蠶絲蛋白的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)

蠶絲蛋白的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)

蠶是一種連續(xù)的長(zhǎng)纖維。在繭形成過(guò)程中，它們被分散液形成，具有“纖維女王”的美譽(yù)。這是人類最初使用的天然藥物之一。自上世紀(jì)80年代開(kāi)始,日本首先開(kāi)始了蠶絲新用途的研究,蠶絲蛋白用途不斷擴(kuò)大,產(chǎn)品日益增多。中國(guó)是天然蠶絲的故鄉(xiāng),發(fā)現(xiàn)并使用蠶絲有近5000年歷史。目前,我國(guó)蠶絲產(chǎn)量約占世界總產(chǎn)量的一半,資源極為豐富,對(duì)蠶絲蛋白進(jìn)行研究和開(kāi)發(fā)極具現(xiàn)實(shí)意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。蠶絲中的絲素蛋白純度高,具有兩性荷電的特殊性、良好的人體親和性、生物可降解性及細(xì)胞相容性,還具有優(yōu)良的可設(shè)計(jì)性,可制備成多孔狀、膜狀及管狀等多種形態(tài),是一種制備醫(yī)用仿生材料的理想素材。近年來(lái),絲素蛋白在人造皮膚、人造骨組織、人造血管、人造肌腱與韌帶、人造角膜以及人造尿道黏膜等仿生學(xué)領(lǐng)域已有較多的研究與應(yīng)用。1家蠶蛋白質(zhì)的組成和結(jié)構(gòu)1.1家蠶蛋白質(zhì)的組成1.2silp結(jié)構(gòu)天然蠶絲通過(guò)脫膠、溶解及透析后得到的再生絲素蛋白一般分子量有所減小,幾乎只含有絲素H鏈。一般認(rèn)為絲素蛋白具有無(wú)軌卷曲、silkⅠ、silkⅡ及silkⅢ四種結(jié)構(gòu)。silkⅠ和silkⅡ兩種構(gòu)型均能從溶解狀態(tài)的絲中獲得,最后獲得哪種結(jié)構(gòu)取決于結(jié)晶條件。silkⅠ結(jié)構(gòu)包括無(wú)規(guī)線團(tuán)與a-螺旋,親水性好,在濃溶液條件下容易形成,因此絲素的濃溶液比較穩(wěn)定,不易生成沉淀。在稀溶液中容易形成的silkⅡ結(jié)構(gòu)呈反平行β-折疊,相鄰鏈段的分子內(nèi)氫鍵及分子間引力使它們結(jié)合非常緊密,抵抗外力拉伸的能力較強(qiáng),在水中僅膨脹而不溶解,親水性差,容易結(jié)晶析出沉淀。ValluzziR等人發(fā)現(xiàn)了存在于絲素溶液-空氣界面上的一種新絲素結(jié)晶狀態(tài)silkⅢ,其晶體結(jié)構(gòu)與聚甘氨酸Ⅱ相似,肽鏈的立體構(gòu)像為β-折疊螺旋。2家蠶蛋白質(zhì)的生物學(xué)特性2.1家蠶蛋白質(zhì)的細(xì)胞相似性2.2絲綢蛋白質(zhì)的生物安全2.3絲綢蛋白質(zhì)的生物降解2蠶絲蛋白醫(yī)學(xué)的生物材料3.1蠶絲絲素蛋白理想的人造皮膚應(yīng)具有無(wú)毒、無(wú)抗原性、無(wú)局部刺激性、組織相容性好、微生物不能在上面生長(zhǎng)繁殖或穿透、柔軟隨形度優(yōu)良、與皮膚相似的透氣性、與創(chuàng)面的黏合性、創(chuàng)面肉芽組織得以長(zhǎng)入等一系列優(yōu)點(diǎn)。蠶絲中的絲素蛋白與人體皮膚組織的氨基酸構(gòu)成相近,生物相容性好,有良好的透氣性,對(duì)創(chuàng)面有良好的粘合力又無(wú)占位現(xiàn)象,若將絲素與其它高分子材料復(fù)合,則可獲得與正常皮膚相似的柔軟度,再加上絲素蛋白對(duì)皮膚細(xì)胞的生長(zhǎng)有促進(jìn)功能,使得愈創(chuàng)效果更加突出,因而蠶絲絲素蛋白是作為人造皮膚的理想材料。