第6章 各類化學(xué)成分分析1

1第六章

各類化學(xué)成分分析2講授內(nèi)容第1節(jié)生物堿類成分分析第2節(jié)黃酮類成分分析第3節(jié)三萜皂苷類成分分析第4節(jié)醌類成分分析第5節(jié)揮發(fā)性成分分析第6節(jié)木脂素類成分分析第7節(jié)其它類型成分分析3第一節(jié)生物堿類成分分析概述理化性質(zhì)鑒別含量測定4一、概述生物堿是生物界除生物體必需的含氮化合物（如氨基酸、蛋白質(zhì)和B族維生素等）之外的所有含氮有機化合物，因其結(jié)構(gòu)中氮原子上的未共享電子對而大多具有堿性。含生物堿成分的常用中藥：山豆根、制川烏、馬錢子、延胡索、苦參、麻黃、黃連、黃柏、防己等小檗堿麻黃堿烏頭堿水蘇堿6二、理化性質(zhì)物理性狀溶解性紫外光譜特征顯色反應(yīng)7物理性狀液體狀的生物堿及個別小分子生物堿有揮發(fā)性甚至升華性如：麻黃堿具有揮發(fā)性咖啡因具有升華性生物堿通常無色，但有長共軛結(jié)構(gòu)，并有助色團的，可顯不同顏色。如：小檗堿黃色8溶解性大多數(shù)生物堿難溶于水，易溶于氯仿、乙醚、乙醇、丙酮及苯等有機溶劑與酸結(jié)合成鹽生水溶性增加，但酸不同，生成的鹽水溶性有差異季胺型生物堿、有氮氧配位鍵的生物堿易溶于水。9溶解性液體生物堿及一些小分子固體生物堿則既溶于水也可溶于有機溶劑含有酸性官能團或酯鍵的生物堿還可溶于一些堿液或熱苛性堿液10顯色反應(yīng)生物堿在一定pH條件下與一些酸性染料（多為磺酸肽類）生成有色配合物，可被氯仿等有機溶劑定量提出。結(jié)構(gòu)中具有酯鍵的酯堿，如：烏頭堿可與異羥肟酸鐵試劑反應(yīng)產(chǎn)生紫紅色11紫外光譜特征結(jié)構(gòu)中具有共軛體系的生物堿均有紫外吸收。結(jié)構(gòu)中的氮原子與發(fā)色團直接連接或參與發(fā)色團的生物堿，其吸收峰位置與測定時溶劑的pH值有關(guān)。12三、鑒別沉淀法薄層色譜法氣相色譜法高效液相色譜法一般理化鑒別色譜鑒別131、沉淀反應(yīng)大多數(shù)生物堿在酸性水溶液可與某些試劑生成不溶于水的復(fù)鹽或分子復(fù)合物。酸性aq：KI-I2(棕紅↓)；BiI3·KI(橘紅～黃↓)；HgI2·2KI(類白↓)；硫氰酸鉻銨(雷氏銨鹽NH4[Cr(NH3)2(SCN)4](紅↓)中性：苦味酸(三硝基苯酚)(黃↓)中藥水浸液中蛋白質(zhì)、多肽和鞣質(zhì)等成分，也可與生物堿沉淀試劑生成沉淀，需排除干擾，防止出現(xiàn)假陽性結(jié)果。季銨鹽↓劑142薄層色譜法吸附劑：硅膠、氧化鋁展開劑：多用氯仿、苯等低極性溶劑，加入其它溶劑調(diào)整展開劑的極性。（由于硅膠顯弱酸性，強堿性的生物堿在硅膠板上能形成鹽，使Rf值很小或拖尾，形成復(fù)斑。在硅膠吸附薄層中，常用堿性系統(tǒng)或在堿性環(huán)境下展開。）顯色劑：改良碘化鉍鉀試劑，有時噴碘化鉍鉀試劑后再噴硝酸鈉試劑，可使樣品斑點更清晰；亦可用碘蒸氣、硫酸鈰、碘鉑酸等。15例：三妙丸中黃柏及小檗堿的鑒別

(蒼術(shù)、黃柏、牛膝)

