致病放射毛霉產(chǎn)孢條件的研究

致病放射毛霉產(chǎn)孢條件的研究

優(yōu)雅輻射的毛霉菌屬于第二細(xì)菌亞門（zygomaceus）和第二細(xì)菌綱（zygomeceus）毛霉科（mucorra）。雅致放射毛霉作為傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵工藝的一種主要生產(chǎn)菌株,在霉豆渣發(fā)酵和腐乳釀造中有應(yīng)用廣泛。雅致放射毛霉在固態(tài)培養(yǎng)基上的菌絲粗壯、致密,具有一定的黏性和韌性,可以在發(fā)酵產(chǎn)品表面形成一層皮膜,對(duì)霉豆渣和腐乳塊的形成和保持具有積極作用,而且能夠有效地防止其他雜菌污染。雅致放射毛霉在培養(yǎng)期間產(chǎn)生以蛋白酶為主的多種酶系,能快速分解大豆蛋白等原料。雅致放射毛霉在豆渣處理中發(fā)揮著重要作用。大豆在榨取用以生產(chǎn)豆?jié){和豆腐的水溶性成分之后剩下的大豆殘?jiān)环Q為豆渣(Okara),每千克大豆在壓榨豆?jié){之后大約會(huì)產(chǎn)生1.1kg新鮮豆渣,約有30%的大豆固形物,20%的大豆蛋白及11%的油類物質(zhì)會(huì)殘留在豆渣之中。在大豆食品加工生產(chǎn)中,每年都有大量的豆渣產(chǎn)生,日本豆腐加工中1年的豆渣產(chǎn)量在700000t以上,這些豆渣少部分用來(lái)作為飼料原料,大部分則被當(dāng)做廢物燒掉。對(duì)于如何處理這種大豆加工中的副產(chǎn)品,科研工作者做了大量研究,其中的一些研究直接把這些副產(chǎn)品開(kāi)發(fā)成可以使用的大豆食品。中國(guó)傳統(tǒng)的發(fā)酵制品霉豆渣(Meitauza)就是利用雅致放射毛霉固態(tài)發(fā)酵豆渣后生產(chǎn)出的豆制品,在80h、15℃的低溫發(fā)酵后,酸性蛋白酶和游離氨基酸大量產(chǎn)生,非蛋白氮含量增至8倍,霉豆渣的pH也由豆渣的5.48提高到7.50。霉豆渣還被用來(lái)作為固態(tài)發(fā)酵的典型。豆渣的固體發(fā)酵主要利用雅致放射毛霉(Actinomucorelegans),天培真菌(Temphfungus),少孢根霉(Rhizopusoligosporus),清酒真菌(Kojifungus)和米曲霉(Aspergillusoryzae)等真菌進(jìn)行。豆渣的發(fā)酵產(chǎn)品因?yàn)樯攀忱w維,游離氨基酸含量豐富且低能量而適宜作為健康食品。與營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞相比,孢子對(duì)毒性化合物、高溫、干燥和放射條件都具有抗性,使孢子在生物防控、生物催化、腫瘤檢測(cè)與治療、直投式菌種生產(chǎn)、生物感應(yīng)和益生元物質(zhì)研究上都有重要應(yīng)用。傳統(tǒng)的霉豆渣和腐乳的固體發(fā)酵工藝易受雜菌污染且發(fā)酵質(zhì)量品質(zhì)不穩(wěn)定,發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng),操作復(fù)雜,這些缺點(diǎn)可以利用直投式菌種(DVI-DirectvatInoculation)生產(chǎn)的方式彌補(bǔ)。國(guó)內(nèi)外研究較成熟的是酸奶的直投式菌種,而關(guān)于腐乳釀造和霉豆渣發(fā)酵的直投式菌種的研究還處于空白。我們之前報(bào)道了發(fā)酵霉豆渣的主要微生物為雅致放射毛霉和運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌,利用兩者混合發(fā)酵霉豆渣已經(jīng)獲得了質(zhì)量與天然發(fā)酵霉豆渣相比擬的產(chǎn)品。因此研究霉豆渣直投式發(fā)酵菌種變得可能。本文初步研究了雅致放射毛霉的孢子產(chǎn)生條件,為工業(yè)化生產(chǎn)直投式菌種提供基礎(chǔ)。