番茄細(xì)菌性青枯病的防治研究

番茄細(xì)菌性青枯病的防治研究

0篩選和篩選生防菌劑植物細(xì)胞象（ralticformer）是一種毀滅性的土傳性疾病。廣泛分布于熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū)，在中國(guó)南方省、自治區(qū)、直轄市均有嚴(yán)重發(fā)生。生物防治一直是解決土傳病害研究重點(diǎn)。以往研究多利用無(wú)致病力青枯菌或從土壤、植物根際篩選生防菌防治該病,均存在防效不穩(wěn)定的問(wèn)題。龍良鯤等和黎起秦等從番茄根內(nèi)分離出青枯病的內(nèi)生拮抗菌,也有一定的防效;但其在自然土壤中缺乏競(jìng)爭(zhēng)力,用于大田防治青枯菌有一定的困難。作為外源微生物的生防菌在新的微生態(tài)環(huán)境中難以快速繁殖,在生態(tài)位的競(jìng)爭(zhēng)中不敵土著微生物,故難以有效的定殖,發(fā)揮不出其應(yīng)有的拮抗作用。為此,本文從微生態(tài)系統(tǒng)考慮,篩選構(gòu)建由能拮抗青枯病病原菌的拮抗菌和與之協(xié)同、在土壤中可快速繁殖的營(yíng)養(yǎng)菌組成的復(fù)合菌劑。該復(fù)合菌劑進(jìn)入土壤后,可快速定殖,抑制青枯病的繁殖。目前少有用這樣的復(fù)合菌劑作為對(duì)土傳病害開(kāi)展生物防治的報(bào)道。1材料和方法1.1土壤中kno3的土壤制備初篩培養(yǎng)基:牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、高氏一號(hào)培養(yǎng)基和馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA)。復(fù)篩培養(yǎng)基:Ca(NO3)20.1g,K2HPO40.4g,KNO30.1g,MgSO4·7H2O0.3g,FeCl30.01g,土壤浸出液200mL(取肥沃菜園土200g,加水200mL,煮沸1h,隨時(shí)補(bǔ)充失去水分,過(guò)濾,濾液補(bǔ)足200mL),水800mL。1.2肥的理化性質(zhì)和有機(jī)質(zhì)番茄品種為紅寶石,是青枯病易感品種;病土是華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院番茄青枯病試驗(yàn)地的連作菜園土,有機(jī)質(zhì)為32.09g·kg-1,全氮為1.594g·kg-1,pH=5.47,堿解氮為87.7mg·kg-1,速效磷為87.2mg·kg-1,速效鉀為355.7mg·kg-1;有機(jī)肥為番禺青綠公司生產(chǎn)的固體肥,有機(jī)質(zhì)為369.9g·kg-1,全氮為21g·kg-1,全磷為5.9g·kg-1,全鉀為5.1g·kg-1;化學(xué)肥料用化學(xué)純尿素、氯化鉀和磷酸二氫鉀。1.3soli1方法青枯假單胞桿菌(Pseudomonassolanacearum)由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院植物病理研究室提供;番茄青枯病病株由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院提供。1.4選擇和構(gòu)建復(fù)合抗菌劑1菌落形態(tài)的獲得營(yíng)養(yǎng)菌系的篩選原則是培養(yǎng)條件粗放,且能在土壤中快速繁殖,與拮抗菌系協(xié)同生長(zhǎng)。從菜園土、雞糞堆肥和城市園林垃圾等中取樣,采用稀釋分離法。取稀釋度10-5、10-6和10-7各0.1mL在初篩培養(yǎng)基上涂平板,于40℃培養(yǎng)48～72h,挑取不同形態(tài)的單菌落,進(jìn)行純化。再將初篩得到的細(xì)菌、酵母制成密度為108cfu·mL-1的菌懸液,霉菌和放線菌制成109cfu·mL-1的孢子懸液,按3%的接種量分別接種于裝有140mL土壤浸出液培養(yǎng)基的250mL錐形瓶,于140r·min-1,40℃培養(yǎng)48～72h,選出長(zhǎng)勢(shì)旺盛的菌株。2培養(yǎng)基的制備從華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院番茄青枯病試驗(yàn)地的連作菜園土中取根圍和根際土壤,采用稀釋分離法。