中華蜜蜂急造王臺的工蜂親屬優(yōu)惠

中華蜜蜂急造王臺的工蜂親屬優(yōu)惠

蜜蜂的社會行為特征一直受到許多生物的關(guān)注。另一方面，人們意識到蜜蜂應(yīng)該給作物授粉。另一方面，蜜蜂社會行為的結(jié)果對所有社會生物學(xué)和行為生態(tài)領(lǐng)域都有很大的影響（bersaur等人，2002；kisi和nishada，2008）。近20年來,蜂群中工蜂親屬優(yōu)惠一直是蜜蜂社會行為特性研究的熱門課題之一(Jordanetal.,2008)。工蜂親屬優(yōu)惠是指工蜂給予跟自己親緣關(guān)系更近的個體某些“利益”而疏遠(yuǎn)跟自己親緣關(guān)系指數(shù)較小的個體的行為(Barbaraetal.,2006;Wenseleers,2007)。由于同一亞家庭的工蜂之間(即全同胞姐妹)的親緣關(guān)系指數(shù)是0.75,而不同亞家庭之間的工蜂(即半同胞姐妹)的親緣關(guān)系指數(shù)只有0.25。因此當(dāng)蜂群失王后,哺育工蜂將面臨用不同親緣關(guān)系指數(shù)的幼蟲來培育蜂王的選擇。如果存在親屬優(yōu)惠,那么工蜂都希望用跟自己屬同一亞家庭的幼蟲來培育蜂王。LacyandSherman(1983)發(fā)現(xiàn)在西方蜜蜂(Apismellifera)中,工蜂便是選擇親緣關(guān)系指數(shù)高的幼蟲來培育蜂王。當(dāng)面臨飼喂全同胞姐妹幼蟲和半同胞姐妹幼蟲時,工蜂多會優(yōu)先選擇飼喂全同胞姐妹幼蟲(MoritzandNeumann,2004);當(dāng)面臨蜂王產(chǎn)的卵和工蜂產(chǎn)的卵時,工蜂可以在24h內(nèi)辨別工蜂產(chǎn)的卵,并99%地清除它們(RatniksandKvesscher,1989)。TarpyandFletcher(1998)研究了親緣關(guān)系指數(shù)對蜂王的影響,發(fā)現(xiàn)在育王時,雖然工蜂不會優(yōu)先飼喂親緣關(guān)系指數(shù)近的幼蟲,但蜂王羽化后,親緣關(guān)系指數(shù)近的蜂王成活率顯著高于其他蜂王。Pageetal.(1989)認(rèn)為,如果蜂群中有某個或幾個亞家庭被培育成蜂王的概率明顯要高,那么這現(xiàn)象也應(yīng)該是親屬優(yōu)惠的結(jié)果。WenseleersandRatnieks(2006)對109種社會性昆蟲進(jìn)行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)大部分群體中都存在親屬優(yōu)惠現(xiàn)象。中華蜜蜂(Apisceranacerana,簡稱中蜂)是我國寶貴蜂種資源,蜂群中存在親屬優(yōu)惠與否的爭論非常激烈。微衛(wèi)星DNA技術(shù)在蜜蜂生物學(xué)上的應(yīng)用較為常見(蘇松坤,2002)。因此,本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用蜜蜂微衛(wèi)星DNA技術(shù)分析了中華蜜蜂群內(nèi)急造王臺時的工蜂親屬優(yōu)惠問題,進(jìn)一步揭示了中華蜜蜂生物學(xué)特性。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)材料1.1.1蜜蜂群的來源實(shí)驗(yàn)蜜蜂是泉州師范學(xué)院模式生物研究中心飼養(yǎng)的中華蜜蜂。1.1.2試劑:napoluserase,dntp,ops主要試劑:Chelex-100(5%);Ringerbuffer(130mmol/LNaCl,1.5mmol/LCaCl2,5mmol/LKCl,pH7.4);DTT(1mol/L);ProteinaseK(10mg/μl);Rnase(10mg/ml);TaqDNAPolymerase(5U/μl);MgCl2(25mmol/L);10×Buffer(100mmol/LKCl,80mmol/L(NH4)2SO4,100mmol/LTris-HCl,pH9.0,NP-40);dNTP(10mmol/L);Primer;Mark(100bp);30%PAGE(145g丙烯酰胺,5g亞甲雙丙烯酰胺,加水定容至500ml);染色液(每塊膠所需)(3.6%NaOH4.2ml,20%AgNO33.6ml,氨水2ml蒸餾水190ml);顯色液(每塊膠所需)(1%檸檬酸鈉1ml,甲醛100ml,蒸餾水200ml),以上試劑大部分購自Sigma公司。