1材料和方法1.1病毒雅致放射毛霉菌種由華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院211實(shí)驗(yàn)室提供。1.2制備動(dòng)物懸液利用接種針從斜面菌種中挑取1針菌體,劃線接種到裝有25mLPDA培養(yǎng)基三角瓶中。25℃下在恒溫培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)5d。向三角瓶中加入20mL無(wú)菌蒸餾水,用接種針將孢子刮到無(wú)菌水中,再在渦旋混勻器上劇烈振搖3min。利用無(wú)菌脫脂棉過(guò)濾三角瓶?jī)?nèi)液體獲取雅致放射毛霉孢子懸液。在顯微鏡下計(jì)數(shù)后確定孢子懸液的濃度。加入無(wú)菌蒸餾水調(diào)整孢子懸液濃度至1×106cfu/mL。1.3升溫培養(yǎng)取雅致放射毛霉孢子懸液50μL,涂布到含5mLPDA、Czapek、PSA、RB、FA、MEA斜面培養(yǎng)基(所有斜面所用試管及斜面角度相同)上于25℃在恒溫培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)。每次計(jì)數(shù)測(cè)定2個(gè)平行。測(cè)定記錄恒溫培養(yǎng)的第3、5、7、9、11、13、15天斜面培養(yǎng)基上孢子的產(chǎn)生量的變化情況。孢子量測(cè)定方法:向試管中加入5mL無(wú)菌水,用接種針刮下雅致放射毛霉孢子至水中,再在渦旋混勻器上劇烈振搖1min后,血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。1.4生長(zhǎng)培養(yǎng)液制備及成活率測(cè)定玉米粉、熟大豆粉、麩皮分別購(gòu)自于河南周口、上海、江蘇連云港,大米、小米、高粱、新鮮豆渣購(gòu)自廣州市。燕麥片為超市購(gòu)得的西麥燕麥片。稱取各天然培養(yǎng)基20.0g于250mL三角瓶中,根據(jù)表2向各三角瓶中加入蒸餾水,攪拌均勻后充分浸泡3~5h,121℃滅菌25min。無(wú)菌操作下在各天然培養(yǎng)基中接種雅致放射毛霉孢子懸液1.00mL,用無(wú)菌玻璃棒充分?jǐn)嚢枧囵B(yǎng)基以使菌液與培養(yǎng)基混合均勻。壓實(shí)壓平天然培養(yǎng)基以使天然培養(yǎng)基表面積相等(50cm2)。25℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6d(菌絲由白色變得灰色或黑色)后,向三角瓶中加入100mL無(wú)菌水,用接種針將孢子從天然培養(yǎng)基表面刮至無(wú)菌水中,再在渦旋混勻器上振搖3min,用移液槍吸取孢子懸浮液0.50mL于4.50mL無(wú)菌水中配制成10-1濃度的孢子懸液。40×40倍顯微鏡下用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),計(jì)算三角瓶?jī)?nèi)孢子懸液的濃度。成活率的計(jì)算:將200μL菌懸液涂布于MEA培養(yǎng)基上25℃下培養(yǎng)18~24h測(cè)定測(cè)定孢子成活率。成活率=MEA培養(yǎng)基上菌落總數(shù)/每毫升孢子總數(shù)。1.5無(wú)碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制備基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方為磷酸二氫鉀1.0g,氯化鉀0.5g,硫酸鎂·7H2O0.5g,硫酸亞鐵0.01g,瓊脂17.0g,蒸餾水1000mL,碳源30g,氮源2g。在無(wú)氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,以葡萄糖為碳源,添加不同種類氮源:硝酸鉀、蛋白胨、酵母膏、酵母粉、尿素、硫酸銨、硝酸銨、檸檬酸銨,以測(cè)定不同氮源對(duì)其產(chǎn)孢的影響;在無(wú)碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,以酵母粉為氮源,添加不同種類碳源:葡萄糖、蔗糖、淀粉、乳糖、麥芽糖、丙三醇、甘露醇,以測(cè)定不同碳源對(duì)雅致放射毛霉孢子產(chǎn)量的影響。