取稀釋度10-5、10-6和10-7各0.1mL在初篩培養(yǎng)基上涂平板,于30℃培養(yǎng)48～72h,挑取不同形態(tài)的單菌落進(jìn)行純化,土壤浸出液復(fù)篩后進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。抑菌試驗(yàn)采用平板測(cè)定法。將復(fù)篩得到的營(yíng)養(yǎng)菌和拮抗菌在對(duì)應(yīng)的平板培養(yǎng)基上涂布,30℃條件下培養(yǎng)48～72h,使其長(zhǎng)滿整個(gè)平板,用打孔器制成直徑為6mm的瓊脂圓塊。將普通細(xì)菌培養(yǎng)基熔化后冷卻到45℃左右,然后加入番茄青枯病菌作指示菌,搖勻后迅速倒入培養(yǎng)皿制成平板。待凝固后,每個(gè)平板等距離放入以上瓊脂圓塊,于4℃靜置12h,讓瓊脂里的次生代謝物質(zhì)充分?jǐn)U散到下層培養(yǎng)基。置30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h,觀察抑菌圈,選出抑菌圈直徑大的菌株。3復(fù)合菌劑的制備用以上平板測(cè)定法測(cè)定復(fù)選的營(yíng)養(yǎng)菌系和拮抗菌系各菌種間兩兩拮抗作用,選出相互間無(wú)拮抗或拮抗作用較小的營(yíng)養(yǎng)菌系和拮抗菌系,將細(xì)菌、酵母制成密度為108cfu·mL-1的菌懸液,霉菌和放線菌制成109cfu·mL-1的孢子懸液,按3%的總接種量接種于裝有140mL土壤浸出液培養(yǎng)基的250mL錐形瓶,于140r·min-1,35℃混合發(fā)酵72h,得到復(fù)合菌劑。發(fā)酵后其總含菌量不少于6.5×109cfu·mL-1。1.5復(fù)合菌劑的制備方法按1.4的混合發(fā)酵工藝,用分光光度法(550nm)測(cè)定不同培養(yǎng)溫度(25℃、30℃、35℃、40℃和50℃)對(duì)復(fù)合菌劑生長(zhǎng)的影響。用0.1%的HCl溶液和0.1%的NaOH溶液將土壤浸出液培養(yǎng)基的pH值分別調(diào)為3、4、5、6、7、8和9,用分光光度法(550nm)測(cè)定各pH值下復(fù)合菌劑生長(zhǎng)。1.6文獻(xiàn)培養(yǎng)基的制備依據(jù)趙斌等的方法,將番茄青枯病菌制成109cfu·mL-1菌懸液,吸取1mL于培養(yǎng)皿,倒入20mL的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基,搖勻。稱取1g病土和研碎的番茄青枯病病株的莖組織,加入裝有100mL滅菌的生理鹽水的250mL三角瓶中,充分浸提后,稀釋至105～106倍,吸取各提取液1mL于培養(yǎng)皿。每種提取液分別倒入20mL的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基,搖勻。待培養(yǎng)基凝固后,每個(gè)平板等距離放入2個(gè)牛津杯,使其緊貼培養(yǎng)基表面。各牛津杯均吸入0.2mL復(fù)合菌劑。平板置4℃,12h,讓菌劑里的物質(zhì)充分?jǐn)U散到下層培養(yǎng)基。置30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h,記錄抑菌圈直徑。1.7不同施肥量的確定試驗(yàn)設(shè)3個(gè)處理:1)CK。不作任何接種處理;2)T1。接入濃度為6.5×108cfu·mL-1的復(fù)合菌劑30mL·kg-1土;3)T2。接入濃度為5×108cfu·mL-1青枯病病菌液20mL·kg-1土,復(fù)合菌劑30mL·kg-1土。每處理設(shè)4個(gè)重復(fù)。每盆4kg土壤。將化學(xué)肥料(占總施肥量的60%)及青綠固體有機(jī)肥(占總施肥量的20%)作為基肥,與土壤混勻,再按以上處理將病菌液和復(fù)合菌劑一并混勻,倒入瓦盆。每天噴水保持土壤濕度在30%～50%之間,讓菌種活化1周后移栽已長(zhǎng)4葉的番茄苗,每盆2株,共8株番茄。2004年7月12日育苗,7月31日移栽,9月21日收獲。移栽15d、34d后追肥兩次。每次追施10%化肥,使所有處理氮、磷、鉀的施入量相等,即N,120mg·kg-1土;P,80mg·kg-1土;K,100mg·kg-1土。不足部分由無(wú)機(jī)肥補(bǔ)足。番茄生長(zhǎng)期間觀察并記錄發(fā)病情況。