水環(huán)境中細菌數(shù)量的測定

水環(huán)境中細菌數(shù)量的測定

1細菌菌群、數(shù)量、分布規(guī)律及其微生物地球化學循環(huán)隨著社會經(jīng)濟的快速發(fā)展，水污染已成為世界的主要問題，給人們的生產(chǎn)和生活帶來了巨大的損害。在天然水環(huán)境中,細菌在水體及其沉積物系統(tǒng)中的污染物的遷移、循環(huán)和生物轉(zhuǎn)化及其生物成礦方面起著十分重要的作用。針對水環(huán)境中細菌菌屬、菌群、數(shù)量、分布規(guī)律及其微生物地球化學循環(huán)的研究,一直是國內(nèi)外研究的熱點。水體中細菌的菌群、數(shù)量和分布主要受到營養(yǎng)水平、溫度、光照、溶解氧、鹽分等因素的影響,如港灣(河流入?？?具有較多的營養(yǎng)物質(zhì),其水體中具有較高的細菌數(shù)。目前,水體中細菌的分布是檢測水體受污染程度的一個重要指標,而研究細菌的分布情況最重要的是對細菌數(shù)量的準確測定,這對環(huán)境評估以及實際的工程應(yīng)用有重要的意義。隨時間、空間、地域的不同,水體中的細菌菌群、數(shù)量和分布差異甚大,而不同的計數(shù)方法測定范圍、測定速度和測定結(jié)果不盡相同。因此,本文針對各種水生細菌計數(shù)方法的特點及其研究進展進行了總結(jié),并進行了對比和評價,指出未來的發(fā)展趨勢。2菌落計數(shù)可擴張法水生細菌計數(shù)方法可分為間接培養(yǎng)計數(shù)法、直接計數(shù)法。前者是通過選擇性培養(yǎng)基,在適宜的培養(yǎng)條件下對樣品中的細菌進行培養(yǎng)進行活細菌的計數(shù),主要包括平板菌落計數(shù)法、最可幾率計數(shù)法(mostprobablenumber,MPN法,亦稱為倍比稀釋法)等;而直接計數(shù)法是適時、快速、準確地測定細菌總量,主要包括光學顯微鏡、熒光顯微鏡等技術(shù)、最可幾率數(shù)-聚合酶鏈式反應(yīng)法(combinedthemostprobablenumberwithpolymerasechainreaction,MPN-PCR法)、混濁度(比濁)計數(shù)法、電阻抗法以及流式細胞儀測定法等。2.1含菌數(shù)的算法平板菌落計數(shù)法是傳統(tǒng)的細菌計數(shù)方法,可分為稀釋平板法和涂布平板法,是根據(jù)微生物在固體培養(yǎng)基上所形成的菌落是由單細胞繁殖而成的,一個菌落即代表一個單細胞。計數(shù)時,先將待測樣品準確地按比例進行一系列稀釋,再取一定量的稀釋液接種到培養(yǎng)皿中,使其均勻分布于培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基上,經(jīng)培養(yǎng)后,由單個細胞生長繁殖形成菌落,從平板上的菌落數(shù)及其稀釋倍數(shù)就可換算出樣品中的含菌數(shù)。平板菌落計數(shù)法測定的細菌數(shù)量是樣品中可培養(yǎng)細菌的數(shù)量,即活菌數(shù),研究細菌各種生理生化特性常用該法,其具有成本低廉、方法簡單、操作方便的特點。值得指出的是:該法耗時較長(多為數(shù)天),無菌操作要求嚴格,手續(xù)繁瑣,勞動強度大,測定結(jié)果受培養(yǎng)條件等因素的影響;樣品中含菌量過少時并不能代表整個樣品的含菌量情況;因培養(yǎng)法只能驗測活菌,不適用于檢測環(huán)境樣品中細菌的總量。2.2細菌數(shù)量的測定MPN法也是一種早期檢測微生物數(shù)量的方法,它是根據(jù)概率統(tǒng)計學的方法來推算水樣中某種待測菌的數(shù)量。1959年Jannasch等用這種方法來推算水體細菌的數(shù)量,其方法是:將待測水樣進行一系列的梯度稀釋后,分別吸取一定的體積于適量液體培養(yǎng)基試管中進行培養(yǎng),記錄有細菌生長的試管數(shù),查MPN表來推算水樣中活菌的數(shù)量。該法成本低廉,方法簡單,操作方便;但是耗時長,操作較為繁瑣,勞動強度大,只能用于可培養(yǎng)的細菌進行的活菌計數(shù),且基于統(tǒng)計學的計數(shù)準確度不高。