基于issr標(biāo)記的羅漢果居群遺傳多樣性分析

基于issr標(biāo)記的羅漢果居群遺傳多樣性分析

漢諾威是一種雙殼類動物。這種水果是傳統(tǒng)的中藥，可以用來治療支氣管炎、急性喉嚨炎、哮喘和感冒。果實中還含有一種熱量低但甜度極高的物質(zhì),是理想的天然甜味劑(李典鵬和張厚瑞,2000),可作為肥胖癥和糖尿病患者理想的糖替代品。野生羅漢果主要分布于廣西和廣東,貴州、湖南和江西的南部也有分布(路安民和張志耘,1984;李建強(qiáng),1993)。羅漢果是重要的經(jīng)濟(jì)植物,廣西永福縣和臨桂縣是其栽培起源地(鐘仕強(qiáng),1992),近年來在廣西融安、融水、龍勝和靈川等縣的種植面積逐步擴(kuò)大,廣東北部和貴州南部也有少量種植。但羅漢果的生產(chǎn)近年來遇到了一些困難:一方面,人工栽培一般都是通過壓蔓方式繁殖種薯,由于長期的無性繁殖,羅漢果品種已經(jīng)嚴(yán)重退化,抗逆性越來越差;另一方面,現(xiàn)有栽培品種極易感染根線蟲等病害,原栽培地種植數(shù)年后就不能再利用,需砍伐森林開墾新地,造成森林面積逐年減少、水土流失嚴(yán)重、環(huán)境惡化(周昌遠(yuǎn)和蔣紀(jì)森,2003)。因此,利用遺傳資源培育抗病性強(qiáng)、適于平地生產(chǎn)的羅漢果新品種是當(dāng)務(wù)之急。遺傳多樣性研究能為植物育種和遺傳改良提供理論指導(dǎo)。ISSR(inter-simplesequencerepeats)是一種新型的分子標(biāo)記(Zietkiewiczetal.,1994),具有比RAPD更高的可重復(fù)性和穩(wěn)定性(Tsumuraetal.,1996;Fang&Roose,1997)。近年來,ISSR分子標(biāo)記已被廣泛應(yīng)用于植物的遺傳多樣性研究(錢韋等,2000;葛永奇等,2003;馬朝芝等,2003;Martinsetal.,2003;Pandaetal.,2003)。以往對羅漢果的研究集中在化學(xué)成分、甜味素提取、栽培技術(shù)和病蟲害防治等方面(斯建勇等,1996;李典鵬和張厚瑞,2000;蔡健和等,2001;余麗娟等,2003;杭玲等,2003),但缺乏在遺傳多樣性方面的研究報道。本研究運(yùn)用ISSR分子標(biāo)記對羅漢果的7個野生居群的遺傳多樣性進(jìn)行了分析,目的在于揭示其遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性水平,為保護(hù)和合理利用野生羅漢果遺傳資源提供科學(xué)依據(jù)。1材料和方法1.1研究對象的選取與取樣根據(jù)野生羅漢果的地理分布情況,選取其栽培起源地廣西永福和臨桂(YF);羅漢果資源豐富的金秀縣(JX);野生羅漢果的分布的近北界的興安縣(XA)和南界的浦北縣(PB);廣西、廣東交界處的賀州市(HZ)以及廣東乳源縣(RY)和肇慶縣(ZQ)共7個居群。隨機(jī)選取居群內(nèi)的個體作為樣本,其中肇慶居群只有10個個體,全部取樣,其他居群各取20個個體。居群內(nèi)個體間的取樣間隔在10m以上(如永福、興安、金秀和浦北居群),但對于個體數(shù)較少的居群(如乳源、肇慶和賀州居群),有的個體間的距離達(dá)不到10m。采集羅漢果的枝葉,插入清水中迅速帶回實驗室。將新鮮葉片洗凈后裝入封口塑料袋中于-70℃保存。各居群的產(chǎn)地及生境特點等見表1。1.2引約篩選及可重復(fù)性試驗-Sets/Primers.pdf)。每個居群選取2個模板,在25μL反應(yīng)體系中進(jìn)行引約篩選及可重復(fù)性試驗。從69個引物中選出15個擴(kuò)增條帶清晰、反應(yīng)穩(wěn)定的引物用于全部130份DNA樣品的擴(kuò)增(表2)。1.3pcr擴(kuò)增與質(zhì)譜分析ISSR擴(kuò)增反應(yīng)條件經(jīng)過比較和優(yōu)化確定為25μL的PCR反應(yīng)液:20-50ng模板DNA,1UTaq酶,1×PCRBuffer,2.0mmol/LMgCl2,dNTPs0.2mmol/L,0.5μmol/LISSR引物。