNA或RNA分子雜交,在一定激發(fā)波長的熒光顯微鏡下觀察,對待測微生物種群進(jìn)行定性和相對定量分析。其實(shí)質(zhì)是基于核酸分子的變性和選擇性退火[4~6]。雙鏈DNA或處于二級結(jié)構(gòu)的DNA分子被變性回復(fù)到單鏈、線性的形式后,與帶有互補(bǔ)的核苷酸鏈退火雜交形成雙鏈結(jié)構(gòu)。FISH技術(shù)通常選擇在系統(tǒng)發(fā)育上具有保守性的16SrRNA作為探針結(jié)合對象。因16SrRNA基因在所有細(xì)菌的染色體中都存在,而且分布廣泛、功能穩(wěn)定。16SrRNA的保守性是相對的,不同細(xì)菌的16SrRNA序列有著不同程度的差異,針對目標(biāo)微生物體內(nèi)某段有差異的序列設(shè)計(jì)出相應(yīng)的寡核苷酸探針,就可以實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)微生物的原位檢測。除了16SrRNA,FISH技術(shù)還能以23rRNA或mRNA等作為研究的目標(biāo)分子。1.2daps-pcr法:主要流程和處理法實(shí)驗(yàn)步驟主要包括以下幾個(gè)方面:(1)玻片處理及藥品配制;(2)樣品的固定;(3)樣品的預(yù)處理;(4)原位雜交;(5)漂洗去除未結(jié)合的探針;(6)DAPI染色;(7)檢測雜交信號,進(jìn)行結(jié)果分析。在SBR反應(yīng)器中去取活性污泥樣品,1000r/min離心2min取上清液,再加入磷酸鹽緩沖溶液(PBS)。8000r/min離心2min,棄上清液,再用PBS離心兩次,加入多聚甲醛(PFA),4℃固定2h。用蛋白酶K37℃消化30min,再用溶菌酶處理10min。取10ul預(yù)處理后的樣品涂于經(jīng)明膠包被的載玻片上,自然風(fēng)干后,分別用50%、80%和100%乙醇脫水,每個(gè)梯度3min。取18ul雜交緩沖液和2ul探針輕輕混合后,涂于固定有樣品的載玻片上,將玻片水平放置于雜交濕盒中,46℃避光雜交2h。雜交結(jié)束后,先用48℃預(yù)熱的清洗緩沖液沖洗玻片。然后將玻片置于清洗緩沖液中,48℃浸泡15min。取出玻片,用冰浴的DEPC水沖洗?？諝怙L(fēng)干后,用DAPI在4℃下染色30min,再用DEPC水沖洗后風(fēng)干。最后在經(jīng)過以上處理的樣品中涂上薄層的反熒光退色劑,蓋上蓋玻片,用熒光顯微鏡檢測雜交信號[10~13]。采用熒光顯微鏡設(shè)備本身自帶的圖像分析軟件對熒光原位雜交圖像結(jié)果進(jìn)行分析,每個(gè)雜交試樣觀察10個(gè)視野,以熒光面積為表征指標(biāo),分析被檢菌在全菌中的存在率。1.3優(yōu)化核苷酸雙鏈分子的形成機(jī)理由于氫鍵的微弱性,互補(bǔ)的單鏈核苷酸分子經(jīng)退火而形成核酸雙鏈分子的過程是可逆的,因此可以通過改變反應(yīng)的物理和化學(xué)條件增加核酸雙鏈分子生成的速度、程度及其穩(wěn)定性。影響兩段互補(bǔ)核苷酸鏈雜交的主要因素包括溫度、pH值、溶液中單價(jià)離子的濃度、甲酰胺濃度。1.3.1互補(bǔ)鏈的形成通常,變性的DNA與互補(bǔ)鏈雜交時(shí)的溫度略低于熔解溫度(Tm)。Tm是雙鏈DNA中有一半呈現(xiàn)單鏈時(shí)的溫度。若反應(yīng)溫度低于Tm10~15℃,堿基順序高度同源的互補(bǔ)鏈可形成穩(wěn)定的雙鏈,錯(cuò)配對減少。由于鹽和甲酰胺濃度的調(diào)節(jié)等因素的影響,實(shí)際采用的原位雜交溫度常低于Tm值約25℃,大約在30~60℃之間,根據(jù)探針的種類不同,溫度略有差異。