土壤微生物群落多樣性解析技術(shù)研究進(jìn)展

土壤微生物群落多樣性解析技術(shù)研究進(jìn)展

很豐富的微生物存在在土壤中。據(jù)估計(jì)，1克土壤中大約有1000萬(wàn)類型的微生物。以群落的形式存在于土壤中的微生物不僅是土壤養(yǎng)分和有機(jī)質(zhì)循環(huán)和轉(zhuǎn)化的動(dòng)力,而且也影響著土壤的結(jié)構(gòu)、土壤肥力以及地上植物的健康等。另外,土壤微生物也是一個(gè)相當(dāng)大的地下能源寶庫(kù),世界的可持續(xù)發(fā)展以及未來(lái)能源問(wèn)題的解決都離不開土壤微生物。因此,土壤微生物系統(tǒng)越來(lái)越成為當(dāng)代最前沿的研究?jī)?nèi)容之一。土壤微生物研究中非常重要的研究?jī)?nèi)容之一就是土壤微生物群落多樣性的研究。通過(guò)土壤微生物多樣性的研究不僅可以預(yù)測(cè)土壤養(yǎng)分和環(huán)境質(zhì)量的變化,而且還可以認(rèn)識(shí)和掌握在土壤微生物生態(tài)中起重要作用的微生物類群和他們的功能角色。土壤微生物群落多樣性主要研究土壤環(huán)境中微生物種群的種類、豐度、分布均勻性、結(jié)構(gòu)變化和微生物群落的功能多樣性等。在過(guò)去的40多年里,土壤微生物多樣性的研究方法已經(jīng)從傳統(tǒng)的培養(yǎng)分離發(fā)展到了無(wú)需培養(yǎng)的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)。為了更好地了解和把握這些技術(shù)和方法,本文將簡(jiǎn)要地綜述他們的原理,優(yōu)缺點(diǎn)以及在土壤微生物多樣性解析中的應(yīng)用,并且展望這些技術(shù)的發(fā)展方向。1生物酶活性的檢測(cè)這部分主要包括以培養(yǎng)為主的平板計(jì)數(shù)和形態(tài)分析、以檢測(cè)微生物酶活性的群落水平生理學(xué)指紋分析以及以微生物細(xì)胞內(nèi)生化成分為分析指標(biāo)的生物標(biāo)記法。1.1計(jì)數(shù)、生理生化特性在20個(gè)世紀(jì)70年代以前,土壤微生物多樣性解析技術(shù)主要依靠細(xì)胞的培養(yǎng)分離和形態(tài)分析,即通過(guò)人工配制的簡(jiǎn)單營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)對(duì)土壤中的微生物進(jìn)行定時(shí)定溫培養(yǎng),然后對(duì)生長(zhǎng)的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)、并通過(guò)形態(tài)構(gòu)造和生理生化特性來(lái)鑒定種屬。該方法直觀快捷,而且可以提供具有代謝活性、異養(yǎng)類型等種群信息。然而,微生物在實(shí)際土壤生境中的生長(zhǎng)與溫度、pH值、養(yǎng)分和種間的相互作用有很大關(guān)系,簡(jiǎn)單的人工模擬環(huán)境是無(wú)法滿足其生長(zhǎng)要求的。因此,這種方法僅能培養(yǎng)出極少數(shù)(少于1%)的微生物。Torsvik等利用染色法在熒光顯微鏡下觀察到1g(干重)土壤中含有4.2×1010個(gè)細(xì)菌細(xì)胞,而在培養(yǎng)平板上僅有4.2×106個(gè)細(xì)菌菌落形成(CFU)。1.2功能多樣性和種群結(jié)構(gòu)這個(gè)技術(shù)主要是基于某一微生物群落所含有的酶可催化利用特定的碳源基質(zhì),然后通過(guò)測(cè)定其利用能力和模式來(lái)評(píng)價(jià)微生物種群多樣性。Garlan和Mills于1991年首次提出該技術(shù),經(jīng)BIOLOG公司商業(yè)化后在土壤微生物群落功能多樣性的評(píng)價(jià)研究中得到了廣泛的應(yīng)用。如,Derry等利用BIOLOG系統(tǒng)分別研究了雜酚油污染土壤和北極土壤中微生物的功能多樣性和種群結(jié)構(gòu);李云等利用BIOLOG生態(tài)測(cè)試微平板研究了氣候?qū)档刈仙廖⑸锕δ芏鄻有缘拈L(zhǎng)期影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)中亞熱帶氣候的紫色土壤微生物對(duì)含C化合物的利用能力強(qiáng),而暖溫帶氣候的紫色土壤微生物對(duì)含N化合物的利用能力強(qiáng)。BIOLOG公司根據(jù)不同的檢測(cè)目的開發(fā)了ECO(生態(tài)板)、GP(革蘭氏陽(yáng)性板)、GN(革蘭氏陰性板)、FF(絲狀真菌板)和MT等一系列微平板。每個(gè)平板上有96個(gè)微井,其中95個(gè)微井的干膜上都含有碳源基質(zhì)和氧化還原染料,一個(gè)不含碳源的微井用作對(duì)照。