肉制品中的微生物檢測-肉制品中致病菌的檢測（沙門氏菌）

沙門氏菌分離及培養(yǎng)分離一培養(yǎng)二目錄頁分離培養(yǎng)基三菌落特征四分離培養(yǎng)中的注意要點五一.分離（分離）

分別用直徑3mm的接種環(huán)取增菌液1環(huán),劃線接種于一個BS瓊脂平板和一個XLD瓊脂平板(或HE瓊脂平板或沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基平板),于36℃±1℃分別培養(yǎng)40h~48h(BS瓊脂平板)或18h~24h(XLD瓊脂平板、HE瓊脂平板、沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基平板),觀察各個平板上生長的菌落,各個平板上的菌落特征見表。二.培養(yǎng)（培養(yǎng)）)

輕輕搖動培養(yǎng)過的樣品混合物,移取1mL,轉種于10mLTTB內(nèi),于42℃±1℃培養(yǎng)18h~24h。同時,另取1mL,轉種于10mLSC內(nèi),于36℃±1℃培養(yǎng)18h~24h。二.培養(yǎng)（培養(yǎng)）)

輕輕搖動培養(yǎng)過的樣品混合物,移取1mL,轉種于10mLTTB內(nèi),于42℃±1℃培養(yǎng)18h~24h。同時,另取1mL,轉種于10mLSC內(nèi),于36℃±1℃培養(yǎng)18h~24h。二.培養(yǎng)（培養(yǎng)）)

輕輕搖動培養(yǎng)過的樣品混合物,移取1mL,轉種于10mLTTB內(nèi),于42℃±1℃培養(yǎng)18h~24h。同時,另取1mL,轉種于10mLSC內(nèi),于36℃±1℃培養(yǎng)18h~24h。三：分離培養(yǎng)基1.亞硫酸鉍(BS)瓊脂2.HE瓊脂ektoenEntericAgar)3.木糖賴氨酸脫氧膽鹽(XLD)瓊脂1.亞硫酸鉍(BS)瓊脂（亞硫酸(鉍BS)瓊脂）成分蛋白胨10.0g牛肉膏5.0g葡萄糖5.0g硫酸亞鐵0.3g磷酸氫二鈉4.0g煌綠0.025g或5.0g/L水溶液5.0mL檸檬酸鉍銨2.0g亞硫酸鈉6.0g瓊脂18.0g~20.0g蒸餾水1000mL制法將前三種成分加入300mL蒸餾水(制作基礎液),硫酸亞鐵和磷酸氫二鈉分別加入20mL和30mL蒸餾水中,檸檬酸鉍銨和亞硫酸鈉分別加入另一20mL和30mL蒸餾水中,瓊脂加入600mL蒸餾水中。然后分別攪拌均勻,煮沸溶解。冷至80℃左右時,先將硫酸亞鐵和磷酸氫二鈉混勻,倒入基礎液中,混勻。將檸檬酸鉍銨和亞硫酸鈉混勻,倒入基礎液中,再混勻。調(diào)節(jié)pH至7.5±0.2,隨即傾入瓊脂液中,混合均勻,冷至50℃~55℃。加入煌綠溶液,充分混勻后立即傾注平皿。

注:本培養(yǎng)基不需要高壓滅菌,在制備過程中不宜過分加熱,避免降低其選擇性,貯于室溫暗處,超過48h會降低其選擇性,本培養(yǎng)基宜于當天制備,第二天使用。2.HE瓊脂(HektoenEntericAgar)（HE瓊脂）成分蛋白胨12.0g牛肉膏3.0g乳糖12.0g蔗糖12.0g水楊素2.0g膽鹽20.0g氯化鈉5.0g瓊脂18.0g~20.0g蒸餾水1000mL0.4%溴麝香草酚藍溶液16.0mLAndrade指示劑20.0mL甲液20.0mL乙液20.0mL制法將前面七種成分溶解于400mL蒸餾水內(nèi)作為基礎液;將瓊脂加入于600mL蒸餾水內(nèi)。然后分別攪拌均勻,煮沸溶解。加入甲液和乙液于基礎液內(nèi),調(diào)節(jié)pH至7.5±0.2。再加入指示劑,并與瓊脂液合并,待冷至50℃~55℃傾注平皿。注:①本培養(yǎng)基不需要高壓滅菌,在制備過程中不宜過分加熱,避免降低其選擇性。②甲液的配制：硫代硫酸鈉34.0g檸檬酸鐵銨4.0g蒸餾水100mL③乙液的配制：去氧膽酸鈉10.0g蒸餾水100mL④Andrade指示劑：酸性復紅0.5g1mol/L氫氧化鈉溶液16.0mL蒸餾水100mL將復紅溶解于蒸餾水中,加入氫氧化鈉溶液。數(shù)小時后如復紅褪色不全,再加氫氧化鈉溶液1mL~2mL。3.木糖賴氨酸脫氧膽鹽(XLD)瓊脂（木糖賴氨酸脫氧膽鹽(XLD)瓊脂）成分酵母膏3.0gL-賴氨酸5.0g木糖3.75g乳糖7.5g蔗糖7.5g去氧膽酸鈉2.5g檸檬酸鐵銨0.8g硫代硫酸鈉6.8g氯化鈉5.0g瓊脂15.0g酚紅0.08g蒸餾水1000mL制法除酚紅和瓊脂外,將其他成分加入400mL蒸餾水中,煮沸溶解,調(diào)節(jié)pH至7.4±0.2。另將瓊脂加入600mL蒸餾水中,煮沸溶解。將上述兩溶液混合均勻后,再加入指示劑,待冷至50℃~55℃傾注平皿。注:本培養(yǎng)基不需要高壓滅菌,在制備過程中不宜過分加熱,避免降低其選擇性,貯于室溫暗處。本培養(yǎng)基宜于當天制備,第二天使用。四、菌落特征表1沙門氏菌屬在不同選擇性瓊脂平板上的菌落特征

選擇性瓊脂平板沙門氏菌BS瓊脂（36℃±1℃40h～48h）菌落為黑色有金屬光澤、棕褐色或灰色，菌落周圍培養(yǎng)基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰綠色的菌落，周圍培養(yǎng)基不變。HE瓊脂（36℃±1℃18h～24h）藍綠色或藍色，多數(shù)菌落中心黑色或幾乎全黑色；有些菌株為黃色，中心黑色或幾乎全黑色。XLD瓊脂（36℃±1℃18h～24h）菌落呈粉紅色，帶或不帶黑色中心，有些菌株可呈現(xiàn)大的帶光澤的黑色中心，或呈現(xiàn)全部黑色的菌落；有些菌株為黃色菌落，帶或不帶黑色中心。

l沙門氏菌菌落形態(tài)：黑色有金屬光澤、棕褐色或灰色，菌落周圍培養(yǎng)基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰綠色的菌落，周圍培養(yǎng)基不變。lHE瓊脂：在保證細菌所需營養(yǎng)的基礎上，加入了一些抑制劑，如：膽鹽、檸檬酸鹽、去氧膽酸鈉等，可抑制某些腸道致病菌和革蘭氏陽性菌的生長，但對革蘭氏染色陰性的腸道致病菌則無抑制作用。l沙門氏菌在HE瓊脂上的菌落形態(tài)：藍綠 色或藍色，多數(shù)菌落中心黑色或幾乎全黑 色；有些菌株為黃色，中心黑色或幾乎全 黑色。lXLD瓊脂：粉紅色，帶或不帶黑色中心，有 些菌株可呈現(xiàn)大的帶光澤的黑色中心，或呈現(xiàn) 全部黑色的菌落；有些菌株為黃色菌落，帶或 不帶黑色中心。lXLD培養(yǎng)基分離沙門氏菌和志賀氏菌的敏感 性超過了傳統(tǒng)培養(yǎng)基，如：EMB、SS。因這 些培養(yǎng)基尚有抑制志賀氏菌屬生長的潛在因 素，故本培養(yǎng) 基是分離鑒定 沙門氏菌及志 賀氏菌屬的可 靠培養(yǎng)基。在國外廣泛使用。五.分離培養(yǎng)中的注意要點（分離培養(yǎng)中的注意要點）