2結(jié)果與分析2.1復(fù)合菌系對(duì)番茄青枯病菌生長(zhǎng)和抗性的影響營(yíng)養(yǎng)菌系初選出21株細(xì)菌、8株霉菌、7株酵母和3株放線菌。土壤浸出液培養(yǎng)復(fù)選出7株細(xì)菌、2株霉菌和3株酵母。拮抗菌系初選出10株細(xì)菌、2株霉菌和2株放線菌,復(fù)選出2株細(xì)菌和1株放線菌。再經(jīng)菌間拮抗測(cè)定,最后篩選出4株細(xì)菌、1株霉菌、2株酵母和1株放線菌。經(jīng)鑒定,分別為地衣形芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)(Y1)、蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)(Y2)、產(chǎn)黃纖維單胞菌(Cellulomonasflavigena)(Y3)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtillis)(J1)、綠色木霉(Trichodermaviride)(Y4)、產(chǎn)朊假絲酵母(Candidautilis)(Y5)、釀酒酵母(Saccharomycesrevisiae)(Y6)和細(xì)黃鏈霉菌(Streptomycesmicroflavus)(J2)。復(fù)合菌系在土壤浸出液培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況和對(duì)番茄青枯病菌抑菌試驗(yàn)的結(jié)果見(jiàn)表1,菌間拮抗結(jié)果見(jiàn)表2。復(fù)篩過(guò)程中被淘汰的菌株數(shù)據(jù)略。由表1可知,營(yíng)養(yǎng)菌系中的Y1、Y3和拮抗菌系中的J1、J2對(duì)番茄青枯病病原菌有較強(qiáng)的拮抗作用,且在土壤浸出液培養(yǎng)基中生長(zhǎng)旺盛;其他菌種則對(duì)病原菌無(wú)拮抗作用,也能在土壤浸出液中較快生長(zhǎng)。表2顯示,營(yíng)養(yǎng)菌系中的Y1對(duì)Y2、Y3和J1有不同程度的拮抗作用,但較其對(duì)病源菌的拮抗作用小;Y2對(duì)J1也有輕微的拮抗。拮抗菌系中J1對(duì)Y2和Y5也有一定的拮抗作用;J2則對(duì)所有菌種都有不同程度的拮抗作用,尤其對(duì)病原菌強(qiáng)烈拮抗作用,宜讓其單獨(dú)發(fā)酵,然后與其他菌種的混合發(fā)酵液一起使用。2.2復(fù)合菌劑ph值對(duì)od650mn值的影響圖1顯示,在25～40℃范圍內(nèi)較為適合復(fù)合菌劑生長(zhǎng),其中35℃時(shí)的OD550nm值最高,40℃時(shí)的OD550nm值略低。這說(shuō)明復(fù)合菌劑耐高溫性較好。復(fù)合菌劑在pH值為6.0～8.0范圍內(nèi)生長(zhǎng)較好(見(jiàn)圖2)。在pH=7.0時(shí),OD550nm值最高;在pH=6.0時(shí),OD550nm值也較高?？梢?jiàn)復(fù)合菌劑較適合在微酸性環(huán)境下生長(zhǎng)。酸堿度適應(yīng)范圍為pH=6.0～8.0,最適pH值6.6,微酸性土壤發(fā)病重;青枯病病原菌生長(zhǎng)發(fā)育溫度為10～37℃。土溫在20℃以上,病菌開(kāi)始活動(dòng),25℃時(shí)活動(dòng)最盛。復(fù)合菌劑生長(zhǎng)條件與病原菌的基本一致,且生長(zhǎng)條件粗放,并含有對(duì)病原菌有較強(qiáng)拮抗作用的菌種,可以預(yù)見(jiàn)生防效果較好。2.3復(fù)合菌劑抑菌效果復(fù)合菌劑的抑菌效果見(jiàn)表3。復(fù)合菌劑在營(yíng)養(yǎng)和PDA平板上對(duì)番茄青枯病菌,在營(yíng)養(yǎng)和PDA平板上對(duì)病土中的病原菌,在營(yíng)養(yǎng)和PDA平板上對(duì)番茄青枯病病株提取液的抑菌圈直徑分別為2.28cm、2.12cm,2.88cm、2.20cm,1.18cm和0.98cm。這說(shuō)明復(fù)合菌劑對(duì)番茄青枯病菌、致病源中的微生物及侵入到番茄青枯病株中的微生物均有拮抗作用。復(fù)合菌劑較單一拮抗菌好(表1中,其最大抑菌圈直徑為1.79cm),且對(duì)于侵入到番茄青枯病病株的具有較高活性和致病性的微生物也表現(xiàn)出較好的抑制作用。