主要儀器:高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf5415R)、PCR儀(Eppendorf96holes)、瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)(TanonEPS300)、計(jì)算機(jī)自動成像系統(tǒng)(TanonGIS2009)和垂直電泳槽(北京六一DYY-III24A)等。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1蜂群的失王臺在早春蜂群分蜂季節(jié),選取3群群勢較強(qiáng)的中蜂,將蜂群中的蜂王移走而使蜂群人為失王,2-3d后蜂群中出現(xiàn)急造王臺。整個實(shí)驗(yàn)對蜂群進(jìn)行獎勵飼喂。1.2.2工蜂蜂的采集考慮實(shí)驗(yàn)統(tǒng)一,每群蜂取前10個急造王臺。仔細(xì)觀察急造王臺中幼蟲的飼喂情況,每個王臺采集哺育工蜂20只。哺育蜂采集完畢,立刻將對應(yīng)王臺中的蜂王幼蟲也采集好。另外每個蜂群采集30只工蜂蛹用于蜂群亞家庭鑒定。將所有樣品編號后放入-20℃的低溫冰箱中保存。1.2.3蜜蜂組的dna提取單只蜜蜂的基因組DNA是參照Walsh(1991)的Chelex-100方法提取。1.2.4pcr反應(yīng)體系及條件實(shí)驗(yàn)所用的3對微衛(wèi)星引物由上海GeneCore公司合成(序列見表1),它們在西方蜜蜂和熊蜂中都可以成功擴(kuò)增(Estoupetal.,1994)。PCR反應(yīng)體系為50μl,其中包含MgCl26.0μl;10×Buffer5.0μl;上、下引物各2.0μl;dNTP1.0μl;Taq酶0.75μl;不同微衛(wèi)星位點(diǎn)模板DNA用量見表1;剩下的用ddH2O補(bǔ)足。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5min;94℃變性60s,退火60s(不同微衛(wèi)星位點(diǎn)退火溫度和循環(huán)次數(shù)見表1),72℃延伸120s;72℃再延伸10min;最后4℃保存。1.2.5pcr擴(kuò)增效果的分析因此在進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分析片斷之前,應(yīng)該用瓊脂糖凝膠電泳簡單檢測PCR的擴(kuò)增效果,確保樣品中的目標(biāo)片斷已被擴(kuò)增,然后再用聚丙烯酰胺凝膠電泳分析各自的基因型。1.2.6電泳分型結(jié)果分析玻璃板的清洗→12%變性聚丙烯酰胺凝膠制備→灌膠→預(yù)電泳→樣品的準(zhǔn)備→上樣→電泳→銀染→檢測電泳分型結(jié)果,并利用成像軟件計(jì)算其分子量。通過分析工蜂的基因型推導(dǎo)出各蜂群的亞家庭組成,然后通過各蜂群10個王臺中的蜂王幼蟲和20只哺育工蜂的等位基因組成的分析,推導(dǎo)出各自所屬的亞家庭。1.3家庭實(shí)驗(yàn)結(jié)果的方差分析采用StatView軟件對各亞家庭之間的工蜂分布和哺育蜂的分布進(jìn)行方差分析,而各亞家庭之間的王臺分布的實(shí)驗(yàn)值與理論值之間的分析是采用卡方檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1pcr反應(yīng)體系對多態(tài)性的pcr擴(kuò)增的影響從圖1可見:電泳條帶在已知大小范圍之內(nèi),沒有非特異性擴(kuò)增條帶的干擾,這說明PCR反應(yīng)體系構(gòu)建合理,可以用12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行多態(tài)性分析。