2.3細菌計數(shù)法細菌計數(shù)法光學顯微鏡計數(shù)法中最常見的是血球板計數(shù)法,即用血球計數(shù)板在光學顯微鏡下進行細菌總量的直接計數(shù)(包括死菌與活菌)。該法是對血球板一定方格內(nèi)細菌統(tǒng)計計數(shù),再計算出1mL菌液所含的菌體數(shù)。實驗時,可直接蘸取少量菌懸液點在計數(shù)板上,用光學顯微鏡下觀察計數(shù),也可以在菌懸液中加入染色液(如美藍染色液),數(shù)分鐘后在光學顯微鏡下觀察計數(shù)。該方法成熟、快速,且成本低廉,操作簡單,但干擾較大,且無法區(qū)分活菌體和死菌體,常在準確度要求不高時選用。2.4功能裝置的優(yōu)點熒光顯微鏡技術(shù)的應(yīng)用使細菌的觀察、鑒定和分析進入了一個新的時代,具有快速、勞動強度小、結(jié)果穩(wěn)定、準確度高等優(yōu)點。目前,熒光顯微鏡計數(shù)法主要包括熒光染料直接計數(shù)法、熒光原位雜交計數(shù)法和熒光免疫染色計數(shù)法等。2.4.1daps法及細菌計數(shù)方法在生物染色劑中,有一類可被激發(fā)而發(fā)射熒光的染料,統(tǒng)稱為熒光染料。常見的熒光染料直接計數(shù)法有AO(acrodineorange,吖啶橙)染色法和DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole,4,6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚)染色法。熒光染料AO和DAPI可與細胞中的DNA和RNA特異結(jié)合,在特定波長光的激發(fā)下發(fā)出熒光,便于染色后的細菌在熒光顯微鏡下觀察。AO染色法最早由Fransiseo于1973年使用于天然水體中的細菌總數(shù)的計數(shù),建立了AO染色法的基本體系和步驟。1977年Hobbie等進行了改進,其操作方法是:取水樣加入甲醛固定后,以AO染色液染色,然后將細菌過濾到事先用Irgalan黑染色的孔徑為0.2μm的聚碳酸酯濾膜上,沖洗后置載玻片上,于落射光熒光顯微鏡下計數(shù),經(jīng)測量視野面積及濾膜有效面積而換算出樣品中所含細菌數(shù)量。1980年P(guān)orter等進一步改進了細菌的染色方法,用DAPI對細菌進行染色。與AO相比,DAPI的使用能夠更好地排除其它微粒的干擾,背景更清晰,使染色的效果更加專一且制片后的保存時間更長久,DIPA的這些優(yōu)越性使它在熒光染色中的應(yīng)用得到推廣。1986年,Velji等針對采集的海水、沉積物中的細菌以及海藻樣品,在Porter等的基礎(chǔ)上首先采用了超聲波對樣品進行了前處理,使其從顆粒表面解脫下來,再應(yīng)用DAPI法對海洋細菌進行直接計數(shù),得到較好效果。1987年,Arend等也運用DAPI法對淺海水界面沉積物細菌總數(shù)進行了研究,得出了細菌數(shù)量在空間和時間上的分布及活動規(guī)律,該法用于細菌計數(shù)研究已經(jīng)逐漸成熟起來。熒光染料直接計數(shù)法快速、準確、簡便,且樣品易于保存,用于水體中細菌總數(shù)測定能較好反映樣品中細菌的實際數(shù)量。國家技術(shù)監(jiān)督局已將吖啶橙染色熒光顯微鏡直接計數(shù)法(AODC)列入海洋細菌總數(shù)計數(shù)方法的國家標準,該方法也廣泛用于各種水環(huán)境細菌總數(shù)的測定。2.4.2fish的實驗研究熒光原位雜交(fluorescentinsituhybridization,FISH)技術(shù)是近年來生物學領(lǐng)域發(fā)展起來的一項新技術(shù)。該技術(shù)是用特殊的熒光素標記DNA探針,特異性地與互補核酸序列在完整的細胞內(nèi)結(jié)合,用熒光顯微鏡等熒光檢測技術(shù)進行觀察和分析。1981年,Roumam首次報道了熒光素標記的cDNA作原位雜交。近年來隨著FISH技術(shù)應(yīng)用的探針種類的不斷增多,FISH技術(shù)在細胞遺傳學和環(huán)境水體中各種細菌的檢測和分析等方面得到了廣泛應(yīng)用,其實驗方法主要包括:(1)固定標本;(2)預處理樣品;(3)用相應(yīng)的探針進行雜交;(4)洗掉未結(jié)合的探針;(5)信號的儀器(普通熒光顯微鏡、共聚焦激光掃描顯微鏡或流式細胞儀)檢測及結(jié)果分析。