低值魚蛋白制備多肽-鈣螯合物的研究

低值魚蛋白制備多肽-鈣螯合物的研究

近年來，人們普遍重視鈣營養(yǎng)不足的問題。老年人和兒童都應該考慮鈣營養(yǎng)，而鈣是世界上的一個問題。我國的膳食組成以植物性食物為主,植酸鹽、纖維素、糖醛酸、藻酸鈉和草酸等含量較高,食物中鈣的吸收率很低。因此,除了尋求良好的鈣補充制劑外,提高現(xiàn)有膳食中鈣的吸收利用率亦是解決缺鈣問題的方法之一。而蛋白質經(jīng)水解后得到的小肽,則能增加小腸對鈣的吸收及其在體內的蓄積。這種由磷酸肽誘導的鈣代謝并不需要VD。雖然我們在酶解蛋白和離子結合方面有了較大發(fā)展,但就水解度(DH)與離子結合的關系方面的研究在世界范圍內幾乎為空白,且多數(shù)研究還僅局限于陸地的一些動物蛋白。本實驗提出以南海低值魚為原料采用木瓜蛋白酶和風味酶混合的復合酶控制水解方法制備DH小于20的水解物研究其對鈣離子結合活性,并對其產物結構及活性進行分析。1材料和方法1.1材料和機器1.1.1u/g,固體粉末南海新鮮小雜魚市售;木瓜蛋白酶(200萬U/g,固體粉末)、風味酶(40萬U/g,固體粉末)廣西南寧龐博生物工程有限公司;亞油酸(linoleicacid)標準品、2-硫代巴比妥酸(2-thiobarbituricacidTBA)標準品、生育酚(α-tocopherol)標準品Sigma公司。1.1.2光學熱價測試雷磁牌PHS-25型pH計、雷磁牌JB-1A型磁力攪拌器上海精科雷磁儀器廠;飛利浦攪拌器HR2838廣東中山五金器具制造廠;光學讀數(shù)分析天平(TG-328A)上海偉業(yè)儀器廠;離心機(TD5型臺式多管架低速離心機)長沙英泰儀器有限公司;722S可見分光光度計上海精密科學儀器有限公司;電熱恒溫水浴鍋(H.H.S)江蘇南通縣通海電器廠;FTS-17SC型經(jīng)傅立葉變換紅外光譜儀美國Bio-Red公司。1.1.3試劑無水氯化鈣(CaCl2)、濃硫酸(H2SO4)、高錳酸鉀(KMnO4)和鹽酸均為分析純。1.2方法和步驟1.2.1合成工藝1.2.2分析1.2.2.1游離氨基酸含量的測定按照GB/T5009.39-96甲醛法標準執(zhí)行。1.2.2.2.游離態(tài)鈣含量的測定按照GB6226-86EDTA絡合滴定法標準執(zhí)行。1.2.2.3.分辨率dh的測量式中,A為原料中總氨基氮數(shù);B為水解液中的氨基氮數(shù);C為原料游離的氨基氮數(shù)。1.2.2.4-4硫合率的測定螯合率測定公式:1.2.2.紅外分光光度法酶解液經(jīng)冷凍干燥后,得到肽粉。而螯合物產品經(jīng)酒精分級沉淀可得到4種螯合產物,將它們提純后,除去樣品中的游離水或結晶水,取固體樣品2mg放入瑪瑙研缽中,放入干燥的光譜純KBr200mg,混合研磨均勻(在紅外燈下進行),使其粒度在2.5μm以下,裝入壓片模具,抽氣加壓,壓力約為60MPa,維持3~5min,卸掉壓力則可得一透明的KBr樣品片,利用島津IR-435紅外分光光度計進行定性分析,得到光譜。1.2.2.tba-sds法硫代巴比妥酸法。具體方法:將0.2ml亞油酸的樣品加入30ml試管中,然后加入10ml99.5%乙醇和10ml50mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.0)。每一種樣品(50mg)加入到此混合溶液中,然后用蒸餾水定容至25ml。將其放入到培養(yǎng)箱中在40℃培養(yǎng)7d。