當(dāng)微生物利用碳源進(jìn)行呼吸時(shí)釋放出的NADH還原染料并使其變色,然后通過(guò)測(cè)定氧化還原燃料的變色速率來(lái)推測(cè)微生物的呼吸速率,最終達(dá)到評(píng)價(jià)能利用碳源基質(zhì)的微生物種類和利用程度的目的。MT微平板上只含染料不含基質(zhì),允許科研人員自行設(shè)計(jì)和檢測(cè)不同的碳源基質(zhì)。該方法具有自動(dòng)化程度高,檢測(cè)速度快等優(yōu)點(diǎn)。然而,BIOLOG系統(tǒng)僅限于檢測(cè)那些可培養(yǎng)、能迅速生長(zhǎng)的微生物。檢測(cè)結(jié)構(gòu)并不能完全代表原位的代謝多樣性。另外,樣本處理、培養(yǎng)條件和微平板應(yīng)用類型等都會(huì)給微生物多樣性評(píng)價(jià)帶來(lái)誤差。1.3土壤微生物多樣性分析生物標(biāo)記法主要是利用微生物細(xì)胞內(nèi)某種生化成分的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)來(lái)區(qū)別微生物種類。這種方法避免了傳統(tǒng)培養(yǎng)法的缺陷,能比較客觀地評(píng)價(jià)微生物多樣性。方法的主要步驟是通過(guò)提取土壤微生物中的某種生化成分并純化,然后利用氣、液相色譜等化學(xué)手段對(duì)該種化學(xué)成分進(jìn)行分類鑒定。常用的微生物多樣性生物標(biāo)記法有:磷脂脂肪酸分析法和呼吸醌指紋法。1.3.1鹽堿地微生物多樣性磷脂是所有生物活細(xì)胞重要的膜組分。在正常生理?xiàng)l件下,磷脂中的長(zhǎng)鏈成分———PLFA在細(xì)胞內(nèi)的含量一定而且具有生物特異性,故PLFA可用作微生物群落分析標(biāo)記物。磷脂隨著細(xì)胞的死亡而很快分解,PLFA總含量可以用來(lái)表征活性微生物的生物量。通過(guò)從土壤中提取PLFA并且測(cè)量其種類和豐度來(lái)判斷特定微生物種群的存在和豐度,進(jìn)而揭示土壤微生物種群結(jié)構(gòu)和多樣性的變化。Murata等分析了大米土壤中細(xì)菌群落多樣性和PLFA的關(guān)系后發(fā)現(xiàn),細(xì)菌多樣性和PLFA的量呈比例關(guān)系。Keith-Roach等的研究表明,溫暖的季節(jié)可促使鹽堿地微生物的PLFA豐度增加,并且發(fā)現(xiàn)一年中好氧細(xì)菌是優(yōu)勢(shì)菌。Zhang等利用PLFA法分析了不同管理方式對(duì)農(nóng)業(yè)土壤微生物的結(jié)構(gòu)和多樣性的影響。結(jié)果表明,適度或加強(qiáng)土壤管理可以提高土壤微生物多樣性。微生物PLFA的提取和測(cè)定是該分析法的關(guān)鍵所在。Zelles等介紹了3種PLFA提取方法即簡(jiǎn)單提取法、MIDI(microbialidentificationsystems)系統(tǒng)提取法和擴(kuò)展提取法。采用前兩種方法提取PLFA后產(chǎn)生的脂肪酸譜相似,而且可檢測(cè)到的PLFA一般有20—48種,最多可達(dá)72種;采用擴(kuò)展提取法提取的PLFA數(shù)量可多達(dá)200—400種。PLFA的測(cè)定方法經(jīng)過(guò)不斷完善,目前主要是采用準(zhǔn)確、方便和快捷的GC-MS方法。PLFA分析法在描述整個(gè)微生物群落結(jié)構(gòu)變化的研究中具有快捷,可靠的優(yōu)點(diǎn),然而其分類水平較低,不能鑒定到微生物種的水平。1.3.2微生物及其產(chǎn)物呼吸醌是微生物細(xì)胞膜的重要組份,也是微生物呼吸鏈中的一種電子傳導(dǎo)體。它主要包括泛醌(ubiquinone,UQ)即輔酶Q和甲基萘醌(menaquinone,MK)即維生素K兩大類。泛醌廣泛存在于革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞膜上,主要用于微生物的好氧呼吸,甲基萘醌存在于革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和個(gè)別革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞膜上,主要用于微生物的厭氧呼吸。每種微生物所含的呼吸醌在結(jié)構(gòu)上是特有的,因此根據(jù)呼吸醌的測(cè)量能判斷微生物的群落的種類多樣性。并且,在土壤里微生物呼吸醌的含量和和微生物生物量存在線性關(guān)系。因此,呼吸醌指紋法能評(píng)估土壤尤其是被污染土壤微生物成分和生物量的變化。