黎起秦等分離出來(lái)的5株拮抗真菌對(duì)番茄青枯病菌抑菌直徑在0.91～1.41cm之間,本試驗(yàn)的復(fù)合菌劑抑菌作用較單一真菌的效果好。因此,有必要進(jìn)一步研究盆栽條件下對(duì)番茄青枯病的防病效果。2.4復(fù)合菌劑對(duì)番茄青枯病的影響各處理的番茄青枯病發(fā)病情況見(jiàn)圖3。由圖3可知,CK最早發(fā)病,在移栽后21d已經(jīng)發(fā)現(xiàn)發(fā)病;在移栽55d時(shí)發(fā)現(xiàn)5株病株,發(fā)病情況最為嚴(yán)重。這說(shuō)明連作土確實(shí)潛伏著大量青枯菌。施入復(fù)合菌劑的處理能延緩番茄青枯病8～19d發(fā)病,且病株數(shù)減少2～3株,能較明顯地減輕發(fā)病情況。其中T1能最大限度延緩發(fā)病時(shí)間,且防病效果明顯;而T2處理由于接入了青枯病病菌液,發(fā)病株數(shù)較T1略有提高。這表明,防病效果是病菌和抑病的復(fù)合菌劑共同作用的結(jié)果,土壤病菌基數(shù)高低以及防病的復(fù)合菌劑的加入與否對(duì)防病效果有較大影響。3菌種組成及最佳比例的確定利用無(wú)致病力青枯菌菌株、拮抗細(xì)菌、菌根真菌等方法對(duì)青枯病進(jìn)行生物防治,定殖能力是影響防效的一個(gè)重要因素。本文從微生態(tài)系統(tǒng)考慮,篩選并構(gòu)建出的復(fù)合菌劑與傳統(tǒng)的施單一拮抗菌或內(nèi)生菌不同。該復(fù)合菌劑不但有直接拮抗病原菌的拮抗菌系,還包括與拮抗菌系有協(xié)同作用,在土壤中能快速繁殖,從營(yíng)養(yǎng)和生態(tài)位競(jìng)爭(zhēng)角度間接抑制病原菌的營(yíng)養(yǎng)菌系。兩者聯(lián)合作用,可快速定殖,又可抑制病原菌,從而顯現(xiàn)較好的生防效果。本文試驗(yàn)結(jié)果表明,復(fù)合菌劑有較好的協(xié)同關(guān)系,但J2則對(duì)所有菌種有不同程度的拮抗作用;因此單獨(dú)發(fā)酵后再與其他菌種的混合發(fā)酵液一起使用。王偉東等篩選出1組未完全明確其微生物組成及結(jié)構(gòu)的,具有比純培養(yǎng)微生物更好的,功能、性質(zhì)、組成穩(wěn)定的木質(zhì)纖維素分解菌復(fù)合系。菌系中的各菌株是不可分的,從中分離出來(lái)的穩(wěn)定存在的5種菌種,再混合培養(yǎng)卻不具分解能力。這樣的復(fù)合菌系可能含有某些未知菌種和特定成分。本文構(gòu)建復(fù)合菌劑的思路,是在了解有關(guān)菌種特性的基礎(chǔ)上,根據(jù)用途把幾種所用菌株進(jìn)行恰當(dāng)組合,使之優(yōu)化,營(yíng)養(yǎng)和拮抗性能比原有水平再提高一步,使復(fù)合菌系發(fā)揮協(xié)同、共生、加強(qiáng)等作用。這樣構(gòu)建的復(fù)合菌系種類是完全確定的,既擁有純培養(yǎng)菌株?duì)I養(yǎng)要求單一,生理代謝穩(wěn)定,易于調(diào)控等優(yōu)點(diǎn),又具有混合培養(yǎng)的功能,這為以后構(gòu)建高效生防菌提供了一條重要的技術(shù)途徑。復(fù)合菌劑中的菌種均從自然環(huán)境中篩選得來(lái),對(duì)環(huán)境友好,且培養(yǎng)條件粗放,在25～40℃和pH=6.0～8.0能較好生長(zhǎng)。在平板培養(yǎng)條件下對(duì)番茄青枯病病原菌、病土及番茄青枯病株中微生物均有明顯拮抗作用;施入土壤后,能較快的定殖,抑制青枯病病菌的繁殖,延緩連作土發(fā)病時(shí)間并減輕發(fā)病情況;即使在土壤里加入青枯病病原菌,強(qiáng)化其致病作用后,仍能顯示其防病效果。在研究番茄青枯病的施肥防治方面,蔡燕飛等通過(guò)施用有機(jī)肥從營(yíng)養(yǎng)水平上調(diào)控土壤微生物的菌群結(jié)構(gòu)。若根據(jù)青枯病發(fā)生規(guī)律,配合適當(dāng)比例的有機(jī)肥和復(fù)合菌劑或制成微生物肥料后作為基肥,并在適當(dāng)?shù)臅r(shí)候追施菌劑,充分發(fā)揮“基質(zhì)-菌群”效應(yīng),實(shí)行從營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)到微生物拮抗的全方位生態(tài)調(diào)控,可能會(huì)取得更好的抗病效果。本文初步研究