RNA和cRNA探陣一般在37~42℃左右,EUB338探針的最適雜交溫度在42℃。而DNA探針或細(xì)胞內(nèi)靶核苷酸為DNA的,則必須在80~95℃加熱5~15min,使其變性。1.3.2不同ph值緩沖液對磷酸緩沖液ph值的影響pH值在5~9之間,復(fù)性與pH值幾乎無關(guān),但在20~50mmol/L磷酸緩沖鹽溶液中,通常選擇pH值6.5~7.5。一般來說,pH值越高,雜交條件越嚴(yán)謹(jǐn)。1.3.3鹽濃度對dna表達(dá)的影響單價(jià)陽離子如鈉離子能與核酸上帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)結(jié)合,隨著鹽濃度的升高,DNA的兩條單鏈結(jié)合的陽離子增多,相互排斥作用減小。因此,較高鹽濃度能增加雜交體的穩(wěn)定性。1.3.4降低0.32在雜交液中加入甲酰胺來降低雙鏈核酸的穩(wěn)定性,從而可以降低雜交溫度,減少形態(tài)學(xué)損傷。在雜交溶液中,甲酰胺每增加1%,雜交溫度在線性范圍內(nèi)可降低0.72℃。因此,雜交液中如果有50%的甲酰胺,則雜交反應(yīng)可以在30~45℃的范圍內(nèi)進(jìn)行,但速度較慢。原位檢測rDNA時(shí),為增強(qiáng)雜交信號,rRNA與rDNA的雜交最好在含80%甲酰胺的雜交液中進(jìn)行,雜交溫度是50~55℃。要找出最佳雜交反應(yīng)條件除了考慮上述4個(gè)主要影響因素外,還必須綜合考慮其他的影響因素,包括探針的長度和濃度、探針與靶核酸錯(cuò)配的程度、雜交后的清洗條件以及探針是雙鏈還是單鏈等。2微生物的存在方式微生物是廢水生物處理過程中的作用主體,通過新陳代謝過程,具有分解和礦化有機(jī)物的能力。處理系統(tǒng)中微生物的一般存在方式為活性污泥和生物膜。研究活性污泥及生物膜微生物生態(tài)系統(tǒng)的組成、結(jié)構(gòu)與功能,能進(jìn)一步提高微生物對有機(jī)污染物的降解能力,從而提高廢水的生物處理效率。2.1fish技術(shù)主要解決了硝化菌的培養(yǎng)硝化菌和氨氧化菌的數(shù)量及空間分布與微生物硝化循環(huán)中所處的階段相關(guān)。由于硝化細(xì)菌是一類生理上非常特殊的化能自氧菌,傳統(tǒng)的研究方法存在著缺陷。傳統(tǒng)的研究方法要經(jīng)過富集、分離、分類和鑒定步驟,耗時(shí)長,而且由于所用的培養(yǎng)基有選擇性會使某些易于培養(yǎng)的菌株超過其他硝化細(xì)菌,成為優(yōu)勢類群,因而對培養(yǎng)困難的硝化菌無法進(jìn)行研究。而FISH技術(shù)正好能解決上述問題。一些研究者早期研究了一套FISH技術(shù)來檢測菌種,但由于受到合成探針的限制,因而未能應(yīng)用到實(shí)際檢測中。隨著硝化細(xì)菌和氨氧化菌探針的不斷推出,FISH技術(shù)被廣泛應(yīng)用于污水處理系統(tǒng)中。Juretshko和Schramm等[15~17]曾對硝化流化床、普通活性污泥等工藝的活性污泥中硝化細(xì)菌的多樣性進(jìn)行了跟蹤分析,發(fā)現(xiàn)Nitrosospira、Nitrospira為優(yōu)勢菌種。2.2磷生物的多樣性FISH技術(shù)的應(yīng)用克服了以往除磷菌難于用常規(guī)方法培養(yǎng)造成的研究上的困難,并對不同條件下生物除磷工藝的改進(jìn)起到了指導(dǎo)性的作用。在利用FISH技術(shù)來研究強(qiáng)化除磷(EBPR)工藝中,無論好氧或厭氧區(qū)的活性污泥中都存在著大量豐富的除磷微生物,其中常見類群為BetProteobacteria亞類的Actinobacteria菌、GPB-HGC、Epbr15和Epbr16等?