我國(guó)研究者已經(jīng)研制出絲素的多孔海綿材料,并對(duì)其孔隙度、力學(xué)性能、結(jié)構(gòu)變化等系列性質(zhì)作了詳盡分析,制備了用于創(chuàng)面覆蓋的絲素薄膜,對(duì)該材料的臨床效果作了評(píng)價(jià),認(rèn)為絲素膜具有良好的創(chuàng)面修復(fù)作用,是優(yōu)良的外科修復(fù)材料。張幼珠等研制出一種含抗菌藥物的絲素膜,臨床實(shí)驗(yàn)表明,將其覆蓋燒創(chuàng)面后,該絲素膜既有保護(hù)創(chuàng)面的作用,又有清除細(xì)菌、控制感染的作用。3.2絲素蛋白材料在骨髓炎加工中的應(yīng)用由于羥基磷灰石(HA)的化學(xué)組成及結(jié)構(gòu)與人體骨骼中的磷灰石相近,鈣磷摩爾比為1.67,與天然骨相似,因此以HA為主要成分的生物材料成為近幾年骨替代材料的研究熱點(diǎn),但HA壓縮強(qiáng)度低、抗疲勞程度差、生物可吸收性差、替代速度慢,植入體內(nèi)后容易出現(xiàn)疏松、遷移與破壞,因而,研究者們又致力于尋找更加優(yōu)良的骨修復(fù)及骨替代材料。絲素蛋白中含有較多羥基和羧基,能與鈣離子緊密結(jié)合,并誘導(dǎo)羥基磷灰石在絲素蛋白上礦化結(jié)晶,形成自組裝納米復(fù)合材料,進(jìn)而彌補(bǔ)HA作為骨替代材料的一些不足,李慕勤等人在該方面作了大量工作,為后續(xù)臨床實(shí)驗(yàn)提供了理論基礎(chǔ)。吳海濤等人的研究表明,經(jīng)化學(xué)修飾的蠶絲對(duì)軟骨細(xì)胞具有良好的吸附作用,并能維持軟骨細(xì)胞正常形態(tài)和功能,該項(xiàng)研究為蠶絲作為軟骨細(xì)胞立體培養(yǎng)時(shí)的天然支架提供了可靠依據(jù)。LiM等人也報(bào)導(dǎo)通過(guò)冷凍干燥的方法可獲得具有良好細(xì)胞吸附性能的支架材料。李罡等人將蠶絲蛋白通過(guò)氣流高壓靜電紡絲工藝制成納米纖維,并通過(guò)激光共聚焦顯微鏡對(duì)骨髓基質(zhì)細(xì)胞在氣電紡蠶絲蛋白納米纖維支架表面的早期黏附進(jìn)行觀察,發(fā)現(xiàn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞對(duì)氣電紡蠶絲蛋白無(wú)紡織物表現(xiàn)出良好的親和性,提示其作為骨組織替代工程材料的可能。3.3人造血管3.4人工肌腱和韌帶3.5人工角膜3.6人造陰道粘膜4蠶絲蛋白可生物降解的研究進(jìn)展我國(guó)是蠶絲大國(guó),資源豐富,歷史悠久。目前,蠶絲蛋白作為醫(yī)用仿生材料的研究與利用還非常有限,某些作用機(jī)理也不明確,因此,基于蠶絲蛋白的醫(yī)用仿生材料研究還任重而道遠(yuǎn)。家蠶絲素蛋白的氨基酸序列已被確定,若能從分子生物學(xué)與基因工程入手,培育出更加適應(yīng)人們需要的氨基酸序列品種,必將給蠶絲行業(yè)帶來(lái)歷史性的革命,同時(shí)也為我國(guó)醫(yī)藥事業(yè)提供更多的新方法、新途徑。蠶絲由20多種氨基酸組成,結(jié)構(gòu)復(fù)雜,內(nèi)層為絲素蛋白,外層被絲膠蛋白包覆。不同種類蠶絲中,絲素蛋白的含量不盡相同,但一般說(shuō)來(lái),絲素蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為70%～80%。絲素是由18種氨基酸所組成的天然蛋白(見(jiàn)表1),其中側(cè)基較為簡(jiǎn)單的甘氨酸Gly、丙氨酸Ala及絲氨酸Ser約占總質(zhì)量的75%,其中有8種為人體必需氨基酸。