非典型的沙門氏菌菌落形態(tài)：不存在典型或可疑沙門氏菌菌落時，按如下步驟檢驗非典型的沙門氏菌菌落。

HE和XLD瓊脂：非典型的沙門氏菌在HE和XLD瓊脂上呈黃色菌落，帶或不帶黑色中心。HE和XLD平板經(jīng)24±2h培養(yǎng)后，有典型的沙門氏菌菌落，則挑取2個或更多個非典型的沙門氏菌菌落。顯色瓊脂另外。五.分離培養(yǎng)中的注意要點（分離培養(yǎng)中的注意要點）

BS瓊脂：某些非典型菌株產(chǎn)生綠色菌落， 其周圍培養(yǎng)基稍微或不呈暗色。如果BS平板培養(yǎng)24±2h后，沒有出現(xiàn)典型菌落，則不挑取任何菌落，讓平板繼續(xù)培養(yǎng)24±2h。 如果經(jīng)48±2h培養(yǎng)后，仍沒有典型或可疑 的菌落出現(xiàn)，則挑取2個或更多個非典型的菌落。沙門氏菌檢測結果與報告記錄一報告二檢驗后樣品處理三目錄頁原始記錄單四檢測報告單五報告說明六（記錄與報告）記錄檢驗過程中應即時、客觀地記錄觀察到的現(xiàn)象、結果和數(shù)據(jù)等信息。報告實驗室應按照檢驗方法中規(guī)定的要求，準確、客觀地報告檢驗結果。（結果與報告）檢驗后樣品的處理1.檢驗結果報告后，被檢樣品方能處理。2.檢出致病菌的樣品要經(jīng)過無害化處理。3.檢驗結果報告后，剩余樣品和同批產(chǎn)品不進行微生物項目的復檢。樣品編號

樣品名稱

檢驗依據(jù)GB4789.4-2010檢驗環(huán)境溫度℃濕度%RH檢驗日期

儀器設備名稱、規(guī)格、精度、編號電子天平:YP-10020.01g105有計量合格標識，并在檢定有效期內(nèi).恒溫培養(yǎng)箱:DH60000.1℃88有計量合格標識，并在檢定有效期內(nèi).樣品復蘇_月__日_____無菌操作，將待檢樣品磁珠置于10mL無菌營養(yǎng)肉湯中37℃溫育24h復蘇。前增菌__月__日_____按無菌操作取待檢肉湯1mL，加入到10mLBPW增菌液中，充分混勻，于36±1℃培養(yǎng)4h。增菌__月__日_____取1mLBPW增菌液，轉種于10mLSC增菌液中，于36±1℃培養(yǎng)18~24h。檢驗項目現(xiàn)象結果分離培養(yǎng)BS瓊脂平板要求36±1℃，40h-48h

培養(yǎng)___日

時至__日____時。

HE瓊脂平板要求36±1℃，18h-24h

培養(yǎng)___日___時至__日____時。

____顯色平板要求36±1℃，18h-24h

培養(yǎng)___日___時至__日____時。

生化試驗三糖鐵瓊脂要求36±1℃，18h-24h

培養(yǎng)___日___時至__日____時。

普通瓊脂平板要求36±1℃，18h-24h

培養(yǎng)___日___時至__日____時。

賴氨酸脫羧酶試驗

API20E生化試劑盒要求36±1℃，18h-24h編碼結果培養(yǎng)___日___時至__日____時。

血清學鑒定實驗結果樣品中沙門氏菌備注

檢驗者：審核者：年月日

（原始記錄單）（檢測報告單）檢測報告防（食）檢字（2017）第號共2頁，第1頁檢品名稱檢測類別送檢單位樣品編號生產(chǎn)廠家檢測目的衛(wèi)生質量生產(chǎn)日期檢品數(shù)量5點包裝情況管裝采樣日期采樣地點東盛伊思德食品檢品狀態(tài)液體送檢日期檢測項目沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌共3項檢測結果：檢品名稱沙門氏菌結論及評價：不評價本欄以下空白。報告編制：簽發(fā)：蓋章校對：二〇一七年三月十二日報告書包括正文和附頁，并蓋有計量認證章、檢測章和騎縫章。檢測報告書附頁（食）防檢字（2008）第號共2頁，第2頁檢測及評價依據(jù)：GB/T4789.1-2016食品衛(wèi)生微生物學檢驗沙門氏菌檢驗評價指標：項目名稱化學描述及單位評價指標沙門氏菌不得檢出檢測環(huán)境條件：溫度：20℃相對濕度：40%氣壓：101.30kPa主要檢測儀器設備：結果與報告綜合以上生化試驗和血清學鑒定的結果,報告25g(mL)樣品中檢出或未檢出沙門氏菌。（檢測報告單）（報告書說明）一、對檢測結果如有異議，請于收到報告之日起15日內(nèi)向本站提出。二、委托檢測，系委托者自帶檢品送檢，本站不對檢品來源負責。檢測結果，僅對送檢檢品負責，不得做鑒定、評優(yōu)、審批及商品宣傳用。三、監(jiān)督檢測，系按有關法規(guī)進行的監(jiān)督性檢測。四、鑒定檢測，系對新產(chǎn)品、新工藝、新資源的衛(wèi)生質量檢測。五、未經(jīng)實驗室書面批準，不得復制檢驗證書或報告。六、本報告書改動無效。沙門氏菌檢測前的準備設備和材料二培養(yǎng)基和試劑三熟悉檢驗程序四樣品采集五目錄頁GB4789.4—2016說明一本標準代替GB4789.4—2010《食品安全國家標準食品微生物學檢驗沙門氏菌檢驗》、SN0170—1992《出口食品沙門氏菌屬(包括亞利桑那菌)檢驗方法》、SN/T2552.5—2010《乳及乳制品衛(wèi)生微生物學檢驗方法第5部分:沙門氏菌檢驗》。整合后的標準與GB4789.4—2010相比,主要變化如下:———修改了檢測流程和血清學檢測操作程序;———修改了附錄A和附錄B。本標準規(guī)定了食品中沙門氏菌(Salmonella)的檢驗方法。本標準適用于食品中沙門氏菌的檢驗1.GB4789.4—2016說明（GB4789.4—2016說明）（設備和材料）2.設備和材料2.1冰箱:2℃~5℃。2.2恒溫培養(yǎng)箱:36℃±1℃,42℃±1℃。2.3均質器。2.4振蕩器。2.5電子天平:感量0.1g。2.6無菌錐形瓶:容量500mL,250mL。2.7無菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸頭。2.8無菌培養(yǎng)皿:直徑60mm,90mm。2.9無菌試管:3mm×50mm、10mm×75mm。2.10pH計或pH比色管或精密pH試紙。2.11全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)。2.12無菌毛細管。（培養(yǎng)基試劑）3.培養(yǎng)基和試劑3.1緩沖蛋白胨水(BPW)。3.2四硫磺酸鈉煌綠(TTB)增菌液。3.3亞硒酸鹽胱氨酸(SC)增菌液。3.4亞硫酸鉍(BS)瓊脂。3.5HE瓊脂。3.6木糖賴氨酸脫氧膽鹽(XLD)瓊脂。3.7沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基。3.8三糖鐵(TSI)瓊脂。3.9蛋白胨水、靛基質試劑。3.10尿素瓊脂(pH7.2)。3.11氰化鉀(KCN)培養(yǎng)基。3.12賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基。3.13糖發(fā)酵管。3.14鄰硝基酚β-D半乳糖苷(ONPG)培養(yǎng)基。3.15半固體瓊脂。3.16丙二酸鈉培養(yǎng)基。3.17沙門氏菌O、H和Vi診斷血清。3.18生化鑒定試劑盒。4.熟悉檢驗程序（熟悉檢驗程序）5.樣品采集三5.1采樣原則5.2采樣方案5.3采樣方法5.4采集樣品的標記5.5采集樣品的貯存和運輸5.1樣品采集原則（樣品采集原則）5.1.1樣品的采集應遵循隨機性、代表性的原則。5.1.2采樣過程遵循無菌操作程序,防止一切可能的外來污染。5.2樣品采集方案（樣品采集方案）5.2.1根據(jù)檢驗目的、食品特點、批量、檢驗方法、微生物的危害程度等確定采樣方案。5.2.2采樣方案分為二級和三級采樣方案。二級采樣方案設有n、c和m值,三級采樣方案設有n、c、m和M值。n:同一批次產(chǎn)品應采集的樣品件數(shù);c:最大可允許超出m值的樣品數(shù);m:微生物指標可接受水平限量值(三級采樣方案)或最高安全限量值(二級采樣方案);M:微生物指標的最高安全限量值。5.2.3各類食品的采樣方案按食品安全相關標準的規(guī)定執(zhí)行。5.2.4食品安全事故中食品樣品的采集:a)由批量生產(chǎn)加工的食品污染導致的食品安全事故,食品樣品的采集和判定原則按3.2.2和3.2.3執(zhí)行。重點采集同批次食品樣品。b)由餐飲單位或家庭烹調(diào)加工的食品導致的食品安全事故,重點采集現(xiàn)場剩余食品樣品,以滿足食品安全事故病因判定和病原確證的要求。5.3采樣方法（采樣方法）5.3.1預包裝食品5.3.1.1應采集相同批次、獨立包裝、適量件數(shù)的食品樣品,每件樣品的采樣量應滿足微生物指標檢驗的要求。5.3.1.2獨立包裝小于、等于1000g的固態(tài)食品或小于、等于1000mL的液態(tài)食品,取相同批次的包裝。5.3.1.3獨立包裝大于1000mL的液態(tài)食品,應在采樣前搖動或用無菌棒攪拌液體,使其達到均質后采集適量樣品,放入同一個無菌采樣容器內(nèi)作為一件食品樣品;大于1000g的固態(tài)食品,應用無菌采樣器從同一包裝的不同部位分別采取適量樣品,放入同一個無菌采樣容器內(nèi)作為一件食品樣品。5.3.2散裝食品或現(xiàn)場制作食品用無菌采樣工具從n個不同部位現(xiàn)場采集樣品,放入n個無菌采樣容器內(nèi)作為n件食品樣品。每件樣品的采樣量應滿足微生物指標檢驗單位的要求。5.4采集樣品的標記（采集樣品的標記）采樣標記樣品名稱采樣地點采樣時間采樣數(shù)量樣品編號采樣方法、采樣人5.5采集樣品的貯存和運輸采集樣品的貯存和運輸）5.5.1應盡快將樣品送往實驗室檢驗。5.5.2應在運輸過程中保持樣品完整。5.5.3應在接近原有貯存溫度條件下貯存樣品,或采取必要措施防止樣品中微生物數(shù)量的變化。沙門氏菌檢測生化試驗三糖鐵瓊脂試驗一賴氨酸脫羧酶試驗二靛基質試驗（吲哚試驗）三目錄頁尿素酶試驗四氰化鉀試驗（KCN）五本試驗可同時觀察乳糖和蔗糖發(fā)酵產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣（變黃）；產(chǎn)生硫化氫（變黑）。葡萄糖被分解產(chǎn)酸可使斜面先變黃，但因量少，生成的少量酸，因接觸空氣而氧化，加之細菌利用培養(yǎng)基中含氮物質，生成堿性產(chǎn)物，故使斜面后來又變紅，底部由于是在厭氧狀態(tài)下，酸類不被氧化，所以仍保持黃色。a.uninoculated

