水環(huán)境中細(xì)菌數(shù)量的測(cè)定

水環(huán)境中細(xì)菌數(shù)量的測(cè)定

1細(xì)菌菌群、數(shù)量、分布規(guī)律及其微生物地球化學(xué)循環(huán)隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，水污染已成為世界的主要問(wèn)題，給人們的生產(chǎn)和生活帶來(lái)了巨大的損害。在天然水環(huán)境中,細(xì)菌在水體及其沉積物系統(tǒng)中的污染物的遷移、循環(huán)和生物轉(zhuǎn)化及其生物成礦方面起著十分重要的作用。針對(duì)水環(huán)境中細(xì)菌菌屬、菌群、數(shù)量、分布規(guī)律及其微生物地球化學(xué)循環(huán)的研究,一直是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。水體中細(xì)菌的菌群、數(shù)量和分布主要受到營(yíng)養(yǎng)水平、溫度、光照、溶解氧、鹽分等因素的影響,如港灣(河流入?？?具有較多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),其水體中具有較高的細(xì)菌數(shù)。目前,水體中細(xì)菌的分布是檢測(cè)水體受污染程度的一個(gè)重要指標(biāo),而研究細(xì)菌的分布情況最重要的是對(duì)細(xì)菌數(shù)量的準(zhǔn)確測(cè)定,這對(duì)環(huán)境評(píng)估以及實(shí)際的工程應(yīng)用有重要的意義。隨時(shí)間、空間、地域的不同,水體中的細(xì)菌菌群、數(shù)量和分布差異甚大,而不同的計(jì)數(shù)方法測(cè)定范圍、測(cè)定速度和測(cè)定結(jié)果不盡相同。因此,本文針對(duì)各種水生細(xì)菌計(jì)數(shù)方法的特點(diǎn)及其研究進(jìn)展進(jìn)行了總結(jié),并進(jìn)行了對(duì)比和評(píng)價(jià),指出未來(lái)的發(fā)展趨勢(shì)。2菌落計(jì)數(shù)可擴(kuò)張法水生細(xì)菌計(jì)數(shù)方法可分為間接培養(yǎng)計(jì)數(shù)法、直接計(jì)數(shù)法。前者是通過(guò)選擇性培養(yǎng)基,在適宜的培養(yǎng)條件下對(duì)樣品中的細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)進(jìn)行活細(xì)菌的計(jì)數(shù),主要包括平板菌落計(jì)數(shù)法、最可幾率計(jì)數(shù)法(mostprobablenumber,MPN法,亦稱為倍比稀釋法)等;而直接計(jì)數(shù)法是適時(shí)、快速、準(zhǔn)確地測(cè)定細(xì)菌總量,主要包括光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡等技術(shù)、最可幾率數(shù)-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(combinedthemostprobablenumberwithpolymerasechainreaction,MPN-PCR法)、混濁度(比濁)計(jì)數(shù)法、電阻抗法以及流式細(xì)胞儀測(cè)定法等。2.1含菌數(shù)的算法平板菌落計(jì)數(shù)法是傳統(tǒng)的細(xì)菌計(jì)數(shù)方法,可分為稀釋平板法和涂布平板法,是根據(jù)微生物在固體培養(yǎng)基上所形成的菌落是由單細(xì)胞繁殖而成的,一個(gè)菌落即代表一個(gè)單細(xì)胞。計(jì)數(shù)時(shí),先將待測(cè)樣品準(zhǔn)確地按比例進(jìn)行一系列稀釋,再取一定量的稀釋液接種到培養(yǎng)皿中,使其均勻分布于培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基上,經(jīng)培養(yǎng)后,由單個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖形成菌落,從平板上的菌落數(shù)及其稀釋倍數(shù)就可換算出樣品中的含菌數(shù)。