PCR擴(kuò)增程序為:94℃預(yù)變性3min,接著進(jìn)行40個循環(huán):94℃變性1min,52℃退火50s,72℃延伸2min,循環(huán)結(jié)束后,72℃延伸7min。擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠中電泳,用LambdaDNA/EcoRⅠ+HindⅢMarker作為標(biāo)準(zhǔn)分子量對照,溴化乙錠染色,用上海復(fù)日FR-980型紫外與可見光分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像掃描與分析。所有的擴(kuò)增反應(yīng)都重復(fù)一次。1.4多樣性指數(shù)的計算ISSR是顯性標(biāo)記,同一引物擴(kuò)增產(chǎn)物中電泳遷移率一致的條帶被認(rèn)為具有同源性,按照相同遷移位置上有擴(kuò)增帶記為1、無帶為0的方法記錄電泳譜帶,僅記錄清晰、可重復(fù)的并且長度在250-2000bp范圍內(nèi)的擴(kuò)增帶。得到的ISSR數(shù)據(jù)矩陣用于下列分析:(1)將ISSR標(biāo)記視為表征性狀,采用POPGENE1.31軟件(Yehetal.,1999)計算多態(tài)位點百分率(PPL)和Shannon信息多樣性指數(shù)(I)(Lewontin,1972);(2)將ISSR標(biāo)記作為2個等位基因(1和0)的復(fù)等位基因位點,基于Hardy-Weinberg平衡,剔除基因頻率小于3/N(N為樣本數(shù),130)的條帶后(Lynch&Milligan,1994),計算Nei′s基因多樣性指數(shù)(He)(Nei,1973)、總居群基因多樣度(Ht)、各居群基因多樣度(Hs)和基因分化系數(shù)(Gst);(3)用ARLEQUIN2.000軟件(Schneideretal.,2000)進(jìn)行AMOVA分析,基于樣品間的歐氏平方距離(Stewart&Excoffier,1996)計算遺傳變異在居群間和居群內(nèi)的分布、居群間的遺傳分化、居群間的遺傳距離與地理距離之間的相關(guān)性和居群間的基因流(Nm);(4)用NTSYSpc2.10(Rohlf,1997)計算個體間的Nei相似性系數(shù)(Nei&Li,1979),并對個體進(jìn)行UPGMA聚類分析。2結(jié)果2.1物種多樣性分析通過15條ISSR引物對7個羅漢果野生居群共130個個體進(jìn)行ISSR分析(圖1),共檢測到111個位點(每個引物產(chǎn)生2-11個位點),其中91個位點是多態(tài)的,占82.0%。Nei′s基因多樣性指數(shù)(He)為0.248,Shannon信息多樣性指數(shù)(I)為0.354(表3)。羅漢果居群多態(tài)位點百分率(PPL)在28.2%-55.6%之間,最低的是乳源居群(RY),為28.2%,較高的有永福(YF)和金秀(JX)兩個居群(分別為52.8%和55.6%)。居群的Nei′s基因多樣性指數(shù)在0.080-0.209之間,Shannon信息多樣性指數(shù)在0.123-0.310之間,二者大小與居群多態(tài)位點百分率的大小趨勢基本一致。2.2居群間的遺傳多樣性AMOVA分析結(jié)果表明,兩兩居群間的遺傳分化程度(Фst)較高,在0.419-0.769之間(表4),平均為0.580。金秀與永福居群間及金秀與浦北居群間的遺傳分化程度最低(Фst=0.419,P<0.001);肇慶與乳源居群間最高(Фst=0.769,P<0.001)。對各羅漢果居群間的地理距離和遺傳距離進(jìn)行Mantal檢驗(Mantal,1967),結(jié)果表明地理距離和遺傳距離之間呈正相關(guān),但相關(guān)性不顯著(r=0.369,P=0.115)。居群間的基因流(Nm)較低,平均為0.394,最高的僅為0.693。