如,日本的Katayama研究組多次使用該方法成功地分析了除草劑、殺蟲劑和烴類等有機(jī)化合物對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)、成分和多樣性的影響,并且認(rèn)為它是有潛力的土壤微生物群落變化的檢測(cè)工具。此方法的主要步驟是首先從土壤中提出呼吸醌,然后用液相等方法測(cè)定呼吸醌的種類,進(jìn)而推斷土壤中微生物種類多樣性。Fujie等已經(jīng)報(bào)道了一些呼吸醌和微生物種類的對(duì)應(yīng)關(guān)系。比如,泛醌Q-8,9,10分別代表了Proteobacteria的α-,β-,和γ-subclass.該方法簡(jiǎn)單方便,然而和磷脂脂肪酸法一樣,缺點(diǎn)是分類水平低,無(wú)法判斷到微生物屬或種。2分子生物生態(tài)學(xué)為了克服上述方法的分類局限性,科研人員利用微生物細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)來(lái)評(píng)估土壤微生物的種類和結(jié)構(gòu)多樣性。這種從遺傳分子的水平來(lái)研究微生物群落特點(diǎn)的方法即為現(xiàn)代分子生物學(xué)方法。遺傳分子特征序列主要是核糖體基因序列(rRNA)。在生物漫長(zhǎng)的進(jìn)化過(guò)程中,rRNA分子在堿基組成、核苷酸序列和高級(jí)結(jié)構(gòu)等方面表現(xiàn)出高度的變化和保守性,被喻為生物進(jìn)化的分子計(jì)時(shí)鐘。16SrRNA基因由于分子大小適中而且擁有相當(dāng)豐富的數(shù)據(jù)庫(kù)等優(yōu)點(diǎn)已經(jīng)成為原核微生物分類和進(jìn)化標(biāo)記的最常用核糖體操縱子基因,而18SrRNA基因分子被用來(lái)分析真核微生物。另外,許多特異性蛋白編碼基因也常常被用作微生物分析的靶標(biāo)分子。如:用來(lái)檢測(cè)細(xì)菌的促旋酶B亞單位基因(gyrB)、用來(lái)檢測(cè)氨氧化細(xì)菌的氨單加氧酶基因(amoA)、用來(lái)檢測(cè)反硝化細(xì)菌的亞硝酸還原酶(含Cu)基因(nirK)、用來(lái)檢測(cè)沙門氏菌的沙門氏菌侵襲蛋白A基因(invA)和用來(lái)檢測(cè)甲烷桿菌屬的甲基coA還原酶基因(mcrA)等。隨著DNA提取、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)等技術(shù)的發(fā)展,現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)被逐步建立和改進(jìn),為土壤微生物群落多樣性的研究帶來(lái)了良好的契機(jī)。自20世紀(jì)70年代以后,國(guó)外就已經(jīng)建立了各種分子微生物生態(tài)學(xué)研究機(jī)制。這些機(jī)制主要包括:(1)基于DNA熱變性后同源單鏈發(fā)生重組行為的核酸復(fù)性動(dòng)力學(xué)和基于DNA序列成分不同的G+C%含量法。(2)基于核酸的堿基配對(duì)原則,用特異性的DNA探針與待測(cè)樣品的DNA(RNA)雜交或者直接進(jìn)行原位雜交(insitu)形成雜合分子,然后由儀器檢測(cè)雜交后的信號(hào)并定量。(3)以基因組學(xué)技術(shù)為依托,將從環(huán)境樣品中直接提取的DNA克隆到合適的載體中,然后將載體轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)菌建立環(huán)境基因組文庫(kù),對(duì)得到的環(huán)境基因組文庫(kù)再進(jìn)行功能基因篩選和基因測(cè)序等。(4)以檢測(cè)基因組中DNA多態(tài)性為目的而開發(fā)出了許多DNA指紋圖譜技術(shù)。2.1土壤微生物多樣性分析核酸復(fù)性動(dòng)力學(xué)技術(shù)是一個(gè)被用來(lái)測(cè)量微生物基因復(fù)雜程度的方法,它已經(jīng)被用于評(píng)價(jià)土壤微生物的多樣性。如,Torsvik等用核酸復(fù)性動(dòng)力學(xué)的方法很好地估計(jì)了土壤當(dāng)中的細(xì)菌多樣性,并且發(fā)現(xiàn)1g干燥的土壤中含有大約4000個(gè)完全不同的染色體基因單位。該方法的步驟是總DNA被從土壤中提取、純化、變性解鏈和再?gòu)?fù)合。通常,再?gòu)?fù)合的程度取決于微生物多樣性大小。在特定條件下,半數(shù)DNA發(fā)生復(fù)性時(shí)的C0t1/2(C0為核苷酸濃度)值與總DNA的復(fù)雜度即微生物多樣性的復(fù)雜度成正比。因此,C0t1/2可被作為一個(gè)指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)土壤微生物的多樣性。