平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定的細(xì)菌數(shù)量是樣品中可培養(yǎng)細(xì)菌的數(shù)量,即活菌數(shù),研究細(xì)菌各種生理生化特性常用該法,其具有成本低廉、方法簡(jiǎn)單、操作方便的特點(diǎn)。值得指出的是:該法耗時(shí)較長(zhǎng)(多為數(shù)天),無(wú)菌操作要求嚴(yán)格,手續(xù)繁瑣,勞動(dòng)強(qiáng)度大,測(cè)定結(jié)果受培養(yǎng)條件等因素的影響;樣品中含菌量過(guò)少時(shí)并不能代表整個(gè)樣品的含菌量情況;因培養(yǎng)法只能驗(yàn)測(cè)活菌,不適用于檢測(cè)環(huán)境樣品中細(xì)菌的總量。2.2細(xì)菌數(shù)量的測(cè)定MPN法也是一種早期檢測(cè)微生物數(shù)量的方法,它是根據(jù)概率統(tǒng)計(jì)學(xué)的方法來(lái)推算水樣中某種待測(cè)菌的數(shù)量。1959年Jannasch等用這種方法來(lái)推算水體細(xì)菌的數(shù)量,其方法是:將待測(cè)水樣進(jìn)行一系列的梯度稀釋后,分別吸取一定的體積于適量液體培養(yǎng)基試管中進(jìn)行培養(yǎng),記錄有細(xì)菌生長(zhǎng)的試管數(shù),查MPN表來(lái)推算水樣中活菌的數(shù)量。該法成本低廉,方法簡(jiǎn)單,操作方便;但是耗時(shí)長(zhǎng),操作較為繁瑣,勞動(dòng)強(qiáng)度大,只能用于可培養(yǎng)的細(xì)菌進(jìn)行的活菌計(jì)數(shù),且基于統(tǒng)計(jì)學(xué)的計(jì)數(shù)準(zhǔn)確度不高。2.3細(xì)菌計(jì)數(shù)法細(xì)菌計(jì)數(shù)法光學(xué)顯微鏡計(jì)數(shù)法中最常見(jiàn)的是血球板計(jì)數(shù)法,即用血球計(jì)數(shù)板在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行細(xì)菌總量的直接計(jì)數(shù)(包括死菌與活菌)。該法是對(duì)血球板一定方格內(nèi)細(xì)菌統(tǒng)計(jì)計(jì)數(shù),再計(jì)算出1mL菌液所含的菌體數(shù)。實(shí)驗(yàn)時(shí),可直接蘸取少量菌懸液點(diǎn)在計(jì)數(shù)板上,用光學(xué)顯微鏡下觀察計(jì)數(shù),也可以在菌懸液中加入染色液(如美藍(lán)染色液),數(shù)分鐘后在光學(xué)顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)。該方法成熟、快速,且成本低廉,操作簡(jiǎn)單,但干擾較大,且無(wú)法區(qū)分活菌體和死菌體,常在準(zhǔn)確度要求不高時(shí)選用。2.4功能裝置的優(yōu)點(diǎn)熒光顯微鏡技術(shù)的應(yīng)用使細(xì)菌的觀察、鑒定和分析進(jìn)入了一個(gè)新的時(shí)代,具有快速、勞動(dòng)強(qiáng)度小、結(jié)果穩(wěn)定、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)。目前,熒光顯微鏡計(jì)數(shù)法主要包括熒光染料直接計(jì)數(shù)法、熒光原位雜交計(jì)數(shù)法和熒光免疫染色計(jì)數(shù)法等。2.4.1daps法及細(xì)菌計(jì)數(shù)方法在生物染色劑中,有一類可被激發(fā)而發(fā)射熒光的染料,統(tǒng)稱為熒光染料。