取三妙丸粉末0.1g,加乙醚10ml，超聲處理15分鐘，濾過，棄去乙醚液，殘渣加甲醇5ml，超聲處理15分鐘，濾過，濾液濃縮至1ml，作為供試品溶液。另取黃柏對照藥材0.1g，同制成對照藥材溶液。再取鹽酸小檗堿對照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作為對照品溶液。吸取供試品溶液2ml、對照藥材溶液與對照品溶液各1ml，分別點于同一硅膠G薄層板上，以苯-乙酸乙酯-甲醇-異丙醇-濃氨試劑(12∶6∶3∶3∶1)為展開劑，置氨蒸氣預(yù)飽和的展開缸內(nèi)，展開，取出，晾干，置紫外燈(365nm)檢視，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的黃色熒光斑點；在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的一個黃色熒光斑點。162紙色譜法可用于生物堿鹽或游離堿的鑒別。主要是以水為固定相的正相紙色譜法，分離效果常取決于流動相的性質(zhì)。BAW系統(tǒng)顯色劑：基本和薄層色譜法相同，但含硫酸的試劑不適用。173高效液相色譜法依據(jù)：tR條件不同時，可已知品作內(nèi)標(biāo)，采用峰面積或峰高加大法優(yōu)點：快速，靈敏、微量等18四、含量測定生物堿的含量測定方法早期常用酸堿滴定法、沉淀滴定法等經(jīng)典的化學(xué)方法，近年來多采用分光光度法、薄層色譜法及高效液相色譜法等（一）總生物堿的含量測定（二）生物堿類單體成分的含量測定19（一）總生物堿的含量測定直接測定法重量分析法酸堿滴定法離子對萃取比色法酸染料比色法苦味酸鹽比色法雷氏鹽比色法異羥肟酸鐵比色法化學(xué)分析法分光光度法本法適用于處方藥味較少、內(nèi)成分較簡單的中藥制劑20酸堿滴定分析法強堿滴定生物堿鹽時，在70％～90％的乙醇介質(zhì)中終點比在水中明顯，因此常將生物堿鹽溶于70％～90％乙醇，再用標(biāo)準(zhǔn)堿-乙醇液滴定。若選擇的溶劑及指示終點方法合適，也可用非水滴定法進行。21酸堿滴定分析法指示終點方法電位法指示劑水溶液中非水溶液溴酚藍甲基紅溴甲酚藍酚酞溴酚藍甲基黃結(jié)晶紫凈化-中性氧化鋁；空白試驗22例止喘靈注射液中總生物堿的含量測定—酸堿滴定法處方麻黃洋金花苦杏仁連翹方法精密量取止喘靈注射液10ml，置分液漏斗中，加1mol/L氫氧化鈉溶液0.5ml，用三氯甲烷提取4次，（10ml、10ml、5ml、5ml）合并三氯甲烷液，置具塞錐形瓶中，精密加硫酸滴定液（0.01mol/L）10ml及新沸過的冷水10ml，充分振搖，加茜素黃酸鈉指示劑1-2滴，用氫氧化鈉滴定液（0.02mol/L）滴定至淡紅色，并將滴定結(jié)果用空白實驗校正。每1ml硫酸滴定液相當(dāng)于3.305mg的麻黃堿（C10H15NO）。變色范圍：3.7～5.2黃→紫23重量分析法重量分析法提取重量法沉淀法適用：混合堿、未知結(jié)構(gòu)、M差異大優(yōu)點：簡便、不用換算因數(shù)無需知M缺點：揮發(fā)性、堿性條件下可水解生物堿不適用；取樣大、操作易乳化、費時優(yōu)點：取樣少、靈敏度高缺點：計算復(fù)雜、操作繁瑣24例昆明山海棠片中總生物堿成分的含量測定—重量法處方昆明山海棠取昆明山海棠片60片，除去糖衣，研細(xì)，取約相當(dāng)于25片的量，精密稱定，置200ml錐形瓶中，加適量硅藻土（每1g中加入硅藻±0.2g），混勻，加乙醇70ml，加熱回流40分鐘，放冷，濾過，濾渣再加乙醇50ml，加熱回流30分鐘，放冷，濾過，合并濾液，置水浴上蒸干，殘渣加鹽酸溶液（1→100）30ml，置水浴上攪拌使溶解，放冷，濾過，殘渣再用鹽酸溶液（1→200）同法提取3次（20ml、15ml、15ml），合并濾液溶于分液漏斗中，加氨試劑使溶液呈堿性，用乙醚振搖提取4次（40ml、30ml、25ml、25ml），合并乙醚液，用水振搖洗滌2次，每次10ml，乙醚液濾過，濾液置已在100℃干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，在低溫水浴上蒸去乙醚，殘渣中加入少許無水乙醇，蒸干，在100℃干燥至恒重，稱定重量，計算，即得。252分光光度法-直接測定法不經(jīng)過化學(xué)反應(yīng)，利用生物堿物質(zhì)自身的光吸收直接進行比色測定的方法。一般用于藥味較少，干擾不大的中藥制劑中總生物堿的含量測定。如：戊己丸26（2）比色法生物堿本身具有的顏色與氧化劑產(chǎn)生顏色因所具有的功能基與試劑反應(yīng)產(chǎn)生顏色根據(jù)生物堿的通性與酸性染料、雷氏鹽、苦味酸鹽等結(jié)合成有色化合物，并能溶于有機溶劑中的271）酸性染料比色法應(yīng)用本法的關(guān)鍵在于介質(zhì)的pH、酸性染料的種類和有機溶劑的選擇。常用的酸性燃料：甲基橙溴香草酚藍（BTB）溴甲酚綠等281）酸性染料比色法-基本原理291）酸性染料比色法pH的選擇：根據(jù)染料的性質(zhì)及生物堿的堿性（pKb