該方法的優(yōu)點(diǎn)是不受PCR擴(kuò)增偏差的影響,可是受基因拷貝數(shù)的影響,即由于大部分土壤細(xì)菌的拷貝數(shù)很低故利用此法檢測(cè)土壤微生物多樣性時(shí)缺乏靈敏度。G+C%含量法是基于DNA鏈上G+C%含量的不同來(lái)評(píng)價(jià)土壤微生物多樣性。Nüsslein等利用G+C%含量法研究了不同植被覆蓋下土壤細(xì)菌群落的多樣性并且發(fā)現(xiàn),森林和草地兩種植被對(duì)土壤細(xì)菌群落的成分和結(jié)構(gòu)有很大影響。該法主要利用二苯丙咪唑與DNA鏈上A+T堿基對(duì)結(jié)合,放大了不同基因之間G+C%含量的差別,進(jìn)而通過(guò)DNA分子質(zhì)量差異離心產(chǎn)生不同DNA的G+C%含量分布圖譜。該法也是不受PCR擴(kuò)增偏差的影響而且能使分類鑒定達(dá)到屬的水平,然而也同樣需要大量DNA樣品,而且不同種類的微生物可能擁有同樣的G+C%含量,是一種粗略的方法。2.2土壤微生物多樣性分析核酸雜交技術(shù)是將已知微生物基因序列作為特異探針,與從樣品中提取的DNA或者RNA進(jìn)行雜交,然后通過(guò)雜交信號(hào)的檢測(cè)和分析來(lái)判斷土壤微生物多樣性。這是一種既能定性又能定量地進(jìn)行土壤微生物多樣性解析的分子生物學(xué)工具。2.2.1原位雜交技術(shù)對(duì)于土壤微生物多樣性研究而言,細(xì)胞水平的原位雜交可能更具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。比如,利用探針可以直接和環(huán)境土壤樣品、純培養(yǎng)菌落進(jìn)行原位雜交,獲得自然和人工狀態(tài)下微生物種類、相對(duì)豐度和空間分布信息。Delon等于1989年首次使用熒光標(biāo)記寡核苷酸探針檢測(cè)單個(gè)微生物細(xì)胞。由于安全、靈敏和簡(jiǎn)便等特點(diǎn),熒光原位雜交技術(shù)(FISH)已經(jīng)被廣泛地用來(lái)研究土壤微生物多樣性。如,Llobet-Brossa等用熒光標(biāo)記的rRNA探針和海底底質(zhì)土壤微生物細(xì)胞進(jìn)行原位雜交后發(fā)現(xiàn),73%以上被DAPI染色的細(xì)胞能被雜交,總細(xì)胞數(shù)的45%能被鑒定到細(xì)菌門,而且還發(fā)現(xiàn)噬胞菌屬(Cytophaga)和黃桿菌屬(Flavobacterium)豐度最高,其次是硫酸還原菌。Liebner等通過(guò)FISH法發(fā)現(xiàn)永久凍土中存在極其多樣的細(xì)菌群落,并且觀察到擬桿菌(Bacteroidetes)和放線菌(Actinobacteria)是優(yōu)勢(shì)菌群。原位雜交要求土壤微生物基因必須有很高的拷貝數(shù),否則那些非優(yōu)勢(shì)微生物很難被檢測(cè)出來(lái)。然而,原位PCR技術(shù)的開發(fā)使核酸雜交技術(shù)克服了上述問(wèn)題,通過(guò)在細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增目標(biāo)基因片斷然后用特異探針進(jìn)行雜交可以更加準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)土壤微生物多樣性。2.2.2基因芯片技術(shù)基因芯片(DNAchip),又稱DNA微陣列(DNAmicroarrays),是核酸雜交技術(shù)家族中的另一重要成員,是將成千上萬(wàn)個(gè)已知序列的探針?lè)肿影凑仗囟ǖ呐帕蟹绞焦潭ㄔ诠滔噍d體(玻片,硅片等)上所組成的微點(diǎn)陣陣列。經(jīng)過(guò)標(biāo)記的靶核苷酸序列與基因芯片特定位點(diǎn)上的探針進(jìn)行雜交,然后通過(guò)檢測(cè)雜交信號(hào)定性和定量地判斷樣品中的靶序列分子。自從Fodor等人于1991年報(bào)道了應(yīng)用光刻技術(shù)制作DNA芯片的技術(shù)以來(lái),具有不同功能的基因芯片的研究和商業(yè)化得到了快速的發(fā)展。目前,用于土壤微生物生態(tài)研究的基因芯片技術(shù)主要有3種類型:(1)群落基因組芯片(communitygenomearray,CGAs);(2)系統(tǒng)寡核苷酸芯片(phylogeneticoligonucleotidearrays,POAs);(3)功能基因芯片(functionalgenearrays,FGAs)。CGAs和POAs芯片最合適用來(lái)分析復(fù)雜的土壤環(huán)境中微生物的種群結(jié)構(gòu)和多樣性變化以及種群間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,而FGAs芯片適合用來(lái)描述土壤環(huán)境中那些具有特殊功能的微生物(如,硝酸鹽還原菌、固氮菌和硫酸還原菌等)。