大鼠腦缺血再灌注后nelin和scf基因表達的變化

大鼠腦缺血再灌注后nelin和scf基因表達的變化

神經(jīng)干燥物（ius）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中具有分裂和分化能力的細胞。它是神經(jīng)發(fā)育的一個特定細胞，可以長期保持其分裂和分化能力。巢蛋白(nestin)是神經(jīng)干細胞體外培養(yǎng)常用的分子標記物,它是一種僅存在于神經(jīng)上皮干細胞的中間絲成分,其表達有特定的時序性。研究表明,缺氧誘導小鼠神經(jīng)再生;干細胞因子(stemcellfactor,SCF)和成纖維細胞生長因子-2(fibroblastgrowthfactor-2,FGF-2)是缺氧誘導的神經(jīng)再生的因子;SCF可能刺激整體動物神經(jīng)再生。本研究應用原位雜交技術檢測神經(jīng)干細胞特異性標記物nestin和SCF表達的變化,以探討腦缺血再灌注后神經(jīng)干細胞增殖水平的變化。材料和方法一、實驗模型的建立成年健康雌性SD大鼠36只,體重230~280g,清潔級,由中國科學院上海實驗動物中心提供。應用線栓法經(jīng)左側(cè)頸外-頸內(nèi)動脈插線建立左側(cè)大腦中動脈阻塞(middlecerebralarteryocclusion,MCAO)再灌注模型,隨機分為缺血1.5h再灌注2h、6h、12h、24h、2d、3d、7d、14d組和假手術組,每組4只。假手術組除不插線外,其余步驟同實驗組。二、腦電pc各組動物在規(guī)定的時間里取材,假手術組于術后24h取材。大鼠在10%水合氯醛(300mg/kg體重)麻醉下,經(jīng)左心室插管至升主動脈,依次灌入生理鹽水200ml、4%多聚甲醛300ml,灌注完畢后開顱,于前囟前2mm至前囟后3mm之間取腦,切塊厚度5mm,置入4%多聚甲醛(含1/5000DEPC)中固定2h,蒸餾水浸泡4h。常規(guī)梯度乙醇脫水,二甲苯透明,浸蠟,包埋。于前囟前1mm至前囟后2mm之間連續(xù)冠狀切片,厚度7μm,粘于經(jīng)多聚賴氨酸處理后的玻片上,置入37℃烤箱過夜后室溫保存,用于nestin和SCF原位雜交及其對照實驗。三、dab顯色法nestin和SCFmRNA原位雜交試劑盒、DAB試劑盒均由武漢博士德生物工程有限公司提供。按照試劑盒說明操作,DAB顯色,光鏡下觀察,細胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽性細胞。取部分切片不加探針以0.1MPBS代替,不出現(xiàn)陽性細胞,說明探針特異性強。四、陰性細胞計數(shù)高倍鏡下(×400)在皮層、紋狀體和室旁區(qū)隨機各取4個視野計數(shù)陽性細胞,各時間點陽性細胞數(shù)以(ˉx±s)(xˉ±s)表示,組間比較用t檢驗。結(jié)果一、組患者未盡事宜性變化的不良反應比較假手術組皮質(zhì)、紋狀體和室旁區(qū)nestin表達很弱。實驗組缺血側(cè)皮質(zhì)nestin的表達于再灌注2h后開始增高,但與假手術組比較無顯著性差異,自6h開始有顯著性增高,至24h達高峰,2d回落,7d又出現(xiàn)最高峰,以后漸降低,14d仍較假手術組高;紋狀體和室旁區(qū)nestin的表達規(guī)律與皮質(zhì)區(qū)基本一致,但其增高自12h始出現(xiàn)顯著性差異;至14d室旁區(qū)nestin表達已恢復至假手術組水平。具體數(shù)據(jù)詳見表1。二、scf的表達假手術組皮質(zhì)、紋狀體和室旁區(qū)SCF表達很弱。實驗組缺血側(cè)皮質(zhì)SCF的表達于再灌注2h后開始增高,但與假手術組比較無顯著性差異,自24h開始有顯著性增高,2d回落,3d、7d增高,7d出現(xiàn)最高峰,以后漸降低,14d仍較假手術組高;紋狀體和室旁區(qū)SCF的表達規(guī)律與皮質(zhì)基本一致,但紋狀體SCF增高自12h、室旁區(qū)自6h始出現(xiàn)顯著性差異;至14d室旁區(qū)SCF表達已恢復至假手術組水平。具體數(shù)據(jù)詳見表2。