蠶絲蛋白除了含有C、H、O、N4種元素外,還含有多種其它元素,于同隱等人用質(zhì)子誘導(dǎo)X發(fā)射光譜對(duì)多種絲素蛋白進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)絲素蛋白還含有K、Ca、Si、Sr、P、Fe、Cu等元素,而這些元素的存在與蠶絲蛋白的性能及吐絲機(jī)理都有密切聯(lián)系。位于外層的絲膠蛋白是一種高分子量的球晶蛋白,鏈排列不緊密,且分子結(jié)構(gòu)支鏈上親水基團(tuán)含量較高,因此易溶于水、稀酸等極性溶劑。含絲膠的天然蠶絲是一種潛在過(guò)敏源,Soong和Kenyon對(duì)實(shí)施了白內(nèi)障手術(shù)的病人進(jìn)行了為期3年的跟蹤報(bào)道,結(jié)果表明,病人對(duì)天然蠶絲有嚴(yán)重的過(guò)敏反應(yīng),因此,作為生物醫(yī)學(xué)材料,蠶絲在使用過(guò)程中應(yīng)除去易引起過(guò)敏反應(yīng)的絲膠蛋白。InouyeK等人在絲素膜表面進(jìn)行成纖維細(xì)胞、皮膚表皮細(xì)胞的培養(yǎng),結(jié)果表明,細(xì)胞在絲素膜表面的黏附率及增值速度,與在膠原蛋白表面相近。Gotoh也發(fā)現(xiàn)用LiBr溶液溶解家蠶繭殼所得的再生絲素蛋白膜同樣支持細(xì)胞的黏附與生長(zhǎng)。Unger等考察了神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、上皮細(xì)胞、角化細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、纖維原細(xì)胞、造骨細(xì)胞等一系列細(xì)胞在絲素納米無(wú)紡布上的培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)正常,生長(zhǎng)情況良好。Jin等人發(fā)現(xiàn)絲素納米無(wú)紡網(wǎng)能夠支持人的骨髓間充質(zhì)細(xì)胞的黏附、增值,江瑩等也證實(shí)脫膠后的絲素確實(shí)具有良好的細(xì)胞親和力。蠶絲作為醫(yī)用縫合線已經(jīng)有幾百年的歷史,其生物安全性公認(rèn)是最好的。上海生物材料研究測(cè)試中心采用細(xì)胞增值度實(shí)驗(yàn)及溶血實(shí)驗(yàn),對(duì)醫(yī)用絲素蛋白再生膜進(jìn)行細(xì)胞毒性與溶血反應(yīng)的實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)所使用的再生膜無(wú)明顯細(xì)胞毒性。Sugihara等人研究了蠶絲無(wú)紡網(wǎng)植入體內(nèi)的反應(yīng),發(fā)現(xiàn)將之植入皮下后,在6個(gè)月內(nèi)沒(méi)有明顯的淋巴細(xì)胞滲入。高運(yùn)華等采集了凝血時(shí)間在正常值內(nèi)的血液樣品,將制備的絲素膜與血漿接觸,發(fā)現(xiàn)凝血時(shí)間基本保持不變,可見(jiàn)未經(jīng)任何處理的絲素膜本身具有良好的血液相容性及生物安全性。美國(guó)藥典對(duì)可生物降解的材料定義為:某種材料植入體內(nèi)后,60天以內(nèi)損失大部分強(qiáng)度。按這個(gè)定義來(lái)講,蠶絲是不可降解的。但Lam等認(rèn)為絲素對(duì)蛋白水解酶敏感,因此是可生物降解的,只是需要較長(zhǎng)時(shí)間,Soong等也認(rèn)同這一觀點(diǎn)。