Wu等建立了一個(gè)用于檢測(cè)特定微生物種群的全基因組芯片,該芯片具有特異性高,敏感性強(qiáng)(0.2ngDNA)的特點(diǎn),而且可以根據(jù)調(diào)節(jié)雜交溫度鑒定到細(xì)菌種或株的水平。作者利用該芯片成功地分析了土壤、海洋和河流沉積物之間的微生物群落結(jié)構(gòu)差異。Yergeau等利用含有8741個(gè)細(xì)菌和古菌16SrDNA探針的POAs芯片,研究了不同的南極土壤微生物的群落多樣性。結(jié)果顯示了微生物多樣性隨著緯度的增高而明顯地減小,也證明了在檢測(cè)微生物多樣性的廣泛性時(shí)基因芯片技術(shù)比基于PCR的16SrRNA基因克隆庫(kù)更敏感。Liang等利用FGAs芯片評(píng)價(jià)了用臭氧氧化和生物方法聯(lián)合處理原油污染土壤過(guò)程中,細(xì)菌功能基因的變化,即在臭氧作用后,微生物的功能基因多樣性有所降低,然而在生物處理后,那些主要的具有碳氮硫等循環(huán)功能的功能基因數(shù)量卻有所回升。盡管核酸雜交技術(shù)對(duì)于那些特殊的土壤微生物的鑒定非常有效,但是由于目前我們還無(wú)法得到所有土壤微生物的探針序列,故該方法不適宜檢測(cè)總土壤微生物多樣性。2.3dna提取和分類及應(yīng)用Handelsman等于1998年首次提出宏基因組學(xué)的概念,即不需要經(jīng)過(guò)培養(yǎng)、分離單一種類的微生物,而是利用現(xiàn)代基因組技術(shù)直接研究自然狀態(tài)中環(huán)境微生物群落。土壤宏基因組學(xué)的主要任務(wù)之一就是揭示土壤微生物群落多樣性。通過(guò)16SrRNA基因(或其他標(biāo)記基因如amoA等)文庫(kù)的構(gòu)建和系統(tǒng)化分析來(lái)研究土壤微生物群落種類和存在豐度,并且挖掘有用的基因,使土壤微生物多樣性分析更趨于完整客觀。該方法的步驟主要包括土壤DNA的提取克隆文庫(kù)的構(gòu)建和篩選。(1)DNA提取DNA提取是現(xiàn)代分子生物學(xué)方法的基礎(chǔ)和關(guān)鍵,提取方法會(huì)影響所構(gòu)建文庫(kù)的代表性。DNA提取方法大致分為兩類,即直接細(xì)胞溶解法(直接從土壤細(xì)胞中提取DNA)和間接細(xì)胞溶解法(先從土壤中分離細(xì)胞,再?gòu)募?xì)胞中提取DNA)。直接法比間接法簡(jiǎn)便、且能獲得更多DNA,但是間接法能獲得更大更純的基因片斷。細(xì)胞的溶解通常采用多種方式相結(jié)合的策略,如用酶(如,lysozyme或proteonaseK)、高溫、界面活性劑(如,SDS)和機(jī)械破碎法(beadsbeating)同時(shí)處理土壤細(xì)胞。在土壤宏基因組學(xué)中,采用什么樣的DNA提取方法取決于土壤性質(zhì)特點(diǎn)和研究目的。(2)文庫(kù)的構(gòu)建根據(jù)插入載體的片斷大小,宏基因組文庫(kù)一般能被分為兩種,即插入質(zhì)粒載體的小片斷基因文庫(kù)和插入人工染色體(BAC)或粘粒(cosmid)的大片段基因文庫(kù)。小片斷文庫(kù)(<15kb)適宜于單個(gè)基因或具有新的代謝功能的小操縱子基因的篩選。大片段文庫(kù)(>40kb)適宜于分析那些不可培養(yǎng)微生物的基因組。(3)文庫(kù)篩選高度復(fù)雜的土壤元基因組要求文庫(kù)的篩選方法具有高通量和高靈敏度的能力。目前,篩選技術(shù)主要包括功能驅(qū)動(dòng)篩選、序列驅(qū)動(dòng)篩選和底物誘導(dǎo)基因表達(dá)篩選等。土壤宏基因組學(xué)為土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性,特別是對(duì)那些土壤功能微生物的分析提供了很好的技術(shù)平臺(tái)。Rondon等采用BAC載體構(gòu)建了兩個(gè)大片段土壤宏基因組文庫(kù)(>1GbpofDNA),對(duì)文庫(kù)進(jìn)行16SrDNA系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析后發(fā)現(xiàn),文庫(kù)中的DNA代表了不同的細(xì)菌門(如,低G+C百分含量細(xì)菌,Acidobacterium,Cytophagales,andProteobacteria),揭示了該土壤樣品中有很高的微生物多樣性。德國(guó)Schleper研究室的研究者們通過(guò)大插入片段文庫(kù)的構(gòu)建和鑒定,第一次報(bào)道了在草地土壤基因組中酸桿菌門的基因組成分和多樣性,通過(guò)構(gòu)建3個(gè)大片斷Fosmid基因文庫(kù),分析了沙地生態(tài)和森林土壤中古細(xì)菌的多樣性。