將4.0mL配制好的上述培養(yǎng)基加入到直徑為1.5cm的硬質(zhì)玻璃試管中,121℃滅菌20min后直立待培養(yǎng)基凝固以使表面積相等,接種100μL的雅致放射毛霉孢子懸液于培養(yǎng)基中,25℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12d(菌絲由白色變得灰色或黑色)后,向三角瓶中加入5.00mL無(wú)菌水,收集孢子,相同方法計(jì)數(shù)。每個(gè)處理設(shè)置2個(gè)平行,取平均值進(jìn)行計(jì)算。1.6蔗糖碳源和氮源的配置蔗糖和大豆蛋白分別被用作氮源和碳源。配制100g/L蔗糖溶液200mL,10g/L大豆蛋白胨溶液100mL,不同碳源濃度和碳氮比培養(yǎng)基以在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入不同體積的蔗糖溶液和大豆蛋白胨溶液配置而成。蔗糖中的碳源按照8%進(jìn)行計(jì)算,大豆蛋白胨中氮源按照40%進(jìn)行計(jì)算。4個(gè)碳源濃度梯度設(shè)定為6、12、18、24g,每個(gè)碳源梯度濃度又設(shè)定10:1、20:1、40:1、80:1和160:14個(gè)碳氮比梯度。將4.0mL配制好的上述培養(yǎng)基加入試管中,121℃滅菌20min后直立待培養(yǎng)基凝固以使表面積相等,接種100μL的雅致放射毛霉孢子懸液于培養(yǎng)基中,25℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12d(菌絲變灰黑色)后,向三角瓶中加入5mL無(wú)菌水,收集孢子,相同方法計(jì)數(shù),每個(gè)處理設(shè)置2個(gè)平行,取平均值進(jìn)行計(jì)算。2結(jié)果與分析2.1種活性培養(yǎng)基的篩選Two-wayANOVA分析表明,在0.05水平上培養(yǎng)基種類和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)雅致放射毛霉產(chǎn)生孢子影響顯著。在培培養(yǎng)基PDA、CZAPEKS、EA、FA、PSA、RB上孢子產(chǎn)量15d內(nèi)測(cè)定的平均值分別為2.75×106、2.12×106、9.87×106、5.05×106、1.63×106、2.37×106cfu/mL。多重比較分析(LSD,DUNCAN)表明,MEA培養(yǎng)基上雅致放射毛霉孢子產(chǎn)量與其他5種培養(yǎng)基孢子產(chǎn)量在0.05和0.01水平上差異顯著。因此MEA培養(yǎng)基最為適合作為雅致放射毛霉產(chǎn)孢培養(yǎng)基。從圖1可以得知,雅致放射毛霉在MEA培養(yǎng)基上第9天時(shí)孢子產(chǎn)量達(dá)到最大為1.664×107cfu/mL,Czapek、PDA培養(yǎng)基上孢子最大產(chǎn)量分別為第5天的4.56×106cfu/mL與3.25×106cfu/mL。從圖2可知,雅致放射毛霉在FA,PSA,RB培養(yǎng)基上孢子最高產(chǎn)量分別為第11天的6.54×106,第9天的2.67×106cfu/mL,第11天的4.02×106cfu/mL。綜合以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知不同培養(yǎng)基上雅致放射毛霉達(dá)到最高產(chǎn)量的時(shí)間并不相同。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),雅致放射毛霉的孢子產(chǎn)量會(huì)下降。