b.littlechange/alkaline/-/-

c.alkaline/acid/-/+

d.acid/acid/+/+

e.acid/acid/+/-

slantcolor/buttcolor/gasproduction/hydrogensulfideproduction制好的培養(yǎng)基對照管斜面紅色，底面黃色培養(yǎng)基全黃色斜面、底部黃色，并產(chǎn)生H2S斜面紅色，底部黑色，產(chǎn)生H2S底面黃色，并產(chǎn)生CO2培養(yǎng)基變黑三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基中亦含有硫代硫酸鈉，若微生物有硫化氫產(chǎn)生，會與亞鐵離子作用生成不溶性硫化亞鐵之沉淀，進而使培養(yǎng)基變黑。三糖鐵瓊脂及賴氨酸脫羧酶試驗（三糖鐵及賴氨酸脫羧酶試驗）自選擇性瓊脂平板上分別挑取2個以上典型或可疑菌落,接種三糖鐵瓊脂,先在斜面劃線,再于底層穿刺;接種針不要滅菌,直接接種賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基和營養(yǎng)瓊脂平板,于36℃±1℃培養(yǎng)18h~24h,必要時可延長至48h。在三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基內(nèi),沙門氏菌屬的反應結果見表2。三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基內(nèi),沙門氏菌屬的反應結果（反應結果）注：本試驗的陽性反應為培養(yǎng)基不改變顏色，而培養(yǎng)基變黃色者為陰性反應。本試驗一定要設空白對照。培養(yǎng)基需用液體石蠟封蓋，阻止空氣的氧化作用。賴氨酸脫羧酶試驗靛基質（吲哚）試驗（靛基質（吲哚）試驗）尿素酶試驗（尿素酶試驗）

陰性（黃）陽性（紅）氰化鉀試驗（氰化鉀試驗）l氰化鉀試驗培養(yǎng)基：蛋白胨、磷酸鹽緩沖液、氯化鈉、氰化鉀。l原理：氰化鉀是劇毒藥物，可抑制某些細菌的呼吸酶系統(tǒng)，使這些酶失去活性，細菌的生長因此受到抑制。而某些細菌可對氰化鉀產(chǎn)生抗性，能在氰化鉀培養(yǎng)中生長。本試驗常用于沙門氏菌與檸檬酸桿菌的鑒定。l沙門氏菌生長情況：陰性（不生長）。注：本試驗必需設置對照管（不加氰化鉀），若對照管細菌生長良好，試驗管細菌不生長，可判定為陰性。若對照管與試驗管均無細菌生長，則應重復試驗。試驗失敗的主要原因是封口不嚴，氰化鉀逐漸分解，生成氫氰酸氣體逸出，以致藥物濃度降低細菌生長，呈假陽性反應。鑒定結果（鑒定結果）注：反應序號A1:典型反應判定為沙門氏菌屬。如尿素、KCN和賴氨酸脫羧酶3項中有1項異常,按表4可判定為沙門氏菌。如有2項異常為非沙門氏菌。補做試驗（補做試驗）反應序號A2:補做甘露醇和山梨醇試驗,沙門氏菌靛基質陽性變體兩項試驗結果均為陽性,但需要結合血清學鑒定結果進行判定。反應序號A3:補做ONPG。ONPG陰性為沙門氏菌,同時賴氨酸脫羧酶陽性,甲型副傷寒沙門氏菌為賴氨酸脫羧酶陰性。必要時按表5進行沙門氏菌生化群的鑒別。

說明（說明）

如選擇生化鑒定試劑盒或全自動微生物生化鑒定系統(tǒng),可根據(jù)5.4.1的初步判斷結果,從營養(yǎng)瓊脂平板上挑取可疑菌落,用生理鹽水制備成濁度適當?shù)木鷳乙?使用生化鑒定試劑盒或全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)進行鑒定。冷凍樣品解凍需在45℃以下，有自動調(diào)溫器自控的水浴鍋內(nèi)不斷攪拌進行15min或在2-8℃，18小時內(nèi)軟化。為保證檢驗的準確性，必須在選擇性培養(yǎng)基上挑取足夠數(shù)量的菌落進行生化和血清學鑒定。進行生化反應時，應以純培養(yǎng)物進行試驗，如出現(xiàn)血清學陽性，而生化反應特征不符合時，應對接種物進行純化，用純化后的培養(yǎng)物重新進行生化試驗。測試中應同時接種陽性對照菌株。