然而,這個(gè)技術(shù)對(duì)所構(gòu)建文庫(kù)的質(zhì)量和文庫(kù)篩選方法的要求比較高,而且工作量大,不適合用來(lái)分析不同土壤環(huán)境中微生物多樣性的時(shí)空動(dòng)態(tài)變化和監(jiān)測(cè)。2.4土壤環(huán)境生物過(guò)程條帶基因指紋圖譜技術(shù)是基于基因在長(zhǎng)度、成分和結(jié)構(gòu)上的多態(tài)性,利用電泳方法將復(fù)雜的PCR擴(kuò)增片斷分離成簡(jiǎn)單的基因條帶圖譜,然后根據(jù)條帶信息進(jìn)行基因分析的技術(shù)。一般地,每個(gè)條帶代表一種不同的可操作分類單位(operationaltaxonomyunit,OTU),條帶的數(shù)量可反映土壤環(huán)境微生物群落中優(yōu)勢(shì)類群的種類,而亮度可以反映微生物種群的相對(duì)豐度。由于具有操作簡(jiǎn)便以及可同時(shí)分析多個(gè)樣品的優(yōu)點(diǎn),這個(gè)技術(shù)已經(jīng)被廣泛地用于土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性評(píng)價(jià)以及他們的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。指紋圖譜技術(shù)在土壤微生物多樣性研究中的主要步驟包括土壤總核酸(DNA或RNA)提取、PCR(或RT-PCR)擴(kuò)增、電泳分離和統(tǒng)計(jì)分析。目前,指紋圖譜技術(shù)主要有以下幾種類型。2.4.1t-rflp和risa擴(kuò)增多態(tài)性圖譜DNA長(zhǎng)度多態(tài)圖譜分析主要用于檢測(cè)土壤微生物基因片斷的長(zhǎng)度多態(tài)性。DNA長(zhǎng)度多態(tài)片斷常常通過(guò)限制性酶切的方法產(chǎn)生,因此也被稱為限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)和末端限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)(terminalrestrictionfragmentlengthpolymorphism,T-RFLP)。這兩個(gè)方法的原理相同,均是利用無(wú)變性的瓊脂或者聚丙烯酸凝膠對(duì)限制性酶切片斷進(jìn)行電泳分離,不同長(zhǎng)度的DNA片斷會(huì)停留在不同的凝膠位置上,最后形成長(zhǎng)度多態(tài)圖譜。T-RFLP是RFLP的發(fā)展,克服了RFLP圖譜復(fù)雜的缺點(diǎn),即在PCR擴(kuò)增的過(guò)程中,一個(gè)引物被用熒光標(biāo)記,當(dāng)進(jìn)行片斷分析時(shí),只針對(duì)那些末端帶有熒光標(biāo)記的產(chǎn)物。因此,T-RFLP簡(jiǎn)化了RFLP的條帶圖譜,能夠更加準(zhǔn)確地反映土壤微生物多樣性。由于核糖體DNA常常被用來(lái)作為基因標(biāo)記,故RFLP也通常被稱為擴(kuò)增核糖體DNA限制分析(amplifiedribosomalDNArestrictionanalysis,ARDRA)。限制性酶的應(yīng)用是這些方法的關(guān)鍵,2—4種酶通常被同時(shí)用來(lái)產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的土壤DNA片斷。對(duì)于各種土壤微生物多樣性的動(dòng)態(tài)變化檢測(cè),這3個(gè)方法是非常方便的。T-RFLP技術(shù)自1997年被Liu等首次將應(yīng)用于土壤微生物多樣性的研究以來(lái),已經(jīng)被廣泛地用來(lái)研究各種土壤中的微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性變化。王英等利用ARDRA和RFLP技術(shù)對(duì)免耕水稻土壤中細(xì)菌的多樣性和空間分布分析后發(fā)現(xiàn),細(xì)菌種類非常豐富,而且在不同層的土壤中細(xì)菌的多樣性存在差異。然而,一條RFLP(T-RFLP/ARDRA)條帶可能代表幾種微生物種類,容易給微生物多樣性評(píng)價(jià)帶來(lái)誤差。另外,核糖體間隔區(qū)分析(ribosomalintergenicspaceranalysis,RISA)和隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(randomamplifiedpolymorphicDNA,RAPD)也是長(zhǎng)度多態(tài)性圖譜家族中的成員,常被用來(lái)研究土壤微生物多樣性。