常見(jiàn)的熒光染料直接計(jì)數(shù)法有AO(acrodineorange,吖啶橙)染色法和DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole,4,6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚)染色法。熒光染料AO和DAPI可與細(xì)胞中的DNA和RNA特異結(jié)合,在特定波長(zhǎng)光的激發(fā)下發(fā)出熒光,便于染色后的細(xì)菌在熒光顯微鏡下觀察。AO染色法最早由Fransiseo于1973年使用于天然水體中的細(xì)菌總數(shù)的計(jì)數(shù),建立了AO染色法的基本體系和步驟。1977年Hobbie等進(jìn)行了改進(jìn),其操作方法是:取水樣加入甲醛固定后,以AO染色液染色,然后將細(xì)菌過(guò)濾到事先用Irgalan黑染色的孔徑為0.2μm的聚碳酸酯濾膜上,沖洗后置載玻片上,于落射光熒光顯微鏡下計(jì)數(shù),經(jīng)測(cè)量視野面積及濾膜有效面積而換算出樣品中所含細(xì)菌數(shù)量。1980年P(guān)orter等進(jìn)一步改進(jìn)了細(xì)菌的染色方法,用DAPI對(duì)細(xì)菌進(jìn)行染色。與AO相比,DAPI的使用能夠更好地排除其它微粒的干擾,背景更清晰,使染色的效果更加專一且制片后的保存時(shí)間更長(zhǎng)久,DIPA的這些優(yōu)越性使它在熒光染色中的應(yīng)用得到推廣。1986年,Velji等針對(duì)采集的海水、沉積物中的細(xì)菌以及海藻樣品,在Porter等的基礎(chǔ)上首先采用了超聲波對(duì)樣品進(jìn)行了前處理,使其從顆粒表面解脫下來(lái),再應(yīng)用DAPI法對(duì)海洋細(xì)菌進(jìn)行直接計(jì)數(shù),得到較好效果。1987年,Arend等也運(yùn)用DAPI法對(duì)淺海水界面沉積物細(xì)菌總數(shù)進(jìn)行了研究,得出了細(xì)菌數(shù)量在空間和時(shí)間上的分布及活動(dòng)規(guī)律,該法用于細(xì)菌計(jì)數(shù)研究已經(jīng)逐漸成熟起來(lái)。熒光染料直接計(jì)數(shù)法快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便,且樣品易于保存,用于水體中細(xì)菌總數(shù)測(cè)定能較好反映樣品中細(xì)菌的實(shí)際數(shù)量。國(guó)家技術(shù)監(jiān)督局已將吖啶橙染色熒光顯微鏡直接計(jì)數(shù)法(AODC)列入海洋細(xì)菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn),該方法也廣泛用于各種水環(huán)境細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定。2.4.2fish的實(shí)驗(yàn)研究熒光原位雜交(fluorescentinsituhybridization,FISH)技術(shù)是近年來(lái)生物學(xué)領(lǐng)域發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新技術(shù)。該技術(shù)是用特殊的熒光素標(biāo)記DNA探針,特異性地與互補(bǔ)核酸序列在完整的細(xì)胞內(nèi)結(jié)合,用熒光顯微鏡等熒光檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行觀察和分析。1981年,Roumam首次報(bào)道了熒光素標(biāo)記的cDNA作原位雜交。近年來(lái)隨著FISH技術(shù)應(yīng)用的探針?lè)N類的不斷增多,FISH技術(shù)在細(xì)胞遺傳學(xué)和環(huán)境水體中各種細(xì)菌的檢測(cè)和分析等方面得到了廣泛應(yīng)用,其實(shí)驗(yàn)方法主要包括:(1)固定標(biāo)本;(2)預(yù)處理樣品;(3)用相應(yīng)的探針進(jìn)行雜交;(4)洗掉未結(jié)合的探針;(5)信號(hào)的儀器(普通熒光顯微鏡、共聚焦激光掃描顯微鏡或流式細(xì)胞儀)檢測(cè)及結(jié)果分析。