）大小確定。一元5.2～6.4二元3.0～5.8常用的酸性染料：甲基橙、溴香草酚藍（BTB）、溴甲酚綠等有機溶劑的選擇原則：根據(jù)離子對與有機相能否形成氫鍵以及形成氫鍵能力的強弱，氯仿等是常用的提取溶劑。在提取過程中，嚴(yán)防水分混入有機溶劑。30例風(fēng)濕骨痛膠囊中烏頭總生物堿的含量測定——酸性染料比色法方法對照品溶液制備精密稱取經(jīng)1050C干燥至恒重的烏頭堿對照品10mg，至100ml量瓶中，加三氯甲烷溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得（每1ml中含烏頭堿0.1mg）。31標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密量取對照品溶液0ml、1ml、2ml、3ml、4ml、5ml，分別置于分液漏斗中，依次精密加入三氯甲烷20ml，再精密加入pH3.0醋酸鹽緩沖液（稱取無水醋酸鈉0.15g，加水使溶解，加冰醋酸5.6ml，用水稀釋至500ml，搖勻，并在pH計上校正）10ml和0.1%溴甲酚綠（取溴甲酚綠0.2g加0.05mol/L氫氧化鈉溶液3.2ml使溶解，用水稀釋至200ml，搖勻）2ml，強力振搖5分鐘，靜置20分鐘，分取三氯甲烷液，用干燥濾紙濾過，以相應(yīng)試劑為空白，濾液照分光光度法，分別在412nm的波長處測定吸收度。以吸收度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。32測定法取裝量差異項下的內(nèi)容物，研細(xì)，取1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入乙醚-三氯甲烷-無水乙醇（16∶8∶1）的混合溶液25ml和氨試液1.5ml，搖勻，稱定重量，于快速混勻器上振蕩三次，每次2分鐘，放置過夜，稱定重量，用上述混合溶液補足減失的重量，再于快速混勻器上振蕩2分鐘，靜置，傾取上清液，精密量取5.0ml，置分液漏斗中，加乙醚5ml，用0.05mol/L的硫酸溶液提取4次，每次10ml，分取硫酸液，濾過，合并濾液，置另一分液漏斗中，33加濃氨試劑4ml，搖勻，用三氯甲烷提取4次，每次10ml，分取三氯甲烷層，濾過，合并濾液，蒸干，殘渣于105℃加熱1小時，取出，放冷，加三氯甲烷分次溶解，轉(zhuǎn)移至25ml量瓶中，加三氯甲烷至刻度，搖勻，精密量取20ml，置分液漏斗中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項下的方法，自“精密加入pH3.0醋酸鹽緩沖液10.00ml”起，依法測定吸收度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中烏頭堿的量（μg/ml）計算，即得。