蘇州大學(xué)以六氟異丙醇溶解絲素液作為紡絲液,用乙醇為凝固液進(jìn)行濕法紡絲,制得了結(jié)晶度較低、有一定力學(xué)性能要求,又可被生物有效降解的醫(yī)用再生絲素纖維。李明忠等人的研究發(fā)現(xiàn),多孔絲素膜可被多種蛋白酶降解。這些研究都表明,蠶絲蛋白確實(shí)可被生物降解。一般說(shuō)來(lái),絲素在體內(nèi)被吸收的速率與移植點(diǎn)、機(jī)械環(huán)境、病體的生理特點(diǎn)等因素都有關(guān)系,且蠶絲處理過(guò)程中導(dǎo)致的蛋白構(gòu)象變化可能使絲素的生物降解程度發(fā)生改變。人的皮膚由表皮層和真皮層組成,位于內(nèi)層的真皮層被破壞后,皮膚不會(huì)再生,這時(shí)需要進(jìn)行皮膚移植。除了患者本人的皮膚,從外界移植來(lái)的皮膚一般難以生長(zhǎng)愈合,因此,現(xiàn)在人造皮膚的開(kāi)發(fā)研究?jī)H能治療真皮尚存的情況。生活中,骨損傷與骨缺損非常常見(jiàn),目前的骨修復(fù)方法主要有兩種:內(nèi)源骨修復(fù)和外源骨修復(fù)。內(nèi)源骨修復(fù)效果好,但骨源短缺,外源骨修復(fù)彌補(bǔ)了這一缺陷,但修復(fù)效果較差,且容易引發(fā)感染。醫(yī)學(xué)界一直使用金屬和有機(jī)高分子作為骨替代材料,但其生物相容性、人體親和性、與自然骨之間的力學(xué)相容性都與理想的骨修復(fù)和骨替代材料相差甚遠(yuǎn)。絲素蛋白中含有六種氨基酸殘基交替排列的結(jié)構(gòu),這種以重疊為主的物質(zhì),Ser之間的距離與甘磷酸中起抗凝血作用的硫酸基距離十分相似,因此,有人考慮利用絲素的特殊結(jié)構(gòu)來(lái)制造抗凝血物質(zhì)。由于絲素蛋白的抗凝血作用,將絲素溶液干燥成膜,就可以利用它制造人工血管。硫酸處理過(guò)的絲素蛋白顯示出較好的抗凝血活性。在進(jìn)一步的研究中,發(fā)現(xiàn)使用氯化硫酸來(lái)代替濃硫酸,藥物的抗凝血活性約提高100倍,活性達(dá)到肝細(xì)胞數(shù)20%左右。黃福華等用絲素蛋白浸漬涂抹滌綸人工血管內(nèi)外壁并用甲醛交聯(lián)固定,發(fā)現(xiàn)滌綸人工血管在涂層了絲素蛋白后滲水率下降了99%,植入時(shí)不用預(yù)凝,達(dá)到了節(jié)省手術(shù)時(shí)間及減少輸血風(fēng)險(xiǎn)的效果,并且該材料還有較好的生物降解性能。還有研究者報(bào)導(dǎo),在絲素蛋白膜表面有效地接枝磺酸基團(tuán),材料的抗凝血活性將顯著提高,這樣制成的磺酸化蠶絲能使血液在24h內(nèi)保持非凝固狀態(tài),同時(shí),成本也大大降低,從而使人工血管的制造與應(yīng)用前景更加廣闊。蠶絲的強(qiáng)度與彈性系數(shù)與生物體的肌腱有近似的數(shù)值,又具有良好的生物相容性,因此有望用于開(kāi)發(fā)人工肌腱與人工韌帶。在絲素蛋白中導(dǎo)入帶電化合物后,可加速其與鈣、磷酸基團(tuán)的凝聚程度,改性后的絲素蛋白可與生物骨質(zhì)成分中的羥磷灰石結(jié)晶基因緊密結(jié)合,絲素鈣的凝聚量大幅提高,從而提供了利用絲素蛋白復(fù)合物制造人工肌腱與人工韌帶的可能性。在絲素水溶液中添加甲醛、乙烯基化合物等物質(zhì)會(huì)使之發(fā)生重合反應(yīng),制得一種在含水狀態(tài)下透氧率與羥乙基異丁烯酸酯化合物幾乎相當(dāng)?shù)膬?yōu)質(zhì)絲素膜,在處理過(guò)程中,甲醛的處理時(shí)間會(huì)影響該絲素膜的透氧性能。該絲素膜與