1996年,Wagner等較早將FISH技術(shù)應(yīng)用于硝化細(xì)菌檢測(cè),研究了一套較完善的對(duì)硝化細(xì)菌檢測(cè)的技術(shù),從此FISH技術(shù)被廣泛地應(yīng)用于活性污泥系統(tǒng)、硝化流化床反應(yīng)器以及膜-生物反應(yīng)器等污水處理系統(tǒng)中。2003年,Satoh等在旋轉(zhuǎn)盤式生物膜法水處理裝置中研究生物膜對(duì)脫氮菌的處理機(jī)能時(shí),采用NSO190、NIT和CNIT等探針,應(yīng)用FISH法對(duì)硝化菌進(jìn)行了定量計(jì)數(shù)觀測(cè),結(jié)果快速準(zhǔn)確。同年,謝冰等成功應(yīng)用該法研究了活性污泥中的亞硝化細(xì)菌和硝化細(xì)菌空間上的數(shù)量分布情況,取得了滿意的結(jié)果。FISH計(jì)數(shù)法具有安全、簡(jiǎn)便、靈敏、快速,可檢測(cè)出環(huán)境樣品中大多數(shù)的細(xì)菌,能對(duì)不同環(huán)境樣品中的細(xì)菌從系統(tǒng)發(fā)育的角度進(jìn)行鑒定,尤其對(duì)水生生態(tài)系統(tǒng)中微生物菌群的系統(tǒng)發(fā)育、定性、定量檢測(cè)方面有著獨(dú)特的優(yōu)越性。但值得指出是:熒光探針價(jià)格昂貴,而且需要專業(yè)的分子生物學(xué)知識(shí),在雜交效率、雜質(zhì)的干擾、熒光淬滅、清洗過(guò)程中的脫落等方面都可能影響觀測(cè)結(jié)果的可靠性。2.4.3熒光免疫法檢測(cè)細(xì)菌多樣性熒光免疫技術(shù)(immunofluorescencetechnique,IFT)是一種以熒光染料作為標(biāo)記物的免疫分析技術(shù),隨著一系列新儀器和新方法的建立,熒光免疫技術(shù)取得了快速發(fā)展,使熒光免疫技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化、定量化和自動(dòng)化進(jìn)入一個(gè)新的發(fā)展階段。熒光免疫計(jì)數(shù)法是利用抗原和抗體相互作用的原理,用熒光素的衍生物(如異硫氰酸熒光素,fluoresceinisothiocyanate,FITC;氨基熒光素,dichlorotriazinylaminofluorescein,DTAF等)標(biāo)記特異性抗體,檢測(cè)微生物細(xì)胞上的抗原,在顯微鏡視野下進(jìn)行熒光點(diǎn)的檢測(cè)即可得到樣品中細(xì)菌的數(shù)量,Stanley等最早應(yīng)用熒光免疫計(jì)數(shù)法直接測(cè)定細(xì)菌的數(shù)量。目前該技術(shù)主要用于沙門氏菌、李斯特菌、葡萄球菌毒素、EscherichiaColiO157和單核細(xì)胞增生李斯特氏菌等的快速檢測(cè)。1995年,朱曜使用該法快速檢測(cè)肉類、蛋類等食品中的沙門氏菌,取得很好效果。2002年,Yu等應(yīng)用時(shí)間分辨熒光免疫法檢測(cè)蘋果酒中EscherichiaColiO157∶H7,建立了檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)方法,具有較好的靈敏度和特異性。IFT計(jì)數(shù)法操作快速、簡(jiǎn)便、特異性高、非特異性熒光干擾因素少,結(jié)果穩(wěn)定且準(zhǔn)確度高,但敏感度偏低,專一性強(qiáng),每檢查一種抗原需制備相應(yīng)的特異性熒光抗體,加之由于天然水樣品中細(xì)菌并不是都能與之相結(jié)合,不適宜于天然水樣品中細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定(含有多個(gè)細(xì)菌種群)。