，F(xiàn)今在污水生物處理的生物學(xué)相關(guān)研究中,結(jié)合分子生物學(xué)領(lǐng)域變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術(shù),對活性污泥中混合微生物提取基因進(jìn)行電泳分離,經(jīng)測定其基因序列后,現(xiàn)已設(shè)計(jì)出一些探測常見除磷細(xì)菌的生物學(xué)探針,這就充分顯示了該技術(shù)在除磷菌研究中的直接性和高效性。3由于存在光學(xué)原聚成合技術(shù)的不足雖然FISH技術(shù)方便快捷,可迅速得出鑒定結(jié)果,但是在技術(shù)應(yīng)用上仍然存在不少問題。3.1fish檢測的假陽性3.1.1細(xì)菌熒光特性微生物的自身熒光也會干擾FISH的檢測。目前在一些細(xì)菌如假單孢菌屬、軍團(tuán)菌屬、世紀(jì)紅藍(lán)菌、藍(lán)細(xì)菌屬和古細(xì)菌如產(chǎn)甲烷菌中存在這樣的熒光特性。環(huán)境樣品中自發(fā)熒光的生物或化學(xué)殘留物總是存在于微生物周圍的胞外物質(zhì)中,這種自身熒光的特性使應(yīng)用FISH分析環(huán)境微生物變得復(fù)雜。盡管自身的背景熒光利于復(fù)染,但經(jīng)常是降低信噪比,同時(shí)掩飾了特異的熒光信號。因此,在檢測未知混合菌群時(shí)要進(jìn)行防止自身背景熒光的處理,以防止假陽性的發(fā)生。3.1.2探針的陽性對照和陰性對照FISH檢測的精確性和可靠性依賴于寡核苷酸探針的特異性,與靶序列相似的具有幾個(gè)錯(cuò)配堿基的探針也有可能與靶序列結(jié)合。因此在每次FISH檢測中都要設(shè)置陽性對照和與靶序列相似具有幾個(gè)錯(cuò)配堿基的探針作為陰性對照。另外,探針的特異性和靈敏性也取決于雜交條件、雜交和洗脫溫度、變性劑的濃度等。3.2fish檢測的假陰性3.2.1細(xì)胞內(nèi)滲透率降低細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)影響探針的穿透力,可能導(dǎo)致雜交信號強(qiáng)度降低。革蘭氏陰性菌通透性較好,即使是多聚核苷酸探針也能很好地滲透到細(xì)胞內(nèi)。革蘭氏陽性菌則必須進(jìn)行特殊的固定和前處理,以提高探針的滲透力。3.2.2設(shè)質(zhì)體的結(jié)構(gòu)由于rRNA形成三維結(jié)構(gòu),存在發(fā)夾、頸環(huán)結(jié)構(gòu)和RNA-蛋白質(zhì)的復(fù)合體,使寡核苷酸探針無法接近靶序列,阻礙了雜交,這也就是在雜交中即使將RNA或DNA變性也不能獲得理想結(jié)果的原因。探針設(shè)計(jì)不合理形成的自身退火或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也會導(dǎo)致雜交信號降低。3.2.3熒光雜交信號和定量測定菌株細(xì)菌細(xì)胞中rRNA含量對其雜交也有較大影響,不同種屬rRNA含量變化較大,即使是同一菌株的不同生理狀態(tài)其含量也不同,休眠的細(xì)胞或代謝不活躍的細(xì)胞可能導(dǎo)致熒光雜交信號減弱形成假陰性。此外,當(dāng)細(xì)胞呈現(xiàn)不規(guī)則形狀或形成鏈狀和緊密的群體時(shí),微生物的定量可能會很困難。因此最好使用狹窄波段的濾鏡和核光穩(wěn)定的熒光染料,而且防褪色的封固劑也是十分重要的[3