1996年,Wagner等較早將FISH技術(shù)應(yīng)用于硝化細菌檢測,研究了一套較完善的對硝化細菌檢測的技術(shù),從此FISH技術(shù)被廣泛地應(yīng)用于活性污泥系統(tǒng)、硝化流化床反應(yīng)器以及膜-生物反應(yīng)器等污水處理系統(tǒng)中。2003年,Satoh等在旋轉(zhuǎn)盤式生物膜法水處理裝置中研究生物膜對脫氮菌的處理機能時,采用NSO190、NIT和CNIT等探針,應(yīng)用FISH法對硝化菌進行了定量計數(shù)觀測,結(jié)果快速準確。同年,謝冰等成功應(yīng)用該法研究了活性污泥中的亞硝化細菌和硝化細菌空間上的數(shù)量分布情況,取得了滿意的結(jié)果。FISH計數(shù)法具有安全、簡便、靈敏、快速,可檢測出環(huán)境樣品中大多數(shù)的細菌,能對不同環(huán)境樣品中的細菌從系統(tǒng)發(fā)育的角度進行鑒定,尤其對水生生態(tài)系統(tǒng)中微生物菌群的系統(tǒng)發(fā)育、定性、定量檢測方面有著獨特的優(yōu)越性。但值得指出是:熒光探針價格昂貴,而且需要專業(yè)的分子生物學知識,在雜交效率、雜質(zhì)的干擾、熒光淬滅、清洗過程中的脫落等方面都可能影響觀測結(jié)果的可靠性。2.4.3熒光免疫法檢測細菌多樣性熒光免疫技術(shù)(immunofluorescencetechnique,IFT)是一種以熒光染料作為標記物的免疫分析技術(shù),隨著一系列新儀器和新方法的建立,熒光免疫技術(shù)取得了快速發(fā)展,使熒光免疫技術(shù)的標準化、定量化和自動化進入一個新的發(fā)展階段。熒光免疫計數(shù)法是利用抗原和抗體相互作用的原理,用熒光素的衍生物(如異硫氰酸熒光素,fluoresceinisothiocyanate,FITC;氨基熒光素,dichlorotriazinylaminofluorescein,DTAF等)標記特異性抗體,檢測微生物細胞上的抗原,在顯微鏡視野下進行熒光點的檢測即可得到樣品中細菌的數(shù)量,Stanley等最早應(yīng)用熒光免疫計數(shù)法直接測定細菌的數(shù)量。目前該技術(shù)主要用于沙門氏菌、李斯特菌、葡萄球菌毒素、EscherichiaColiO157和單核細胞增生李斯特氏菌等的快速檢測。1995年,朱曜使用該法快速檢測肉類、蛋類等食品中的沙門氏菌,取得很好效果。2002年,Yu等應(yīng)用時間分辨熒光免疫法檢測蘋果酒中EscherichiaColiO157∶H7,建立了檢測的實驗方法,具有較好的靈敏度和特異性。IFT計數(shù)法操作快速、簡便、特異性高、非特異性熒光干擾因素少,結(jié)果穩(wěn)定且準確度高,但敏感度偏低,專一性強,每檢查一種抗原需制備相應(yīng)的特異性熒光抗體,加之由于天然水樣品中細菌并不是都能與之相結(jié)合,不適宜于天然水樣品中細菌總數(shù)的測定(含有多個細菌種群)。2.5ssr法測定細菌數(shù)量近年來,由于分子生物學的發(fā)展,提出了PCR技術(shù)和MPN聯(lián)用技術(shù)進行細菌數(shù)量測定的新方法,稱為MPN-PCR法。PCR法是一種在體外快速擴增微量靶DNA的技術(shù),目前已廣泛地用檢測水體及土壤中的微生物,其方法為:對抽提的總DNA溶液進行10倍梯度稀釋,選取不同稀釋度的樣品分別進行PCR反應(yīng),根據(jù)擴增產(chǎn)物的電泳結(jié)果來計數(shù)各樣品的陽性反應(yīng)數(shù),再從MPN表中查出細菌的相應(yīng)近似值,即可推算單位水樣中細菌的數(shù)量。1997年,M?ntynen等采用MPN-PCR法對新鮮奶酪中產(chǎn)腸毒素C的金黃色葡萄球菌進行了計數(shù),對該法的步驟進行了系統(tǒng)的闡述,并指出了該法的應(yīng)用前景,結(jié)果也比較令人滿意。2002年,明鎮(zhèn)寰等對該法進一步完善,從生物硝化池污水中快速抽提模板DNA的方法,快速、靈敏、穩(wěn)定地定量測定了生物硝化池中硝化細菌的數(shù)量,確定了該法的各種條件,并和MPN-Griess法進行了比較,突出了該法在細菌數(shù)量測定上的優(yōu)越性。