TBA溶液根據(jù)Ohkawa等的方法配制。該溶液含有0.8ml水分、0.2ml8.1%SDS和1.5ml20%的醋酸,然后用10mol/L的NaOH和1.5ml0.8%TBA調pH至3.5。將50μl的氧化性的亞油酸溶液加入到混合液中,并在5℃培養(yǎng)1h,然后在100℃加熱1h。紅色素的濃度在波長535nm下測定其吸光度。結果被表示為對亞油酸的氧化抑制率,同α-生育酚的抗氧化性作對照比較。抑制率的計算公式:式中,A為加50μl去離子水、0.2ml亞油酸的吸光度;B為加50mg樣品、0.2ml亞油酸的吸光度;C為加50μlα-生育酚、0.2ml亞油酸的吸光度。1.2.2.活性肽螯合物活性檢測平板制備牛津杯雙層平板法。牛津杯雙層平板法檢測平板的制備:在無菌平皿中倒入10ml加熱融化的2%瓊脂,待其充分冷卻凝固后,放入已滅菌的牛津杯數(shù)個,并按一定次序排放整齊。將分裝于大試管中的15ml固體檢測培養(yǎng)基融化后冷卻至50℃左右,加入108個/ml指示菌液1ml,迅速混合均勻,倒入平皿。冷卻后,用無菌鑷子取出牛津杯,作為活性肽螯合物活性檢測平板。用0.1ml吸管吸取100~200μl待測樣品,以無菌操作加入到檢測平板圓孔內,37℃培養(yǎng)15h,觀察并測定抑菌圈直徑(mm)。2結果與分析2.1脂肪對水解度的影響脂肪對復合酶水解蛋白的水解速率存在著一定影響,分別對脫脂(脂肪含量0.62%)和不脫脂(脂肪含量4.28%)兩種情況討論脂肪對水解度的影響。此反應條件為木瓜蛋白酶和風味酶添加量為0.1%,溫度25℃,pH為6.5,結果如圖1、2。從圖1、2可以看出未脫去脂肪的魚肉蛋白在復合酶的條件下,水解度隨時間的變化增加較快,因此不脫去脂肪更有利于得到DH小于20的活性肽產物。2.2游泳條件優(yōu)化2.2.1反應溫度對產品得率的影響選取pH為7,時間為15min不變,分別在10、20、30、40℃下進行螯合反應的比較實驗,產品得率基本相同,非脫脂魚肉蛋白酶解螯合率為81%左右,脫脂魚肉蛋白酶解螯合率為79%左右,說明反應溫度對絡合反應影響不大,故以室溫為宜,與文獻報道一致。2.2.2非脂魚蛋白酶解螯合率選取pH為7,溫度為室溫,分別在15、30、60min進行對比實驗,產品得率基本相同,非脫脂魚肉蛋白酶解螯合率為81%左右,脫脂魚肉蛋白酶解螯合率為79%左右,說明螯合反應為快速反應,反應時間影響不大,與文獻報道一致,故以反應15min為宜。2.2.3水解度對多肽利用率的影響不同水解度的活性肽產物,其平均肽鏈長度和配體摩爾數(shù)對存在著較大差異,平均肽鏈長度關系到鈣離子能否順利通過小腸粘膜,而配體摩爾比是影響金屬離子與多肽螯合反應的一個重要因素,如果配位比太小,生成的螯合物不穩(wěn)定;反之,若配位比太高,便會造成多肽利用率下降。選取DH為5%、10%、15%和20%,溫度為室溫,時間為15min,pH為7研究水解度對螯合率的影響程度,實驗結果見圖3。圖3表明,在同等條件下DH為5%時,鈣離子螯合率最高,而當DH為10%、15%、20%時脫脂的多肽螯合率要比未脫脂的螯合率高。2.2.4ph對螯合反應的影響pH條件是影響多肽螯合微量元素形成螯合物的重要因素。在pH較低的酸性條件下,H+將與金屬離子競爭供電子基團,不利于多肽微量元素螯合物的生成;在pH較高的堿性條件下,羥基與供電子基團爭奪金屬離子而形成氫氧化物沉淀。選取pH4~8范圍,在溫度為室溫,時間為15min,研究其對螯合反應的影響程度,結果見圖4、5。