這是由于雅致放射毛霉產(chǎn)生的孢子在充足的營(yíng)養(yǎng)供給及適合的溫度下會(huì)在培養(yǎng)基表面萌發(fā)成菌絲,而實(shí)驗(yàn)證明新萌發(fā)的菌絲不會(huì)再次產(chǎn)生孢子。顯微鏡下檢測(cè),孢子的自分解也可能導(dǎo)致了雅致放射毛霉隨時(shí)間的延長(zhǎng)孢子產(chǎn)量減少。2.2混合培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)從圖3可知,雅致放射毛霉在大豆、麥麩和燕麥培養(yǎng)基孢子產(chǎn)量較高,可以分別達(dá)到2.4×107、2.04×107、2.24×107cfu/cm2。而在玉米粉、小米、大米、高粱、新鮮豆渣上孢子產(chǎn)量較低。孢子成活率顯示在麥麩培養(yǎng)基上的成活率較高為51.67%,而在燕麥和大豆培養(yǎng)基上成活率分別為31.4%和1.7%。大豆和燕麥上充足的養(yǎng)分決定了其在麥芽汁瓊脂較差的營(yíng)養(yǎng)條件下萌發(fā)率很低。綜合分析以上數(shù)據(jù)可知,麥麩最適合用來(lái)雅致放射毛霉的孢子生產(chǎn),6d內(nèi)孢子即可成熟采集。2.3不同碳源和氮源對(duì)優(yōu)雅輻射毛霉產(chǎn)素的影響2.4碳源、氮比與碳源對(duì)2種外生物酶產(chǎn)孢的影響碳氮比對(duì)雅致放射毛霉產(chǎn)孢影響結(jié)果見(jiàn)表5。Two-wayANOVA分析結(jié)果見(jiàn)表6。Two-wayANOVA結(jié)果顯示在0.05水平上,碳源對(duì)雅致放射毛霉產(chǎn)孢影響不顯著,碳氮比對(duì)其產(chǎn)孢影響顯著;碳源與碳氮比對(duì)雅致放射毛霉產(chǎn)孢的交互作用影響顯著。較低碳氮比利于雅致放射毛霉產(chǎn)孢。在碳源為1.92g/L,碳氮比為10:1條件下雅致放射毛霉孢子產(chǎn)量最高。3致放射性毛霉的產(chǎn)孢條件優(yōu)化雅致放射毛霉在發(fā)酵工業(yè)上的廣泛應(yīng)用使得如何提高雅致放射毛霉孢子產(chǎn)量,開(kāi)發(fā)直投式菌種變得非常重要。本文對(duì)6種合成培養(yǎng)基和8種天然培養(yǎng)基對(duì)雅致放射毛霉產(chǎn)孢進(jìn)行了初步研究,結(jié)果表明麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基和小麥麩皮更適合作為該霉菌的產(chǎn)孢培養(yǎng)基。國(guó)內(nèi)外科研工作者關(guān)于真菌產(chǎn)孢條件做了廣泛研究,其中關(guān)于真菌生物農(nóng)藥孢子研究最為深入。近20年關(guān)于毛霉產(chǎn)孢條件的研究未見(jiàn)報(bào)道。雅致放射毛霉具有毛霉的生長(zhǎng)和代謝特性:菌絲生長(zhǎng)快而長(zhǎng)易使基質(zhì)連接緊實(shí),又能產(chǎn)生大量酶類分解底物。因此雅致放射毛霉不能像盾殼霉,黑曲霉,紅曲霉那樣可以在較為松散的固體顆粒表面生長(zhǎng)而充分利用底物。雅致放射毛霉只能利用表面固體發(fā)酵和靜態(tài)液體發(fā)酵產(chǎn)孢。為獲得更經(jīng)濟(jì)有效的產(chǎn)孢方法,課題下一步將利用數(shù)學(xué)模型進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件。本文也初步研究了碳源,氮源以及碳氮比對(duì)雅致放射毛霉的產(chǎn)孢的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)麥芽糖,淀粉和葡萄糖為碳源和以硝酸鉀、硫酸銨為氮源更適合促進(jìn)雅致放射毛霉產(chǎn)孢。無(wú)機(jī)氮源和有機(jī)氮源都可以被雅致放射毛霉利用,而無(wú)機(jī)氮源對(duì)其產(chǎn)孢的促進(jìn)作用更大。碳氮比對(duì)雅致放射