沙門氏菌檢驗——幾點注意（幾點注意）沙門氏菌檢測血清學分型血清分型一抗原介紹二血清學凝集試驗原理三血清學凝集試驗四目錄頁（血清分型）血清分型

沙門氏菌抗原結構是分類的重要依據(jù)。其抗原可分為菌體抗原(O抗原)、鞭毛抗原(H抗原)和表面抗原(Vi抗原)三種。該類菌，按菌體抗原結構的不同，可分為A、B、C、D、E、F、G、H、I等血清群，再按鞭毛抗原的不同而鑒別組內(nèi)的各血清型。目前，已知沙門氏菌共有2000多種血清型，在我國已發(fā)現(xiàn)有161個血清型，但從人類和動物經(jīng)常分離出的血清型卻只有40～50種，其中僅有10種是主要血清型。與人類有關的血清型主要隸屬于A～E組，即傷寒桿菌、甲、乙、丙型副傷寒桿菌、鼠傷寒桿菌、豬霍亂桿菌、腸炎桿菌、鴨沙門氏菌、新港沙門氏菌等，僅少數(shù)幾種對人致病，其中以鼠傷寒桿菌、腸炎桿菌及豬霍亂沙門菌為最常見。沙門氏菌抗原介紹（沙門氏菌抗原介紹）O抗原

為脂多糖，性質穩(wěn)定。能耐100℃達數(shù)小時，不被乙醇或0.1%石炭酸破壞。決定o型原特異性的是脂多糖中的多糖側鏈部分，以1、2、3等阿拉伯數(shù)字表示。例如乙型副傷寒桿菌有4、5、12三個。鼠傷寒桿菌有1、4、5、12四個；豬霍亂桿菌有6、7二個。其中有些o抗原是幾種菌所共有，如4、5為乙型副傷寒桿菌和鼠傷寒桿菌共有，將具有共同o抗原沙門氏菌歸為一組，這樣可將沙門桿氏菌屬分為a～z、o51～o63、o65～o67共有42組。中國已發(fā)現(xiàn)26個菌組、161個血清型。使人類致病的沙門氏桿菌大多屬于a～e組。o抗原刺激機體主要產(chǎn)生lgm抗體（沙門氏菌抗原介紹）H抗原

為蛋白質，對熱不穩(wěn)定，60℃經(jīng)15分鐘或乙醇處理被破壞。具有鞭毛的細菌經(jīng)甲醇液固定后，其o抗原全部被h抗原遮蓋，而不能與相應抗o抗體反應。h抗原的特異性取決于多肽鏈上氨基酸的排列順序和空間構型。沙門氏桿菌的h抗原有兩種，稱為第1相和第2相。第1相特異性高，又稱特異相，用a、b、c等表示，第2相特異性低，為數(shù)種沙門氏桿菌所共有，也稱非特異相，用1、2、3等表示。具有第1相和第2相h抗原的細菌稱為雙相菌，僅有一相者稱單相菌。每一組沙門氏桿菌根據(jù)h抗原不同，可進一步分種或型。h抗原刺激機體主要產(chǎn)生lgg抗體。

沙門氏菌抗原介紹（沙門氏菌抗原介紹）（沙門氏菌抗原介紹）沙門氏菌抗原介紹vi抗原

因與毒力有關而命名為vi抗原。由聚-n-乙酰-d-半乳糖胺糖醛酸組成。不穩(wěn)定，經(jīng)60℃加熱、石碳酸處理或人工傳代培養(yǎng)易破壞或丟失。新從患者標本中分離出的傷寒桿菌、丙型副傷寒桿菌等有此抗原。vi抗原存在于細菌表面，可阻止o抗原與其相應抗體的反應。vi抗原的抗原性弱。當體內(nèi)菌存在時可產(chǎn)生一定量抗體；細菌被清除后，抗體也隨之消失。故測定vi抗體有助于對傷寒帶菌者的檢出。（血清學凝集試驗原理）血清學凝集試驗原理

顆粒性抗原（如細胞、紅細胞等）與相應抗體結合，在電解質參與下所形成肉眼可見的凝集現(xiàn)象，稱為凝集反應。其中抗原為凝集原，抗體稱為凝集素。玻片凝集法是一種定性試驗方法，其原理是用已知抗體來檢測未知抗原，常用于鑒定菌種、血型。95%以上的沙門菌屬于A~F6個O群，常見的菌型在二十個左右，所以選用O多價A-I血清。（血清學凝集試驗）血清學凝集試驗沙門氏菌血清學菌體（O）試驗（用已知沙門氏菌培養(yǎng)物同所有抗血清做予試驗）。

a、多價菌體（O）試驗：

用A~F多價O血清做玻片凝集試驗,同時用生理鹽水做對照。在生理鹽水中自凝者為粗糙型菌株,不能分型。被A~F多價O血清凝集者,依次用O4;O3、O10;O7;O8;O9;O2和O11因子血清做凝集試驗。根據(jù)試驗結果,判定O群。被O3、O10血清凝集的菌株,再用O10、O15、O34、O19單因子血清做凝集試驗,判定E1、E4各亞群,每一個O抗原成分的最后確定均應根據(jù)O單因子血清的檢查結果,沒有O單因子血清的要用兩個O復合因子血清進行核對。不被A~F多價O血清凝集者,先用9種多價O血清檢查,如有其中一種血清凝集,則用這種血清所包括的O群血清逐一檢查,以確定O群。

（血清學凝集試驗）血清學凝集試驗

每種多價O血清所包括的O因子如下:O多價1A,B,C,D,E,F群(并包括6,14群)O多價213,16,17,18,21群O多價328,30,35,38,39群O多價440,41,42,43群O多價544,45,47,48群O多價650,51,52,53群O多價755,56,57,58群O多價859,60,61,62群O多價963,65,66,67群（血清學凝集試驗）血清學凝集試驗

b、H抗原的鑒定

屬于A~F各O群的常見菌型,依次用表6所述H因子血清檢查第1相和第2相的H抗原。（血清學凝集試驗）血清學凝集試驗

不常見的菌型,先用8種多價H血清檢查,如有其中一種或兩種血清凝集,則再用這一種或兩種血清所包括的各種H因子血清逐一檢查,以第1相和第2項的H抗原。8種多價H血清所包括的H因子如下:H多價1a,b,c,d,iH多價2eh,enx,enz15,fg,gms,gpu,gp,gq,mt,gz51H多價3k,r,y,z,z10,lv,lw,lz13,lz28,lz40H多價41,2;1,5;1,6;1,7;z6H多價5z4z23,z4z24,z4z32,z29,z35,z36,z38H多價6z39,z41,z42,z44H多價7z52,z53,z54,z55H多價8z56,z57,z60,z61,z62（血清學凝集試驗）血清學凝集試驗

每種多價O血清所包括的O因子如下:O多價1A,B,C,D,E,F群(并包括6,14群)O多價213,16,17,18,21群O多價328,30,35,38,39群O多價440,41,42,43群O多價544,45,47,48群O多價650,51,52,53群O多價755,56,57,58群O多價859,60,61,62群O多價963,65,66,67群每一個H抗原成分的最后確定均應根據(jù)H單因子血清的檢查結果,沒有H單因子血清的要用兩個H復合因子血清進行核對。檢出第1相H抗原而未檢出第2相H抗原的或檢出第2相H抗原而未檢出第1相H抗原的,可在瓊脂斜面上移種1代~2代后再檢查。如仍只檢出一個相的H抗原,要用位相變異的方法檢查其另一個相。單相菌不必做位相變異檢查。血清學凝集試驗（血清學凝集試驗）簡易平板法:

將0.35%~0.4%半固體瓊脂平板烘干表面水分,挑取因子血清1環(huán),滴在半固體平板表面,放置片刻,待血清吸收到瓊脂內(nèi),在血清部位的中央點種待檢菌株,培養(yǎng)后,在形成蔓延生長的菌苔邊緣取菌檢查。位相變異試驗方法（位相變異試驗方法）小玻管法:

將半固體管(每管約1mL~2mL)在酒精燈上溶化并冷至50℃,取已知相的H因子血清0.05mL~0.1mL,加入于溶化的半固體內(nèi),混勻后,用毛細吸管吸取分裝于供位相變異試驗的小玻管內(nèi),待凝固后,用接種針挑取待檢菌,接種于一端。將小玻管平放在平皿內(nèi),并在其旁放一團濕棉花,以防瓊脂中水分蒸發(fā)而干縮,每天檢查結果,待另一相細菌解離后,可以從另一端挑取細菌進行檢查。位相變異試驗方法（位相變異試驗方法）API20E第1位數(shù)第2位數(shù)第3位數(shù)第4位數(shù)第5位數(shù)第6位數(shù)第7位數(shù)結果判定ONPGADHLDCODCCITH2SURETDAINDVPGELGLUMANINOSORRGASACMELAMYARAOX124124124124124124124反應結果-+++++-----+++++-+-+-沙門氏菌應得樹枝024124000004124104020組合編碼6704752小倒管法:將兩端開口的小玻管(下端開口要留一個缺口,不要平齊)放在半固體管內(nèi),小玻管的上端應高出于培養(yǎng)基的表面,滅菌后備用。臨用時在酒精燈上加熱溶化,冷至50℃,挑取因子血清1環(huán),加入小套管中的半固體內(nèi),略加攪動,使其混勻,待凝固后,將待檢菌株接種于小套管中的半固體表層內(nèi),每天檢查結果,待另一相細菌解離后,可從套管外的半固體表面取菌檢查,或轉種1%軟瓊脂斜面,于36℃培養(yǎng)后再做凝集試驗。。位相變異試驗方法（位相變異試驗方法）（血清學凝集試驗）血清學凝集試驗

CVi抗原的鑒定用Vi因子血清檢查。已知具有Vi抗原的菌型有:傷寒沙門氏菌,丙型副傷寒沙門氏菌,都柏林沙門氏菌。（血清學凝集試驗）血清學凝集試驗

D

菌型的判定根據(jù)血清學分型鑒定的結果,按照附錄B或有關沙門氏菌屬抗原表判定菌型。沙門氏菌檢測血清學鑒定實驗目的及原理一實驗材料二沙門氏菌血清特性三實驗方法四結果判斷五目錄頁（實驗目的及原理）實驗目的及原理

實驗目的：

掌握細菌的血清學鑒定法。

實驗原理：根據(jù)抗原抗體反應具有高度特異性的特點，用已知抗體來檢測未知抗原（細菌）。實驗材料（實驗材料）1.菌種待檢細菌2.試劑多價沙門菌O(A-F)診斷血清3.其他載玻片血清學特性---O抗原（血清學特性）沙門氏菌具有復雜的抗原結構。雖然沙門氏菌具有O、H、K和其它表面物質(如菌毛)四種抗原，但只有O抗原是每個菌株均有的成分。O抗原（菌體抗原）*存在于菌體表面，為脂多糖，多糖部分決定其特異性，*O抗原耐熱(100℃、2.5h或121℃、2h加熱均不破壞其抗原性)，其特異性不易喪失或變異。*一個菌體具有一種或多種不同的O抗原。血清學特性---H抗原（血清學特性）H抗原（鞭毛抗原）*H抗原存在于鞭毛中，不耐熱，化學成分蛋白質，其抗原性可以被酒精所破壞。*H抗原可分為兩相:第1相：為特異相，用小寫英文字母表示，a～z，Z以后則從z1、z2……，已編到z83。第2相：為非特異相以阿拉伯數(shù)字表示，共7種。具有第1相和第2相H抗原的細菌稱為雙相菌，大多數(shù)沙門氏菌屬于此；僅有一相者稱單相菌，如腸炎沙門氏菌。極少數(shù)無鞭毛菌兩相抗原都不具有，稱為無相菌，如雞白痢沙門氏菌。血清學特性---Vi抗原（血清學特性）Vi抗原（包膜抗原）少數(shù)菌沙門氏菌中尚有一種表面包膜抗原，功能與大腸桿菌的K抗原類同，因一般認為它與毒力(Virulence)有關，故稱Vi抗原。經(jīng)過幾次傳代、60℃熱處理或石炭酸處理后容易消失。實驗方法——檢查培養(yǎng)物有無自凝性（檢查培養(yǎng)物有無自凝性）

一般采用1.2%~1.5%瓊脂培養(yǎng)物作為玻片凝集試驗用的抗原。首先排除自凝集反應,在潔凈的玻片上滴加一滴生理鹽水,將待試培養(yǎng)物混合于生理鹽水滴內(nèi),使成為均一性的混濁懸液,將玻片輕輕搖動30s~60s,在黑色背景下觀察反應(必要時用放大鏡觀察),若出現(xiàn)可見的菌體凝集,即認為有自凝性,反之無自凝性。對無自凝的培養(yǎng)物參照下面方法進行血清學鑒定。實驗方法——多價菌體抗原(O)鑒定（多價菌體抗原(O)鑒定）

在玻片上劃出2個約1cm×2cm的區(qū)域,挑取1環(huán)待測菌,各放1/2環(huán)于玻片上的每一區(qū)域上部,在其中一個區(qū)域下部加1滴多價菌體(O)抗血清,在另一區(qū)域下部加入1滴生理鹽水,作為對照。再用無菌的接種環(huán)或針分別將兩個區(qū)域內(nèi)的菌苔研成乳狀液。將玻片傾斜搖動混合1min,并對著黑暗背景進行觀察,任何程度的凝集現(xiàn)象皆為陽性反應。O血清不凝集時,將菌株接種在瓊脂量較高的(如2%~3%)培養(yǎng)基上再檢查;如果是由于Vi抗原的存在而阻止了O凝集反應時,可挑取菌苔于1mL生理鹽水中做成濃菌液,于酒精燈火焰上煮沸后再檢查。（結果判斷）結果判斷沙門氏菌O多價血清凝集試驗

左為陽性

右為陰性對照（多價鞭毛抗原(H)鑒定）實驗方法——多價鞭毛抗原(H)鑒定多價鞭毛抗原(H)鑒定操作同抗原（0）鑒定。H抗原發(fā)育不良時,將菌株接種在0.55%~0.65%半固體瓊脂平板的中央,待菌落蔓延生長時,在其邊緣部分取菌檢查;或將菌株通過接種裝有0.3%~0.4%半固體瓊脂的小玻管1次~2次,自遠端取菌培養(yǎng)后再檢查。沙門氏菌檢測樣品處理及預增菌樣品處理一預增菌二預增菌培養(yǎng)基三目錄頁（樣品處理）1.樣品處理

無菌操作稱取25g(mL)樣品,置于盛有225mLBPW的無菌均質杯或合適容器內(nèi),以8000r/min~10000r/min均質1min~2min,或置于盛有225mLBPW的無菌均質袋中,用拍擊式均質器拍打1min~2min。若樣品為液態(tài),不需要均質,振蕩混勻。如需調(diào)整pH,用1mol/mL無菌NaOH或HCl調(diào)pH至6.8±0.2。（預增菌）2.預增菌