RISA以原核生物16S和23SrDNA間隔片斷為研究對(duì)象,根據(jù)rDNA大小轉(zhuǎn)錄單元間的長(zhǎng)度多態(tài)性揭示土壤環(huán)境中微生物多樣性。RAPD方法利用單個(gè)人工合成的隨機(jī)多態(tài)核苷酸序列(通常10bp)為引物,在一定的PCR條件下(低退火溫度)對(duì)土壤基因組DNA進(jìn)行隨機(jī)擴(kuò)增,產(chǎn)物被電泳分離后產(chǎn)生長(zhǎng)度多態(tài)性指紋圖譜。2.4.2凝膠電泳法tageDNA成分多態(tài)性圖譜分析是用來(lái)分離那些DNA分子長(zhǎng)度相同,堿基序列成分不同的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。該技術(shù)主要包括變性劑濃度梯度凝膠電泳(denaturinggradientgelelectrophoresis,DGGE)、溫度梯度凝膠電泳(temperaturegradientgelelectrophoresis,TGGE)和時(shí)間溫度梯度凝膠電泳(temporaltemperaturegradientgelelectrophoresis,TTGE)。這些電泳技術(shù)的原理是相似的,即通過(guò)使雙鏈DNA在化學(xué)變性劑或者溫度形成線性梯度的環(huán)境下部分熔解變性成單鏈,然后根據(jù)不同序列的DNA在聚丙烯酸凝膠上移動(dòng)速度的差異而將其分離成條帶圖譜。DGGE技術(shù)最初被用于檢測(cè)人類基因的點(diǎn)突變,自Muyzer等將其首次應(yīng)用于微生物基因多樣性的研究以來(lái),已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于土壤等環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的評(píng)價(jià)[81,82,83,84,85,86]。為了提高DNA片斷的分離效率,在PCR擴(kuò)增土壤基因組時(shí),PCR引物的一端常常被加上一個(gè)約30—40個(gè)堿基的GC夾子以保證擴(kuò)增產(chǎn)物在被凝膠電泳分離時(shí),不至于將雙鏈DNA完全熔解成單鏈。理論上,DGGE可以分離僅有1bp堿基差異的DNA片斷,然而對(duì)于超過(guò)500bp的DNA片斷,DGGE的分離靈敏度會(huì)降低。TGGE和TTGE都是在DGGE的基礎(chǔ)上開發(fā)出來(lái)的,盡管都是采用溫度梯度,但是凝膠的變性環(huán)境的形成過(guò)程卻不一樣。在TGGE方法中,從凝膠的上端到下端有一個(gè)固定的溫度梯度,而在TTGE中,溫度是在電泳的過(guò)程中以一定的速率緩慢地增加的。在實(shí)際執(zhí)行這兩個(gè)方法時(shí),TTGE更容易被達(dá)到,而且由于能夠提供更寬的分離范圍,故分離靈敏度更高。2.4.3sscp技術(shù)生物樣品多樣性DNA單鏈構(gòu)象多態(tài)性(singlestrandconformationpolymorphism,SSCP)是另一個(gè)重要的指紋圖譜技術(shù)。它是一種基于單鏈DNA的構(gòu)象差異來(lái)分離DNA片斷的方法。理論上,當(dāng)DNA分子鏈上的一個(gè)堿基發(fā)生改變時(shí),單鏈DNA的空間折疊構(gòu)象就會(huì)發(fā)生改變,這些空間構(gòu)象有差異的單鏈DNA在非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳時(shí)會(huì)產(chǎn)生不同的遷移率,從而可以在凝膠上產(chǎn)生單鏈DNA條帶圖譜。和DGGE一樣,SSCP最初也是被于來(lái)檢測(cè)堿基點(diǎn)突變和已知小分子基因序列變化。該技術(shù)對(duì)300bp的DNA片斷中的單堿基突變,可以達(dá)到90%以上的檢出率。有時(shí)為了提高單鏈DNA的分離效率,往往在聚丙烯酰胺凝膠中加入化學(xué)交聯(lián)劑如甘油或聚乙二醇(PEG)。該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是無(wú)需DNA片斷帶GC夾和凝膠變性梯度的建設(shè),故操作相對(duì)簡(jiǎn)便,已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于土壤微生物群落分析。Schwieger等首次證明SSCP在土壤微生物多樣性的研究中具有應(yīng)用潛力。而后,Kleinsteuber等利用SSCP技術(shù)分析了不同鹽度(0,7.5,15和20)的柴油污染土壤中優(yōu)勢(shì)菌群結(jié)構(gòu)的變化。