討論一、內(nèi)源性神經(jīng)干細胞神經(jīng)干細胞缺乏成熟神經(jīng)細胞所具有的抗原,而存在一種作為神經(jīng)外胚層標記物的nestin(巢蛋白,即神經(jīng)上皮干細胞蛋白,neuroepithelialstemprotein),系早期原始神經(jīng)細胞的標志,故可應用nestin免疫反應確定神經(jīng)干細胞的存在。在成年中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,一定數(shù)量的神經(jīng)干細胞以休眠、不增殖狀態(tài)存活在腦內(nèi)并受中樞神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)控。當中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損或變性時,由于細胞微環(huán)境的改變(如出現(xiàn)某些細胞因子),神經(jīng)干細胞被激活(或抑制因子失活),在損傷原位出現(xiàn)或異位增生后,在趨化因子的作用下向損傷部位遷移并分化。也有學者認為,成熟神經(jīng)細胞的逆向分化是內(nèi)源性神經(jīng)干細胞的來源之一。他們認為,在腦缺血或其它神經(jīng)系統(tǒng)的病理狀態(tài)下,成熟細胞可發(fā)生細胞骨架的胚胎回復,出現(xiàn)胚胎神經(jīng)上皮細胞特性的再表達。此類細胞可能是星形細胞或少突膠質(zhì)細胞的前體細胞。Li等用MCAO法制作大鼠局灶性腦缺血模型,于再灌注后2、3、6、12h和1、2、3、7、8d取腦組織用Western印跡法作巢蛋白定量分析,結(jié)果顯示,nestin在第7天達高峰。這些資料表明,腦缺血后,機體通過誘導內(nèi)源性神經(jīng)干細胞增多而對缺血損傷產(chǎn)生代償性適應性反應。本研究實驗組的結(jié)果與此基本一致。二、scf受體的功能SCF是一種細胞活素,它可在心臟和其它器官影響功能、生長和凋亡,它是心肌愈合中對肥大細胞有力的生長和趨向性因子。而在神經(jīng)生長因子(NGF)、腦源性生長因子(BDGF)、神經(jīng)營養(yǎng)素3(NT-3)等的共同作用下,SCF可作為神經(jīng)干細胞的存活因子刺激神經(jīng)干細胞增殖。腦缺血能刺激嚙齒類動物增生區(qū)神經(jīng)再生。缺氧增加溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)進入細胞,表達出增殖標志物以及幼稚神經(jīng)元標記物,而沒有證據(jù)證實DNA破壞或半胱氨酸激酶3(Caspase-3)的激活。缺氧及干細胞因子刺激BrdU進入培養(yǎng)基。SCF受體在成年大鼠的增生區(qū)及培養(yǎng)細胞中均有表達,整體動物給予SCF能增加BrdU標記的幼稚神經(jīng)元。有研究表明,缺氧導致小鼠皮質(zhì)培養(yǎng)細胞神經(jīng)再生,這種作用是通過分泌SCF而出現(xiàn)的,SCF刺激培養(yǎng)細胞和整體動物皮質(zhì)側(cè)腦室旁區(qū)(SVZ)和海馬齒狀核顆粒下層(SGZ)神經(jīng)再生。還有許多因子可以刺激神經(jīng)再生,如表皮生長因子(EGF)、堿性成纖維細胞生長因子(FGF-2)、腦源性神經(jīng)生長因子(BDNF)。有個案報道加入神經(jīng)生長因子或過度表達該因子可以增加成人大腦整體狀態(tài)下的神經(jīng)再生。另有文獻報道,半球缺血觸發(fā)SGZ區(qū)的神經(jīng)再生,局灶性缺血誘發(fā)缺血周邊區(qū)皮質(zhì)再生,而局灶性腦缺血與FGF-2在海馬齒狀核祖細胞的增生有關。以往有研究顯示,小鼠短暫性前腦缺血15min后,齒狀回神經(jīng)干細胞增殖加速,再灌注3、7和10d時齒狀回和腦室周圍區(qū)神經(jīng)干細胞數(shù)增加,尤以7d時數(shù)量最多。Zhang等報道,成年MCAO大鼠除了室下區(qū)有神經(jīng)干細胞外,損傷側(cè)大腦皮質(zhì)也存在神經(jīng)干細胞增殖。腦缺血后2~14d,大腦皮質(zhì)神經(jīng)干細胞增多,7d達高峰,28d后大量減少。本