預增菌使食品加工過程中受傷的沙門菌細胞恢復活力，未經(jīng)加工過的食品，檢驗前不需要前增菌。

無菌操作將樣品轉至500mL錐形瓶或其他合適容器內(nèi)(如均質杯本身具有無孔蓋,可不轉移樣品),如使用均質袋,可直接進行培養(yǎng),于36℃±1℃培養(yǎng)8h~18h。如為冷凍產(chǎn)品,應在45℃以下不超過15min,或2℃~5℃不超過18h解凍。3.預增菌培養(yǎng)基——緩沖蛋白胨水(BPW)（預增菌培養(yǎng)）基）3.1成分蛋白胨10.0g氯化鈉5.0g磷酸氫二鈉(含12個結晶水)9.0g磷酸二氫鉀1.5g蒸餾水1000mL3.2制法將各成分加入蒸餾水中,攪混均勻,靜置約10min,煮沸溶解,調(diào)節(jié)pH至7.2±0.2,高壓滅菌121℃,15min。沙門氏菌檢測增菌及培養(yǎng)增菌目的及原則一增菌培養(yǎng)基配制二增菌三目錄頁培養(yǎng)四沙門氏菌菌落特征五1.增菌目的及原則（增菌目的及原則）

選擇性增菌的目的是最大可能的檢出沙門氏菌，原則上必須使用兩種選擇性分離增菌液，一種是抑制除沙門氏菌以外其腸道菌的生長，一種是在不影響其他腸道菌生長的情況下促進沙門氏菌的生長。2.增菌培養(yǎng)基配制四硫磺酸鈉煌綠(TTB)增菌液亞硒酸鹽胱氨酸(SC)增菌液四硫磺酸鈉煌綠(TTB)增菌液（四硫磺酸鈉煌綠(TTB)增菌液））

(1)基礎液蛋白胨10.0g牛肉膏5.0g氯化鈉3.0g碳酸鈣45.0g蒸餾水1000mL除碳酸鈣外,將各成分加入蒸餾水中,煮沸溶解,再加入碳酸鈣,調(diào)節(jié)pH至7.0±0.2,高壓滅菌121℃,20min。四硫磺酸鈉煌綠(TTB)增菌液（四硫磺酸鈉煌綠(TTB)增菌液）(2)硫代硫酸鈉溶液硫代硫酸鈉(含5個結晶水)50.0g蒸餾水加至100mL高壓滅菌121℃,20min。四硫磺酸鈉煌綠(TTB)增菌液(3)碘溶液碘片20.0g碘化鉀25.0g蒸餾水加至100mL將碘化鉀充分溶解于少量的蒸餾水中,再投入碘片,振搖玻瓶至碘片全部溶解為止,然后加蒸餾水至規(guī)定的總量,貯存于棕色瓶內(nèi),塞緊瓶蓋備用。（四硫磺酸鈉煌綠(TTB)增菌液））四硫磺酸鈉煌綠(TTB)增菌液(4)0.5%煌綠水溶液煌綠0.5g蒸餾水100mL溶解后,存放暗處,不少于1d,使其自然滅菌。（四硫磺酸鈉煌綠(TTB)增菌液））四硫磺酸鈉煌綠(TTB)增菌液(5)牛膽鹽溶液牛膽鹽10.0g蒸餾水100mL加熱煮沸至完全溶解,高壓滅菌121℃,20min。（四硫磺酸鈉煌綠(TTB)增菌液））四硫磺酸鈉煌綠(TTB)增菌液(6)制法基礎液900mL硫代硫酸鈉溶液100mL碘溶液20.0mL煌綠水溶液2.0mL牛膽鹽溶液50.0mL臨用前,按上列順序,以無菌操作依次加入基礎液中,每加入一種成分,均應搖勻后再加入另一種成分。（四硫磺酸鈉煌綠(TTB)增菌液））亞硒酸鹽胱氨酸(SC)增菌液（亞硒酸鹽胱氨酸(SC)增菌液）(1)成分蛋白胨5.0g乳糖4.0g磷酸氫二鈉10.0g亞硒酸氫鈉4.0gL-胱氨酸0.01g蒸餾水1000mL亞硒酸鹽胱氨酸(SC)增菌液（2）制法除亞硒酸氫鈉和L-胱氨酸外,將各成分加入蒸餾水中,煮沸溶解,冷至55℃以下,以無菌操作加入亞硒酸氫鈉和1g/LL-胱氨酸溶液10mL(稱取0.1gL-胱氨酸,加1mol/L氫氧化鈉溶液15mL,使溶解,再加無菌蒸餾水至100mL即成,如為DL-胱氨酸,用量應加倍)。搖勻,調(diào)節(jié)pH至7.0±0.2。（亞硒酸鹽胱氨酸(SC)增菌液）

（TTB)增菌液培養(yǎng)基允許沙門氏菌持續(xù)增菌，同時阻止大多數(shù)其他細菌的增殖。未經(jīng)加工的食品不必經(jīng)過前增菌而直接增菌選擇性平板分離：采用固體選擇培養(yǎng)基，抑制非沙門氏菌的生長，提供肉眼可見的疑似沙門氏菌純菌落的識別。3.增菌（增菌）4.培養(yǎng)（培養(yǎng)）

輕輕搖動培養(yǎng)過的樣品混合物,移取1mL,轉種于10mLTTB內(nèi),于42℃±1℃培養(yǎng)18h~24h。同時,另取1mL,轉種于10mLSC內(nèi),于36℃±1℃培養(yǎng)18h~24h。5.沙門氏菌菌落特征（沙門氏菌菌落特征）沙門氏菌屬在不同選擇性瓊脂平板上的菌落特征食品中沙門氏菌檢驗標準（GB4789.4-2016)及解讀檢驗必備物品二檢驗程序三目錄頁標準說明及適用范圍一本標準代替GB4789.4—2010《食品安全國家標準食品微生物學檢驗沙門氏菌檢驗》、SN0170—1992《出口食品沙門氏菌屬(包括亞利桑那菌)檢驗方法》、SN/T2552.5—2010《乳及乳制品衛(wèi)生微生物學檢驗方法第5部分:沙門氏菌檢驗》。整合后的標準與GB4789.4—2010相比,主要變化如下:———修改了檢測流程和血清學檢測操作程序;———修改了附錄A和附錄B。一、標準說明及適用范圍標準說明及適用范圍范圍本標準規(guī)定了食品中沙門氏菌(Salmonella)的檢驗方法。本標準適用于食品中沙門氏菌的檢驗。（檢驗必備物品）二、檢驗必備物品1.檢驗所需儀器設備：高壓蒸汽滅菌鍋、超凈工作臺、冰箱（2℃~5℃）、恒溫培養(yǎng)箱（36℃±1℃,42℃）±1℃、均質器、振蕩器、電子天平（感量0.1g）、無菌錐形瓶（容量500mL,250mL）、無菌吸管（1mL、具0.01mL刻度；10mL、具0.1mL刻度)或微量移液器及吸頭、無菌培養(yǎng)皿（直徑60mm,90mm）、無菌試管（3mm×50mm、10mm×75mm）、pH計或pH比色管或精密pH試紙、全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)。（檢驗必備物品）2.檢驗所需培養(yǎng)基、試劑：緩沖蛋白胨水(BPW)、四硫磺酸鈉煌綠(TTB)增菌液、亞硒酸鹽胱氨酸(SC)增菌液、亞硫酸鉍(BS)瓊脂、HE瓊脂、木糖賴氨酸脫氧膽鹽(XLD)瓊脂、沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基、三糖鐵(TSI)瓊脂、蛋白胨水、靛基質試劑、尿素瓊脂(pH7.2)、氰化鉀(KCN)培養(yǎng)基、賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基、糖發(fā)酵管、鄰硝基酚β-D半乳糖苷(ONPG)培養(yǎng)基、半固體瓊脂、丙二酸鈉培養(yǎng)基、沙門氏菌O、H和Vi診斷血清、生化鑒定試劑盒。（檢驗程序—檢驗流程）三、檢驗程序（一）檢驗流程：預增菌增菌分離樣品預處理血清學鑒定血清學分型(選做)生化試驗結果與報告（檢驗程序—檢驗流程）（二）檢驗步驟（檢驗程序—檢驗步驟）檢測前的準備：盡可能縮短解凍時間，使竟爭菌群生長最少，并減小對沙門氏菌的損傷致病菌取樣一定要均勻并具有代表性。培養(yǎng)基配制應按照說明書上的用量進行換算，稱取準確分量的合成培養(yǎng)基粉末；加熱煮沸溶解培養(yǎng)基時，留意鍋內(nèi)水位的變化，水位下降可再添加適量的水，以免水分蒸發(fā)過多，導致后面分裝不夠量；往試管中放小導管時，注意處理氣泡。（二）檢驗步驟（檢驗程序—檢驗步驟）1.預增菌無菌操作稱取25g(mL)樣品,置于盛有225mLBPW的無菌均質杯或合適容器均質,若樣品為液態(tài),不需要均質,振蕩混勻。如需調(diào)整pH至6.8±0.2。于36℃±1℃培養(yǎng)8h~18h。如為冷凍產(chǎn)品,應在45℃以下不超過15min,或2℃~5℃不超過18h解凍。注意:對所有樣品均進行8-18h預增菌，強調(diào)無菌操作稱取樣品。（二）檢驗步驟（檢驗程序—檢驗步驟）2.增菌