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該法為酸性染料分光光度法，其水相pH的選擇是離子對萃取法取得成功與否的關(guān)鍵，風(fēng)濕骨痛膠囊測定時的pH是分別取烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)液以pH2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、5.8、6.0、6.2的緩沖液進行試驗結(jié)果，表明以pH3.0較為適宜，在該條件下測定供試液吸收度較大，指示液空白試驗吸收度較小，且呈色穩(wěn)定性較好。352）苦味酸鹽比色法在弱酸性或中性溶液中生物堿可與苦味酸定量生成苦味酸鹽沉淀，該沉淀可溶于氯仿等有機溶劑，也可以在堿性條件下解離釋放出生物堿和苦味酸。363）雷氏鹽比色法雷氏鹽在酸性介質(zhì)中可與生物堿類成分定量地生成難溶于水的有色合物。將沉淀過濾洗凈后溶于丙酮（或甲醇），直接比色法測定，換算成生物堿含量。也可精密加入過量的雷氏鹽試劑，濾除生成的生物堿雷氏鹽沉淀，將濾液在520～526nm（溶于甲醇時，其λmax為427nm）處進行比色，測定殘存的過量的雷氏鹽含量，間接計算生物堿的含量。37硫氰化鉻銨在丙酮中的摩爾吸收系數(shù)ε=106．5（單鹽），故可根據(jù)其吸收值A(chǔ)按下式直接測定而不需繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

W一被測物重量（mg）M一被測物質(zhì)的分子量V一溶解沉淀所用丙酮的ml數(shù)38雷氏鹽比色法注意事項

雷氏鹽的水溶液在室溫可分解，故用時應(yīng)新鮮配制，沉淀也需在低溫進行供試品如為稀的水溶液（如注射劑等），沉淀前應(yīng)濃縮,對于中藥制劑含有干擾物質(zhì)時，應(yīng)事先經(jīng)過純化處理雷氏鹽的丙酮或丙酮一水溶液的吸收值，隨時間而有變化，故應(yīng)盡快地測定。39處方益母草當(dāng)歸人參黃芪何首烏桃仁蒲黃熟地黃香附昆布白術(shù)黑木耳對照品溶液制備取鹽酸水蘇堿對照品適量，精密稱定，加0.1mol/L鹽酸溶液制成每1ml含1mg的溶液，即得。供試品溶液的制備取裝量差異下的內(nèi)容物，研細(xì)，取12g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入乙醇50ml，超聲處理30分鐘，濾過，精密量取續(xù)濾液25ml，置50ml燒杯中，置水浴上蒸干，精密加入0.1mol/L鹽酸溶液10ml使溶解，即得。