2.5ssr法測(cè)定細(xì)菌數(shù)量近年來(lái),由于分子生物學(xué)的發(fā)展,提出了PCR技術(shù)和MPN聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行細(xì)菌數(shù)量測(cè)定的新方法,稱為MPN-PCR法。PCR法是一種在體外快速擴(kuò)增微量靶DNA的技術(shù),目前已廣泛地用檢測(cè)水體及土壤中的微生物,其方法為:對(duì)抽提的總DNA溶液進(jìn)行10倍梯度稀釋,選取不同稀釋度的樣品分別進(jìn)行PCR反應(yīng),根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果來(lái)計(jì)數(shù)各樣品的陽(yáng)性反應(yīng)數(shù),再?gòu)腗PN表中查出細(xì)菌的相應(yīng)近似值,即可推算單位水樣中細(xì)菌的數(shù)量。1997年,M?ntynen等采用MPN-PCR法對(duì)新鮮奶酪中產(chǎn)腸毒素C的金黃色葡萄球菌進(jìn)行了計(jì)數(shù),對(duì)該法的步驟進(jìn)行了系統(tǒng)的闡述,并指出了該法的應(yīng)用前景,結(jié)果也比較令人滿意。2002年,明鎮(zhèn)寰等對(duì)該法進(jìn)一步完善,從生物硝化池污水中快速抽提模板DNA的方法,快速、靈敏、穩(wěn)定地定量測(cè)定了生物硝化池中硝化細(xì)菌的數(shù)量,確定了該法的各種條件,并和MPN-Griess法進(jìn)行了比較,突出了該法在細(xì)菌數(shù)量測(cè)定上的優(yōu)越性。2007年,魏利等利用MPN-PCR法研究了油田硫酸鹽還原菌進(jìn)行快速定量檢測(cè)方法,也取得了滿意的結(jié)果,并指出該法在生產(chǎn)中應(yīng)用的重大意義。MPN-PCR法快速且靈敏度高,可對(duì)同種細(xì)菌的不同類群進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定且準(zhǔn)確,對(duì)實(shí)現(xiàn)水體中細(xì)菌進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控提供了可能;但該法成本相對(duì)偏高,操作條件嚴(yán)格,專業(yè)性強(qiáng),對(duì)于某一特定細(xì)菌的檢測(cè)需要合成特定引物。2.6細(xì)菌懸浮液標(biāo)準(zhǔn)溶液法其原理是:在一定波長(zhǎng)范圍內(nèi),菌懸液中的細(xì)胞濃度與混濁度(即光吸收值,OD)成正比。其實(shí)驗(yàn)方法是:首先配成系列不同濃度的細(xì)菌懸浮液標(biāo)準(zhǔn)溶液,采用分光光度計(jì)測(cè)定相應(yīng)的OD值,獲取菌液濃度與OD值標(biāo)準(zhǔn)曲線,確定OD與細(xì)菌數(shù)目的關(guān)系即可實(shí)現(xiàn)水樣品中細(xì)菌數(shù)量。混濁度計(jì)數(shù)法快速,操作簡(jiǎn)單,不受時(shí)間和其他因素的限制,但該法測(cè)得的是細(xì)菌總量,無(wú)法區(qū)分死活菌體。應(yīng)當(dāng)指出的是:該法受培養(yǎng)基固體顆粒物及細(xì)菌代謝產(chǎn)物性質(zhì)的影響較大,對(duì)某一種細(xì)菌也無(wú)專一性及針對(duì)性,可能導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果偏高。2.7培養(yǎng)基電特性與細(xì)菌初始菌量的關(guān)系該法是通過(guò)測(cè)量細(xì)菌代謝引起的培養(yǎng)基電特性變化來(lái)測(cè)定樣品微生物含量的一種快速檢測(cè)方法。微生物在培養(yǎng)過(guò)程中,由于新陳代謝,使培養(yǎng)基中的大分子的電惰性物質(zhì),如碳水化合物、類脂、蛋白質(zhì)等,轉(zhuǎn)化為小分子的電活性物質(zhì),如乳酸鹽、醋酸鹽、重碳酸鹽等,使導(dǎo)電性增強(qiáng),電阻抗降低。