移取培養(yǎng)過的樣品混合物1mL,轉種于10mLTTB內(nèi),于42℃±1℃培養(yǎng)18h~24h。同時,另取1mL,轉種于10mLSC內(nèi),于36℃±1℃培養(yǎng)18h~24h。在含選擇性抑制劑的促生長培養(yǎng)基中間，樣品進一步增菌的一個步驟。此培養(yǎng)基允許沙門氏菌持續(xù)增殖，同時阻止大多數(shù)其他細菌的增殖。（二）檢驗步驟（檢驗程序—檢驗步驟）3.分離用直徑3mm的接種環(huán)取增菌液劃線接種于一個BS瓊脂平板和一個XLD瓊脂平板(或HE瓊脂平板或沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基平板),于36℃±1℃分別培養(yǎng)40h~48h(BS瓊脂平板)或18h~24h(XLD瓊脂平板、HE瓊脂平板、沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基平板),觀察各個平板上生長的菌落。這一步采用固體選擇性培養(yǎng)基，抑制非沙門氏菌的生長，提供肉眼可見的疑似沙門氏菌純菌落的識別。BS瓊脂：菌落為黑色有金屬光澤、棕褐色或灰色，菌落周圍培養(yǎng)基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰綠色的菌落。周圍培養(yǎng)基不變。HE瓊脂：藍綠色或藍色，多數(shù)菌落中心黑色或幾乎全黑色；有些菌株為黃色，中心黑色或幾乎全黑色。XLD瓊脂：菌落呈粉紅色，帶或不帶黑色中心，有些菌株可呈現(xiàn)大的帶光澤的黑色中心，或呈現(xiàn)全部黑色的菌落；有些菌株為黃色菌落，帶或不帶黑色中心。沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基：按照顯色培養(yǎng)基的說明進行判定。（二）檢驗步驟（檢驗程序—檢驗步驟）4.生物化學篩選

自選擇性瓊脂平板上分別挑取2個以上典型或可疑菌落,接種三糖鐵瓊脂，后直接接種賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基和營養(yǎng)瓊脂平板，于36℃±1℃培養(yǎng)18h~24h,必要時可延長至48h。同時，可直接接種蛋白胨水(供做靛基質試驗)、尿素瓊脂(pH7.2)、氰化鉀(KCN)培養(yǎng)基，也可在初步判斷結果后從營養(yǎng)瓊脂平板上挑取可疑菌落接種。于36℃±1℃培養(yǎng)18h~24h，必要時可延長至48h，將已挑菌落的平板儲存于2℃~5℃或室溫至少保留24h，以備必要時復查，必要時可進行沙門氏菌生化群的鑒別。本步驟排除大多數(shù)非沙門氏菌。也提供了沙門氏菌培養(yǎng)物菌屬的初步鑒定。三糖鐵瓊脂：沙門氏菌反應為：斜面產(chǎn)堿，底層產(chǎn)酸，產(chǎn)H2S。尿素瓊脂試驗：變紅色為陽性，不變色或者變黃色為陰性。沙門氏菌為陰性。靛基質(吲哚)試驗：沙門氏菌為陰性。ONPG試驗：溶液變黃色為陽性，不變色為陰性。沙門氏菌ONPG試驗為陰性。

賴氨酸脫羧酶試驗：賴氨酸脫羧酶肉湯和氨基酸脫羧酶對照均變黃為陰性，賴氨酸脫羧酶肉湯變紫，氨基酸脫羧酶對照變黃為陽性。沙門氏菌為陽性。如果選擇系統(tǒng)生化做生化試驗,可根據(jù)初步判斷結果,從營養(yǎng)瓊脂平板上挑取可疑菌落,用生理鹽水制備成濁度適當菌懸液,使用生化鑒定試劑盒或全自動微生物生化鑒定系統(tǒng),進行鑒定。（二）檢驗步驟（檢驗程序—檢驗步驟）5.血清學技術提供了培養(yǎng)物菌種的鑒定。血清學試驗必須基于生化試驗的結果，不能單純以血清學實驗結果來報告最終結果。檢查培養(yǎng)物有無自凝性、多價菌體抗原(O)鑒定、多價鞭毛抗原(H)鑒定6.血清學分型(選做項目)必要時進行沙門氏菌群的鑒別。血清學分型有利于診斷病情，有利于進行流行病學監(jiān)測，進行流行病暴發(fā)溯源。1)O抗原的鑒定2)H抗原的鑒定3)Vi抗原的鑒定4)菌型的判定致病菌檢測的方法

致病菌檢驗方法一目錄頁

沙門氏菌檢驗方法二致病菌檢驗方法1.大腸埃希氏菌檢驗方法2.志賀氏菌檢驗方法3.金黃色葡萄球菌檢驗方法4.副溶血性弧菌檢驗方法5.蠟樣芽孢桿菌檢驗方法（大腸埃希氏菌檢驗方法）大腸埃希氏菌檢驗方法國標法參看食品衛(wèi)生微生物學檢驗致瀉大腸埃希氏菌檢驗(GB/T4789.6)。檢測大腸桿菌及其腸毒素的新技術、新方法很多。如用K88單抗血清對糞中K88菌檢出率比常規(guī)培養(yǎng)法提高1倍，最小檢測菌量為10000cfu/mL。987P酶標單抗對糞便和腸內(nèi)容物最小檢出菌量為2000cfu/mL。對致病性大腸桿菌毒力基因檢測，過去多用動物或細胞培養(yǎng)測定，現(xiàn)可用其單抗以多種免疫學手段檢出。如用免疫磁分離法檢測牛糞便和食品標本的大腸桿菌O157：H7，可提高了大腸桿菌O157：H7感染病例的檢出率。（志賀氏菌檢驗方法志賀氏菌檢驗方法目前志賀氏菌檢驗多采用國標法(GB/T4789.5)。（金黃色葡萄球菌檢驗方法金黃色葡萄球菌檢驗方法MPN法：適用于檢測帶有大量競爭菌的食品及其原料和未經(jīng)處理的含少量金黃色葡萄球菌的食品。直接平板計數(shù)法：適用于檢查金黃色葡萄球菌數(shù)不小于10/g（ml）的食品增菌培養(yǎng)法：適用于檢查含有受損傷的金黃色葡萄球菌的加工食品。定量方法定性方法（副溶血性弧菌檢驗方法副溶血性弧菌檢驗方法副溶血性弧菌的檢驗多采用國標法(GB/T4789.7)（蠟樣芽孢桿菌檢驗方法）蠟樣芽孢桿菌檢驗方法蠟樣芽孢桿菌檢驗多采用國標法(GB/T4789.28)。國標法免疫學標記檢測方法