2007年,魏利等利用MPN-PCR法研究了油田硫酸鹽還原菌進行快速定量檢測方法,也取得了滿意的結(jié)果,并指出該法在生產(chǎn)中應(yīng)用的重大意義。MPN-PCR法快速且靈敏度高,可對同種細菌的不同類群進行檢測,檢測結(jié)果穩(wěn)定且準確,對實現(xiàn)水體中細菌進行實時監(jiān)控提供了可能;但該法成本相對偏高,操作條件嚴格,專業(yè)性強,對于某一特定細菌的檢測需要合成特定引物。2.6細菌懸浮液標準溶液法其原理是:在一定波長范圍內(nèi),菌懸液中的細胞濃度與混濁度(即光吸收值,OD)成正比。其實驗方法是:首先配成系列不同濃度的細菌懸浮液標準溶液,采用分光光度計測定相應(yīng)的OD值,獲取菌液濃度與OD值標準曲線,確定OD與細菌數(shù)目的關(guān)系即可實現(xiàn)水樣品中細菌數(shù)量?；鞚岫扔嫈?shù)法快速,操作簡單,不受時間和其他因素的限制,但該法測得的是細菌總量,無法區(qū)分死活菌體。應(yīng)當指出的是:該法受培養(yǎng)基固體顆粒物及細菌代謝產(chǎn)物性質(zhì)的影響較大,對某一種細菌也無專一性及針對性,可能導致測定結(jié)果偏高。2.7培養(yǎng)基電特性與細菌初始菌量的關(guān)系該法是通過測量細菌代謝引起的培養(yǎng)基電特性變化來測定樣品微生物含量的一種快速檢測方法。微生物在培養(yǎng)過程中,由于新陳代謝,使培養(yǎng)基中的大分子的電惰性物質(zhì),如碳水化合物、類脂、蛋白質(zhì)等,轉(zhuǎn)化為小分子的電活性物質(zhì),如乳酸鹽、醋酸鹽、重碳酸鹽等,使導電性增強,電阻抗降低。研究表明,電導率隨時間的變化曲線與細菌生長曲線相似,出現(xiàn)緩慢增長期、加速增長期、指數(shù)增長期和緩慢減少期,最后趨于穩(wěn)定期。細菌起始數(shù)量不同,出現(xiàn)指數(shù)增長期的時間也不同,通過建立二者之間的關(guān)系,就能通過檢測培養(yǎng)基電特性變化推演出微生物的原始菌量。電阻抗法可采用自動連續(xù)性檢測,能同時檢測多個樣品的含菌量,具有在線快速、準確的特點,具有較好的應(yīng)用前景。但該法成本相對偏高,受培養(yǎng)基變化等干擾因素影響也較大,且無法區(qū)分碎片和細胞。2.8數(shù)字化定量分析技術(shù)流式細胞術(shù)(flowcytometry,FCM)是二十世紀70年代發(fā)展起來的一種以流式細胞儀為工具,能快速測量細胞的物理或化學性質(zhì),如大小、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、DNA、RNA、蛋白質(zhì)、抗原等,并可對其分類、收集的高新技術(shù)。其原理是:經(jīng)熒光染料標記過的細胞樣品制成單細胞懸液,以一定的流速經(jīng)過噴嘴到達光源發(fā)出的激光形成的聚焦區(qū)時,標記的熒光染料在激發(fā)光的激發(fā)下發(fā)射出特異顏色的熒光信號和散射光信號,信號的強弱與細胞內(nèi)待測組分的含量呈正比,經(jīng)光電信號轉(zhuǎn)換,即可實現(xiàn)數(shù)字化定量分析。1983年,Yentsch等較早地將流式細胞術(shù)用于浮游植物的研究,對海洋中微生物粒徑進行了劃分并闡述其分析方法,這對流式細胞儀應(yīng)用于海洋微型浮游植物研究起了積極的推動作用。1999年,Tanrran等利用顯微鏡和流式細胞儀相結(jié)合的方法分別測定了阿拉伯海多個站點在季風期間的浮游植物的生物量和群落結(jié)構(gòu),分析了季風期間水流對浮游植物分布的影響。同年,Gin等利用流式細胞儀調(diào)查了百慕大大西洋不同季節(jié)細菌和浮游植物的大小及生物量,得出一年中不同季節(jié)中細菌和浮游植物的水平變化和垂直變化規(guī)律。近十來年,流式細胞儀在海洋調(diào)查中的應(yīng)用,使得細菌數(shù)量測定的準確性有了很大的提高,已成為水生生態(tài)系統(tǒng)中細菌數(shù)量測定的標準方法之一。流式細胞術(shù)的應(yīng)用范圍廣,凡能被熒光分子標記的細胞或微粒均能用流式細胞儀檢測,對水生細菌計數(shù)測定具有明顯的優(yōu)勢。該法測定過程干擾小、區(qū)分度好、簡便快速、結(jié)果準確可靠,并具備多參數(shù)測定的優(yōu)點并能兼容其他分子生物學測定