研究表明,電導(dǎo)率隨時(shí)間的變化曲線與細(xì)菌生長(zhǎng)曲線相似,出現(xiàn)緩慢增長(zhǎng)期、加速增長(zhǎng)期、指數(shù)增長(zhǎng)期和緩慢減少期,最后趨于穩(wěn)定期。細(xì)菌起始數(shù)量不同,出現(xiàn)指數(shù)增長(zhǎng)期的時(shí)間也不同,通過(guò)建立二者之間的關(guān)系,就能通過(guò)檢測(cè)培養(yǎng)基電特性變化推演出微生物的原始菌量。電阻抗法可采用自動(dòng)連續(xù)性檢測(cè),能同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品的含菌量,具有在線快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn),具有較好的應(yīng)用前景。但該法成本相對(duì)偏高,受培養(yǎng)基變化等干擾因素影響也較大,且無(wú)法區(qū)分碎片和細(xì)胞。2.8數(shù)字化定量分析技術(shù)流式細(xì)胞術(shù)(flowcytometry,FCM)是二十世紀(jì)70年代發(fā)展起來(lái)的一種以流式細(xì)胞儀為工具,能快速測(cè)量細(xì)胞的物理或化學(xué)性質(zhì),如大小、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、DNA、RNA、蛋白質(zhì)、抗原等,并可對(duì)其分類、收集的高新技術(shù)。其原理是:經(jīng)熒光染料標(biāo)記過(guò)的細(xì)胞樣品制成單細(xì)胞懸液,以一定的流速經(jīng)過(guò)噴嘴到達(dá)光源發(fā)出的激光形成的聚焦區(qū)時(shí),標(biāo)記的熒光染料在激發(fā)光的激發(fā)下發(fā)射出特異顏色的熒光信號(hào)和散射光信號(hào),信號(hào)的強(qiáng)弱與細(xì)胞內(nèi)待測(cè)組分的含量呈正比,經(jīng)光電信號(hào)轉(zhuǎn)換,即可實(shí)現(xiàn)數(shù)字化定量分析。1983年,Yentsch等較早地將流式細(xì)胞術(shù)用于浮游植物的研究,對(duì)海洋中微生物粒徑進(jìn)行了劃分并闡述其分析方法,這對(duì)流式細(xì)胞儀應(yīng)用于海洋微型浮游植物研究起了積極的推動(dòng)作用。1999年,Tanrran等利用顯微鏡和流式細(xì)胞儀相結(jié)合的方法分別測(cè)定了阿拉伯海多個(gè)站點(diǎn)在季風(fēng)期間的浮游植物的生物量和群落結(jié)構(gòu),分析了季風(fēng)期間水流對(duì)浮游植物分布的影響。同年,Gin等利用流式細(xì)胞儀調(diào)查了百慕大大西洋不同季節(jié)細(xì)菌和浮游植物的大小及生物量,得出一年中不同季節(jié)中細(xì)菌和浮游植物的水平變化和垂直變化規(guī)律。近十來(lái)年,流式細(xì)胞儀在海洋調(diào)查中的應(yīng)用,使得細(xì)菌數(shù)量測(cè)定的準(zhǔn)確性有了很大的提高,已成為水生生態(tài)系統(tǒng)中細(xì)菌數(shù)量測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)方法之一。流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用范圍廣,凡能被熒光分子標(biāo)記的細(xì)胞或微粒均能用流式細(xì)胞儀檢測(cè),對(duì)水生細(xì)菌計(jì)數(shù)測(cè)定具有明顯的優(yōu)勢(shì)。該法測(cè)定過(guò)程干擾小、區(qū)分度好、簡(jiǎn)便快速、結(jié)果準(zhǔn)確可靠,并具備多參數(shù)測(cè)定的優(yōu)點(diǎn)并能兼容其他分子生物學(xué)測(cè)定