分子生物學方法其他檢測沙門氏菌的方法沙門氏菌檢驗方法（國標法）國標法GB4789.4—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗沙門氏菌檢驗》對沙門氏菌的常規(guī)檢驗包括以下5個基本步驟：預增菌和增菌；分離；生化試驗；血清學鑒定；血清學分型(選做項目)；結果與報告。免疫學標記檢測方法.酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA).斑點酶聯(lián)免疫吸附法（Dot-ELISA）.免疫熒光抗體技術.其它免疫學標記檢測方法（免疫學標記檢測方法）（免疫學標記檢測方法）免疫學標記檢測方法免疫標記技術就是將已知抗體或者抗原上標記上易顯示的物質(標記分子)，通過檢測標記物反映有無抗原抗體反應,從而間接檢測出微量的抗原或者抗體。

所謂的標記分子是那些即使在超微量時也能通過特殊的方法將其檢測出來，高敏感性的標記分子主要有突光素、酶、放射性同位素3種。免疫標記技術不僅大大提高了試驗的敏感性，和光鏡或電鏡技術結合后，能對待檢物質做精細定位，為臨床研究和診斷提供了極大的方便。（酶聯(lián)免疫吸附法）

酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)ELISA的原理是是把抗原或抗體預先結合在某種固相載體表面，然后加入受檢樣品和酶標抗原或抗體使其與結合在固相載體上的抗原或抗體起反應形成抗原抗體復合物，經(jīng)洗滌去除反應液中其他物質，加入酶反應底物后，底物被固相載體上的酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，最后通過定性或定量分析有色產(chǎn)物即可確定樣品中待測物質含量。該法靈敏度高、特異性強，可避免人為因素造成的假陰性，且能在短時間內(nèi)快速篩去大量的陰性樣品，（斑點酶聯(lián)免疫吸附法）斑點酶聯(lián)免疫吸附法（Dot-ELISA）Dot-ELISA是以纖維素膜作為固相載體的一種新型免疫檢測技術，其原理與常規(guī)ELISA法相同，可用于抗原或抗體的定性或定量檢測。其與ELISA的不同之處在于：一是將固相載體以硝酸纖維素濾膜、確酸醋酸混合纖維素濾膜、重氮節(jié)氧甲基化紙等固相化基質膜代替，用以吸附抗原或抗體；二是顯色底物的供氫體為不溶性的，結果在基質膜上出現(xiàn)有色斑點進行判定。該方法具有簡單、快速、靈敏、特異性強等特點,并具有較高的可重復性，而且陽性反應色斑易于觀察,陽性檢出率也高于常規(guī)分離培養(yǎng)法，且整個操作過程不需要任何特殊儀器，適用于大批量樣品的快速檢測，可以節(jié)省大量人力、物力、財力，便于在基層單位推廣應用（免疫熒光抗體技術）免疫熒光抗體技術免疫熒光抗體技術是根據(jù)抗原抗體反應的原理，先將已知的抗原或抗體標記上熒光素，制成熒光抗體，再用這種熒光抗體作為探針檢測組織或細胞內(nèi)的相應抗原。在組織或細胞內(nèi)形成的抗原抗體復合物上含有標記的熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標本，熒光素受外來激發(fā)光的照射而發(fā)生明亮的熒光(黃綠色或橘紅色)，可以看見熒光所在的組織細胞，從而確定抗原或抗體的性質、定位，以及利用定量技術測定含量。（其它免疫學標記檢測方法）其它免疫學標記檢測方法免疫磁性分離法是將特異性抗體偶聯(lián)在磁性顆粒表面，通過與樣品中靶細菌的特異性結合和外加磁場的作用，使靶細菌得到分離、濃縮。此技術直接檢測細菌特異性好，但靈敏度低。分子生物學方法.核酸探針.聚合酶鏈式反應技術(PCR).環(huán)介導等溫擴增技術（LAMP）.基因芯片技術（分子生物學方法）（核酸探針）核酸探針通過酶切質粒DNA來進行，它主要采用一定數(shù)量的限制性內(nèi)切酶，對提純質粒的DNA酶切，分別得到不同DNA片斷，用于檢測食品中沙門氏菌的存在（聚合酶鏈式反應技術(PCR)）聚合酶鏈式反應技術(PCR)PCR技術是一項體外酶促擴增DNA技術，具有特異性強、敏感性高、操作簡便、快速高效等特點。目前，PCR技術是一種快速、簡便、特異、靈敏檢測沙門氏菌的方法。（環(huán)介導等溫擴增技術）環(huán)介導等溫擴增技術（LAMP）LAMP技術的原理是針對靶基因的6

個區(qū)域按照規(guī)定的順序設計4種特異的引物，因此

LAMP

技術擴增的特異性很高，只要出現(xiàn)擴增就可以判定靶基因存在。同時，在DNA

延伸合成過程中，從

dNTP

中析出的焦磷酸離子與反應溶液中的鎂離子結合，會產(chǎn)生白色的焦磷酸鎂沉淀。

因此只要用肉眼觀察白色混濁沉淀，就能鑒定擴增與否[25]。LAMP

技術具備操作簡單、特異性強、反應快速、靈敏度高的特點，LAMP

技術在微生物檢測方面上得到了廣泛的應用。（基因芯片技術）基因芯片技術基因芯片是一種固定有很多已知序列

DNA

探針的硅片或玻片。將經(jīng)過熒光標記的樣品分子與基因芯片上的

DNA探針進行雜交，通過檢測每個探針分子的熒光信號強度以得到樣品分子的數(shù)量和序列信息，基因芯片表面的

DNA

探針從幾十到幾百萬個不等，可以一次性檢測多種病原菌，并同時得到病原菌的耐藥性等情況。（噬菌體法）噬菌體法噬菌體對細菌有特殊的裂解作用。其方法是挑取鑒別培養(yǎng)基上的可疑菌落，作胨水培養(yǎng)(37℃過夜)，若菌液渾濁，作1:200稀釋，再用滅菌棉簽在烘干的瓊脂平皿上作條狀涂布，待平板菌液干燥后，用微量加樣器依次在每個區(qū)域滴加沙門氏菌噬菌體進行裂解試驗。（微量熱量測定法）微量熱量測定法微熱量計技術是通過測定細菌生長時熱量的變化進行細菌的檢出和鑒別。微生物在生長過程中產(chǎn)生熱量，雖然產(chǎn)生的量很小，但仍能通過敏感的微熱量計進行測量。用微熱量計對微生物計數(shù)時，溫譜圖必須與絕對微生物細胞數(shù)呈相關性，一旦建立了參考溫譜圖，食品樣品溫譜圖便可與之相比較而得到微生物的絕對數(shù)量。致病菌檢測的意義和種類

致病菌檢測的意義一致病菌檢測的種類二目錄頁

（致病菌檢測意義）致病菌檢測的意義食源性致病菌，指在食品的加工和流通過程中引入的病原菌，這些病原菌在食品中存活、生長代謝引起食物的變質和破壞，同時有些病原菌分泌有毒物質，直接或間接導致人患病。

（致病菌檢測意義）致病菌檢測的意義

畜產(chǎn)品中的致病菌生長繁殖快，代謝強，且容易出現(xiàn)變異。因此很容易引起食物中毒，其中毒表現(xiàn)為潛伏期短，發(fā)病過程急劇，所有病人都有類似的臨床表現(xiàn)，且多表現(xiàn)為腸胃炎的癥狀，因此，畜產(chǎn)品中致病菌的檢測具有非常重要的意義。致病菌檢測的種類1.大腸埃希氏菌2.志賀氏菌3.金黃色葡萄球菌4.副溶血性弧菌5.蠟樣芽孢桿菌6.沙門氏菌（致病菌檢測的種類）

致病菌檢測的種