例產(chǎn)婦康顆粒中益母草總生物堿的含量測定—雷氏鹽比色法40測定法取上述對照品溶液和供試品溶液，各加活性炭0.5g，置水浴上加入1分鐘，攪拌，濾過，濾液分別置25ml量瓶中，用0.1mol/L鹽酸溶液10ml分次洗滌燒杯和濾器，洗滌液并入同一量瓶中；另取0.1mol/L鹽酸溶液20ml置另一25ml量瓶中，作為空白溶液。各精密加新制的2%硫氰酸鉻銨溶液3ml，搖勻，加0.1mol/L鹽酸溶液稀釋至刻度，搖勻，置冰浴中放置1小時，用干燥濾紙濾過，取續(xù)濾液，以0.1mol/L鹽酸溶液為空白，在525nm的波長處分別測定吸收度，用空白溶液的吸收度分別減去對照品與供試品的吸收度，計算，即得。414）異羥肟酸鐵比色法含有酯鍵結(jié)構(gòu)的生物堿，在堿性介質(zhì)中加熱，酯鍵水解，產(chǎn)生的羧基與羥胺反應(yīng)生成異羥肟酸，再與Fe3＋生成紫紅色的配合物（異羥肟酸鐵），在一定濃度下符合Beer定律，可用比色法進行含量測定。42（二）生物堿類單體成分的含量測定1薄層色譜法2高效液相色譜法3氣相色譜法431薄層色譜法生物堿不具有紫外吸收或揮發(fā)性時可用本法測定。吸附劑、展開劑及顯色方法與鑒別相似，但要求比鑒別嚴(yán)格。注意：使用改良碘化鉍鉀等作為顯色劑時，必須完全揮干展開劑后（尤其在堿性環(huán)境下展開時）才可噴灑，否則背景深，反差小，影響測定。44例九分散中士的寧成分的含量測定—薄層掃描法處方馬錢子粉麻黃乳香（制）沒藥（制）取本品約2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加三氯甲烷20ml與濃氨試液1ml，輕輕搖勻，稱重，于室溫放置24小時，再稱重，補足三氯甲烷減失的重量，充分振搖，濾過。精密量取續(xù)濾液10ml，用硫酸溶液（3→100）分次提取，至生物堿提盡，合并硫酸液，置另一分液漏斗中，加濃氨試液使呈堿性，用三氯甲烷分次提取，合并液，蒸干，放冷，殘渣中精密加三氯甲烷5ml使溶解，作為供試品溶液。另取士的寧對照品，加三氯甲烷制成每1ml含0.4mg的溶液，作為對照品溶液。吸取上述兩種溶液各5μl，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以甲苯一丙酮一乙醇一濃氨試液（16∶12∶1∶4）的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干。照薄層色譜法進行掃描，波長：λs=254nm，λR=325nm，測量供試品吸收度積分值與對照品吸收度積分值，計算，即得。452高效液相色譜法以反相高效液相色譜法應(yīng)用較多。在反相高效液相色譜中，由于硅膠表面殘留硅羥基的影響，使生物堿分析易產(chǎn)生保留時間延長、峰形變寬、拖尾；可采取改進流動相、固定相等措施以克服游離硅羥基的影響，滿足定量分析的要求。中藥制劑中生物堿成分進行高效液相色譜法測定時，使用較多的是紫外檢測器。46例小孩清熱止咳口服液中鹽酸麻黃堿含量測定—高效液相色譜法處方麻黃、苦杏仁、石膏、甘草等色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；乙腈-0.1%磷酸溶液(含0.1%三乙胺)（3﹕97）為流動相；檢測波長為205nm。理論板數(shù)按鹽酸麻黃堿峰計算應(yīng)不低于4000。對照品溶液的制備取鹽酸麻黃堿對照品適量，精密稱定，加0.1mol/L鹽酸溶液制成每1ml含45μg的溶液，即得。47供試品溶液的制備精密量取本品5ml，加水10ml及濃氨水0.5ml用乙醚提取5次（30ml，30ml，20ml，20ml，20ml），合并乙醚液，加鹽酸乙醇溶液（1→20）2ml，混勻，低溫回收溶劑至干，殘渣加乙醇5ml使溶解，轉(zhuǎn)移至25ml量瓶中，加0.1mol/L鹽酸溶液至刻度，搖勻，即得。測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測定，即得。483氣相色譜法只適用于有揮發(fā)性、遇熱不分解的生物堿類。生物堿鹽在急速加熱過程中產(chǎn)生的酸對色譜柱和檢測器不利，應(yīng)該注意。制備供試品溶液時一般采用冷提取，凈化過程也要避免加熱，以防止成分流失，最后需用氯仿等低極性有機溶劑為溶劑制備成供試液。49第二節(jié)黃酮類成分分析概述一般性質(zhì)鑒別含量測定50一、概述黃酮類化合物是指基本母核為2-苯基色原酮類化合物?，F(xiàn)泛指兩苯環(huán)通過中央三碳鍵相互聯(lián)結(jié)而成的一系列化合物。在植物體內(nèi)大部分與糖結(jié)合成苷，一部分以游離形式存在。槲皮素異槲皮素表兒茶素金絲桃苷52二、一般性質(zhì)溶解度酸堿性紫外光譜特征53溶解度黃酮類化合物的溶解度因結(jié)構(gòu)及存在狀態(tài)（苷或苷元，單糖苷、雙糖或三糖苷）不同而有很大差異。游離苷元難溶或不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚等有機溶劑及稀堿液中。黃酮苷一般易溶于水、甲醇、乙醇等強極性溶劑中，但難溶或不溶與苯、氯仿等。54酸堿性酸性：黃酮類化合物因分子中多有羥基，故顯酸性，可溶于堿性水溶液、吡啶、甲酰胺及二甲基甲酰胺中。堿性：氧原子的性質(zhì)：黃酮類化合物分子中γ-吡喃酮環(huán)上的1－位氧原子，因有未共用的電子對，故表現(xiàn)出微弱的堿性，可與強無機酸，如濃硫酸