由圖4、5可以看出,在一定pH范圍內,隨pH值升高螯合率提高,這是由于隨著pH值升高,-NH2和-COOH配位能力增強。當pH>7時螯合率降低,說明溶液中開始有沉淀生成,不利于得到多肽鈣螯合物,故螯合物的pH值應選擇7左右。2.3ca2+與-nh2的含量關系圖7中①②③分別代表魚肉酶解蛋白與鈣離子螯合的產物,其中①樣品為螯合反應后不溶于水的物質;②樣品為螯合反應后加50%無水乙醇分級沉淀得到的物質;③樣品為螯合反應加80%無水乙醇分級沉淀得到的物質。從圖6和7中對比可以看出,活性肽與其螯合物吸收峰相比,在強弱和位置上有明顯的變化,樣品①②③在3130~3030cm-1銨峰消失,而在1100cm-1左右出現(xiàn)了(PtNH2)吸收峰,證明Ca2+與-NH2有結合;羧基離子反對稱振動(γascoo-)于1650cm-1附近,羧基離子的對稱振動(γscoo-)于1400cm-1附近,這兩處均有較強吸收峰,證明Ca2+與-COO-有較強結合。反對稱振動(γascoo-)是判斷-COOM鍵共價程度的量度,而反對稱振動與對稱振動的差值γ△υ(γascoo--γscoo-)是羧基離子與金屬離子配位方式的有力判據(jù)。樣品①③△υ均在250cm-1左右,樣品②△υ=236cm-1,推測鈣離子與羧基是以單齒共價鍵的方式結合。樣品①②③的鈣含量分別為16.58%、9.72%、7.68%可以看出螯合物隨著水溶和醇溶能力增加鈣含量減少,螯合能力減弱。2.4合成tba的原理采用TBA法,即硫代巴比妥酸法。亞油酸是一種多不飽和脂肪酸,是機體組織和細胞的組成成分,為人體最重要的必需脂肪酸。評價抗氧化劑的抗氧化能力大小有多種方法,其中硫代巴比妥酸(TBA)染料法為應用較廣的方法之一。TBA法是基于不飽和脂肪酸通過自由基反應,形成過氧化自由基,而氧化生成環(huán)氧化物,后者分解生成丙二醛,丙二醛與TBA作用生成TBA染料,最大吸收波長為535nm。多肽螯合鈣的抗氧化作用如圖8所示。上圖中①②③分別代表魚肉酶解蛋白與鈣離子螯合經(jīng)無水乙醇分級沉淀的產物,由圖看出鈣螯合物都具有一定的抗氧化作用,其中樣品1即螯合反應后未經(jīng)過無水乙醇分級沉淀得到的物質抗氧化作用最強,其抗氧化效果達到生育酚的94.43%。2.5草芽孢桿菌和細菌抗菌效果比較通過牛津杯雙層平板法,將活性肽及3種鈣螯合的樣品對大腸桿菌,枯草芽孢桿菌,金黃色葡萄球菌,沙門氏菌進行實驗,實驗發(fā)現(xiàn)樣品3即螯合反應加80%無水乙醇分級沉淀得到的物質對枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌有較好的抗菌效果,見圖9、10。牛津杯孔直徑為8mm,從圖9中可看出活性肽樣品并沒有抑菌圈出現(xiàn),從圖10中可看出樣品3有較好的抑菌效果,其抑菌圈直徑為16mm。而在對大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌實驗中發(fā)現(xiàn),活性肽及其螯合物抑菌作用均不明顯,活性肽樣品無抑菌圈出現(xiàn),螯合物抑菌圈直徑分別為9mm和11mm。目前對螯合物抗菌的作用機理尚無定論,部分研究表明,螯合物的肽分子可能和細菌細胞膜受體蛋白結合,改變細胞質膜通透性,造成膜結構破壞,引起膜內水溶性物質大量滲出,從而導致細菌死亡。3螯合物的抗氧化效果多肽螯合鈣離子最佳工藝條件為,DH5%,pH7,溫度為室溫,螯合15min,螯合率可達81.75%。螯合產品紅外光