Smalla等利用包括SSCP在內(nèi)的3種DNA指紋技術(shù)(另兩種是DGGE和T-RFLP)考察了4種可耕種土壤中的細(xì)菌群落,結(jié)果發(fā)現(xiàn),菌群結(jié)構(gòu)與土壤的理化性質(zhì)相關(guān),對(duì)于同一類土壤,3種方法可產(chǎn)生相似的細(xì)菌群落多樣性結(jié)果。Vivas等通過(guò)PCR-SSCP分析發(fā)現(xiàn),在被烴類污染最嚴(yán)重的土壤中PAH降解基因的多樣性是最大的。然而,SSCP的重現(xiàn)性較差,易受電泳溫度(4—16℃)和凝膠濃度等條件的影響,對(duì)于300bp以上的DNA序列,分離效率低下。2.4.4-d基因圖譜技術(shù)DNA雙向(2-D)圖譜技術(shù)是一種具有高分辨率的新型基因指紋圖譜技術(shù)。該技術(shù)主要以DNA序列在長(zhǎng)度、成分和空間構(gòu)象3種多態(tài)性參數(shù)中的任何兩個(gè)為DNA片斷分離依據(jù),對(duì)復(fù)雜的土壤基因組進(jìn)行分離鑒定。DNA雙向圖譜技術(shù)的概念最早由Fischer和Lerman于1983年提出,目的是用來(lái)檢測(cè)基因的點(diǎn)突變。近年,該技術(shù)已經(jīng)漸漸地被用來(lái)詳細(xì)地分離土壤等環(huán)境基因組,以至于使我們對(duì)環(huán)境基因組有更好的認(rèn)識(shí)和把握。Isshi等于2006年利用16SrRNA基因在V1高度變化區(qū)域的自然多態(tài)性(長(zhǎng)度和成分)開發(fā)了一個(gè)新的高分辨率2-D基因圖譜技術(shù)。后來(lái),Liu等將此技術(shù)成功地應(yīng)用于土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性的研究,并且發(fā)展建立了兩個(gè)不同的2-D基因圖譜技術(shù)。另外,JonesandThies也建立了可以用來(lái)詳細(xì)分離土壤微生物核糖體基因的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internaltranscribedspacer,ITS)片斷的2-D技術(shù)。2-D技術(shù)的主要特點(diǎn)是具有基因高分辨率,那些利用常規(guī)的DGGE、T-RFLP和SSCP等一維方法無(wú)法分開的基因片斷,利用2-D技術(shù)便能將其很好地分開。李剛等研究者具體比較了RISA、DGGE和2-D方法在分析大豆根際土壤細(xì)菌多樣性時(shí)的不同,結(jié)果表明2-D方法能夠獲得更多的土壤細(xì)菌多樣性信息。如果對(duì)圖譜中的信號(hào)進(jìn)行剪切并鑒定分析時(shí),具有高分辨率特點(diǎn)的2-D技術(shù)可以簡(jiǎn)化克隆文庫(kù)中的基因種類,并利用2-D參數(shù)可以排除那些由于PCR的錯(cuò)誤擴(kuò)增產(chǎn)生的序列和假陽(yáng)性克隆體基因序列,從而確定正確的基因擴(kuò)增序列來(lái)準(zhǔn)確地鑒定土壤微生物種類。然而,由于基因2-D圖譜技術(shù)尚處于發(fā)展期,而且還受儀器裝置的限制,目前還不適宜同時(shí)分析比較大量的土壤樣品。隨著技術(shù)的發(fā)展,2-D技術(shù)在土壤等環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性的分析中將發(fā)揮更大的作用。3對(duì)土壤微生物多樣性的影響如前所述,現(xiàn)有的每一種技術(shù)都有其局限性。因此,任何一種方法都無(wú)法全面地解決土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性。在實(shí)際應(yīng)用中,研究人員往往根據(jù)自己的研究目的利用多種方法組合的策略減少誤差,以獲得更準(zhǔn)確的信息。Ellis等利用培養(yǎng)和非培養(yǎng)的方法研究了重金屬污染對(duì)可培養(yǎng)和不可培養(yǎng)土壤微生物多樣性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),各種污染土壤的總基因組的DGGE圖譜非常相似,而每種土壤的可培養(yǎng)細(xì)菌基因的DGGE圖譜卻顯示出了很大的不同。因此,作者們認(rèn)為,對(duì)于評(píng)價(jià)重金屬對(duì)土壤微生物多樣性的影響研究而言,培養(yǎng)的方法可能更準(zhǔn)確。Enwall等利用T-RFLP和DGGE的方法評(píng)價(jià)了農(nóng)業(yè)土壤中脫氮菌群的組成。結(jié)果發(fā)現(xiàn),DGGE比T-RFLP有更高的解析度,更適合區(qū)別樣本的不同。Rosenberg等利用FISH和DGGE研究了土壤變形蟲對(duì)阿拉伯芥根圈細(xì)菌群落的影響,第一次全面地闡明了原生動(dòng)物