2.2通過pcr擴(kuò)增劑檢測12%聚氟橡膠電泳性能的結(jié)果從圖2可見:PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在12%聚丙烯酰胺膠中能順利地分辨出雙倍體的基因型。2.3蜂群檢測結(jié)果從表2可知:通過A14、A107和B1243個微衛(wèi)星位點(diǎn),蜂群Ⅰ共檢測到11個亞家庭,急造王臺卻只集中在亞家庭4(50%)、9(30%)和11(20%);蜂群Ⅱ檢測到13個亞家庭,急造王臺只集中在亞家庭1(30%)、4(20%)、6(30%)和13(20%);蜂群Ⅲ檢測到14個亞家庭,急造王臺只集中在亞家庭4(10%)、7(10%)、9(20%)、11(10%)和14(50%)。同一蜂群內(nèi)經(jīng)卡方檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn),出現(xiàn)急造王臺的亞家庭與未出現(xiàn)的之間在急造王臺出現(xiàn)率上存在極顯著差異;由方差分析發(fā)現(xiàn),各亞家庭之間在工蜂分布情況上差異不顯著。這說明中華蜜蜂在急造王臺時,存在工蜂親屬優(yōu)惠行為。從表3可知:各急造王臺中幼蟲的哺育工蜂并非都出自同一個亞家庭;與幼蟲來自同一亞家庭的哺育工蜂即“全同胞姐妹”最多只有40%,有些急造王臺中幼蟲并沒有“全同胞姐妹”哺育。經(jīng)卡方檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn):同一蜂群內(nèi),各亞家庭之間在出現(xiàn)哺育工蜂方面沒有差異,這說明哺育工蜂與急造王臺中的幼蟲之間并不存在工蜂親屬優(yōu)惠。3蜂群中同母異父的親疏關(guān)系家系選擇理論表明,如果群體中的個體愿意幫助親屬繁殖,那么基因的遺傳總體上會好于個體自己直接繁殖,比如蜜蜂群體中的利他基因能夠得到很好的繼承,而工蜂卻能夠完全不育。然而該行為也有它的負(fù)面結(jié)果,那就是個體之間都會“利于”親屬關(guān)系近的而“傷害”關(guān)系遠(yuǎn)的,即親屬優(yōu)惠(Barbaraetal.,2006;Wenseleers,2007)。PageeandMetcalf(1982)以及Estoupetal.(1994)的研究結(jié)果表明,一般蜂群都由6-21個亞家庭組成,因此由于蜂王的多雄交配特性,加上蜂王使用交配雄蜂的精液呈隨機(jī)分布(Fondrketal.,1993),使得多雄交配蜂王的蜂群由許多同母異父的亞家庭組成,從而使蜂群中不同個體間親緣關(guān)系指數(shù)變得復(fù)雜了許多。由于r全同胞姐妹>r全同胞兄妹>r半同胞姐妹>r半同胞兄妹,因此從理論上看必然形成以下親屬優(yōu)惠結(jié)果:在面臨全同胞姐妹和半同胞姐妹時,工蜂愿意選擇其同胞姐妹進(jìn)行飼喂;而工蜂在選擇全同胞兄弟和半同胞兄弟時,可能先清除其半同胞兄弟;同理,工蜂在選擇全同胞姐妹和同胞兄弟時,可能先清除其同胞兄弟。在本實(shí)驗(yàn)中,3群中蜂的蜂王經(jīng)檢測分別與11、13和14只雄蜂交配,因此,這3個實(shí)驗(yàn)蜂群分別是由11、13和14個亞家庭組成。當(dāng)人為地將蜂群中的蜂王移走后,蜂群在第2天就開始出現(xiàn)了急造王臺,經(jīng)過對蜂群中急造王臺里幼蟲的亞家庭隸屬關(guān)系進(jìn)行鑒定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)急造王臺并非是平均分配在所有的亞家庭中,而是只集中在幾個亞家庭,這一結(jié)果與西方蜜蜂(Apismellifera)研究結(jié)果一致(TilleyandOldroyd,1997),從而說明了蜂群在急造王臺時,蜂王幼蟲的選擇過程是存在工蜂親屬優(yōu)惠的;而根據(jù)親屬優(yōu)惠原則,哺育工蜂應(yīng)該都愿意飼喂跟自己是同一亞家庭的全同胞兄妹。然而在本實(shí)驗(yàn)中,某一急造王臺的所有哺育蜂與幼蟲