POPGENE分析結(jié)果表明,遺傳變異主要存在于居群間,7個居群總的基因多樣性(Ht)為0.254,其中居群內(nèi)的基因多樣性(Hs)為0.109;居群間基因分化系數(shù)(Gst)為0.569,居群間的遺傳變異占總遺傳變異的56.9%。AMOVA分析結(jié)果表明,居群間的遺傳變異占57.4%(P<0.001),居群內(nèi)的遺傳變異占42.6%,此結(jié)果與用POPGENE軟件進(jìn)行分析的結(jié)果很接近。2.3不同聚類分析結(jié)果根據(jù)個體間的遺傳距離(Nei&Li,1979)進(jìn)行UPGMA聚類,分析結(jié)果(圖2)顯示,130個個體按居群各自聚在一起,這進(jìn)一步表明居群間產(chǎn)生了一定的遺傳分化。3居群間的遺傳多樣性地理分布范圍是決定植物種遺傳多樣性的主要因素之一,寬分布區(qū)的種趨向于具有更高的遺傳多樣性水平(Karron,1987;Hamrick&Godt,1990)。野生羅漢果的分布區(qū)較廣,加之羅漢果是單性、雌雄異株的植物,保證了其嚴(yán)格的異花授粉。在種的水平上,野生羅漢果與同科的一些植物如Schizopeponbryoniaefolius(Akimotoetal.,1999)和Cucurbitamaxima(Decker-Waltersetal.1990)或異交植物(Hamrick&Godt,1990)的遺傳多樣性水平相當(dāng)(PPL=82.0%;He=0.248;I=0.354)。7個羅漢果居群間的遺傳多樣性水平存在較大的差異。永福居群(YF)和金秀居群(JX)的遺傳多樣性最高,興安居群(XA)、浦北居群(PB)和賀州居群(HZ)的遺傳多樣性次之,而乳源居群(RY)和肇慶居群(ZQ)的遺傳多樣性最低。后兩個居群反映遺傳多樣性的3個指標(biāo)(PPL,He,I)的值僅有永福居群(YF)和金秀居群(JX)的1/2左右。根據(jù)我們的調(diào)查,永福居群(YF)和金秀居群(JX)的個體數(shù)量較多,興安居群(XA)、浦北居群(PB)和賀州居群(HZ)的個體數(shù)量較少,乳源居群(RY)和肇慶居群(ZQ)的個體數(shù)量最少。表明ISSR分子標(biāo)記檢測到的羅漢果居群遺傳多樣性水平與居群的大小相關(guān),較大的居群趨向于具有更高的遺傳多樣性水平。在永福和金秀兩地羅漢果的遺傳多樣性水平較高,并呈現(xiàn)出向周圍地區(qū)逐漸降低的趨勢。野生羅漢果在居群間的遺傳變異較大,居群間的遺傳變異占總遺傳變異的56.9%。已有的研究表明,植物居群的遺傳結(jié)構(gòu)反映了種的長期進(jìn)化史(分布區(qū)轉(zhuǎn)移、生境片斷化和居群特化)、突變、遺傳漂變、交配系統(tǒng)、基因流和選擇等不同過程的相互作用(Schaaletal.,1998;Slatkin,1987)。研究中發(fā)現(xiàn),羅漢果居群間遺傳變異的產(chǎn)生主要與居群間的基因交流受到限制有關(guān)。羅漢果對水、熱及蔭蔽條件的要求比較嚴(yán)格,一般沿山谷或溪邊分布,多見于常綠闊葉林下。由于其種子較大(約0.1g)并能浮于水面,種子傳播與水流的關(guān)系也比較密切。野生羅漢果居群的分布通常不連續(xù),而且斑塊之間的間隔距離較大(鐘仕強(qiáng),1992)。所研究的7個野生羅漢果居群之間的地理距離較遠(yuǎn)(80-420km),可能影響到了居群間的基因交流。李海生和陳桂珠(2004)研究發(fā)現(xiàn),有些植物如海桑(Sonneratiahainanensis)和裸蕓香(Psilopeganumsinense)居群間的遺傳距離與地理距離呈顯著的正相關(guān)關(guān)系。羅漢果居群間的遺傳距離和地理距離之間也呈正相關(guān)關(guān)系,但相關(guān)性不顯著,說明地理隔離影響其居群間的基因交流,由此造成居群間的基因流較低(Nm=0.394)。Wright(1951)指出,如果Nm<1,則遺傳漂變可以導(dǎo)致居群間明顯的遺傳分化。因此,基因