基因組注釋詳解

基因組注釋基因組測(cè)序相關(guān)技術(shù)發(fā)展

198119861989199119941998200020022003200620072008Inthecomingfuture200920102005AffylaunchesGeneExpressionmicroarraysRiseofGenbankdatabasesfromDNAsequencingABIcommercializesfirstautomatedDNAsequencerLowhangingfruit:cysticfibrosismutationidentified3700DNAAnalyzerinHumanGenomeProject;DNAsequencinggoesindustrialFirstmicroarraypublication-onArabidopsisILMNlaunchesgeneexpressionarraysHumanGenomeProject&CeleraGenomicscompletesfirstdraftgenomeHapmapprojectlaunchedHapmap1stphasedatareleaseAffy&ILMNbothlaunched100KgenotypingarraysRiseofGenomeWideAssociationStudies(GWAS)RocheGSFLXlaunchedILMNboughtSolexa;launchesGAABISOLiD1.0Launched!TheSequencingShakeup!!SOLiD3.0:100GBoutofthebox!The3rdGenerationSequencingwillbelaunchedILMNHiSeq2000launched<2weeks~$1,0000.010.101.0010.00100.001,000.0010,000.00100,000.00$MThroughput

(Gb)CostofperHumanGenomeInnovationofNGSthroughput3Gb6Gb20-30Gb0204060801001202402007200820092010199020012012200720100.001Moore’sLaw更低的價(jià)格使得基于測(cè)序的科研和臨床應(yīng)用越來越被接受13years~$3,000,000,000200Gb-300Gb測(cè)序技術(shù)的發(fā)展帶來測(cè)序價(jià)格的下降Illumina/Solexa/GIIxGeneticAnalyzer50~95GB/runIllumina/Solexa/HiSeq200GB/runRoche/454GenomeSequencerFLX500Mb/runAppliedBiosystemsSOLiD4100GB/runAppliedBiosystemsSOLiD/HQ300GB/run成熟的二代測(cè)序技術(shù)平臺(tái)高通量測(cè)序服務(wù)未知基因組測(cè)序(Denovogenomesequencing)基因組重測(cè)序(Wholegenomeresequencing)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析MatePair測(cè)序構(gòu)建Scaffold30X的覆蓋率

(454&(SolexaorSOLiD))序列預(yù)處理（質(zhì)量控制）基因組拼接（基于reference拼接）注釋(基因功能、代謝通路、比較基因組)SNP發(fā)現(xiàn)及注釋實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析30X以上的覆蓋率

(Solexa

orSOLiD)序列預(yù)處理（質(zhì)量控制）基因組分型技術(shù)SNP、Indel、CNV、染色體結(jié)構(gòu)變異及注釋與表型相關(guān)的全基因組關(guān)聯(lián)分析和功能連鎖性分析高通量測(cè)序服務(wù)外顯子捕獲測(cè)序(Targetexomecapture)全基因組甲基化測(cè)序(DNAmethylationsequencing)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析>30X的覆蓋率

(SolexaorSOLiD)序列預(yù)處理（質(zhì)量控制）基因組分型技術(shù)SNP、Indel、CNV、染色體結(jié)構(gòu)變異及注釋與表型相關(guān)的全基因組關(guān)聯(lián)分析和功能連鎖性分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析30X以上的覆蓋率(Solexa

orSOLiD)序列預(yù)處理（質(zhì)量控制）甲基化位點(diǎn)檢測(cè)及注釋高通量測(cè)序服務(wù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-seqsequencing)microRNA測(cè)序(microRNAsequencing)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析mRNA打斷、反轉(zhuǎn)錄、加接頭Denovo454構(gòu)建轉(zhuǎn)錄圖譜Reference

barcode建庫Solexa，SOLiD

序列預(yù)處理（質(zhì)量控制）表達(dá)豐度統(tǒng)計(jì)注釋(功能、代謝通路、表達(dá)差異比較)未知轉(zhuǎn)錄本的分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析microRNA提取、兩頭加接頭、反轉(zhuǎn)錄、建庫

(Solexa

orSOLiD)序列預(yù)處理（質(zhì)量控制）已知microRNA豐度統(tǒng)計(jì)未知microRNA預(yù)測(cè)及豐度統(tǒng)計(jì)高通量測(cè)序服務(wù)元基因組測(cè)序(meta-genomesequencing)未知病毒檢測(cè)(Unknown

virusdetecting)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析DNA提取、建庫序列預(yù)處理（質(zhì)量控制）拼接、注釋(功能、代謝通路)豐度統(tǒng)計(jì)、比較元基因組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析低量RNA、DNA處理、建庫與宿主、微生物、病毒數(shù)據(jù)庫比較未知病毒的發(fā)現(xiàn)及預(yù)測(cè)兩種測(cè)序策略：基于BAC的方法：先把基因組打碎成200－300kb的片段并制成BAC文庫，再選擇一些BAC進(jìn)一步打碎成3kb左右的小片段，測(cè)序并拼接。全基因組鳥槍法：把基因組直接打碎成3kb左右的小片段，測(cè)序并拼接?；贐AC的方法全基因組DNA隨機(jī)打成大片段選擇并克隆大片段排序，選擇再打碎，克隆，測(cè)序，拼接全基因組鳥槍法基因組DNA

隨機(jī)打碎

測(cè)序并拼接

拼接軟件的新需求能充分利用正反向測(cè)序的配對(duì)信息,避免重復(fù)序列造成的錯(cuò)誤拼接能處理數(shù)以百萬甚至千萬計(jì)的數(shù)據(jù)

程序并行化高效率比對(duì)能逐步拼接基因組注釋SequenceGENESCANORFFinderGENEMARKGenePrediction…BlastnFastaHomologySearchTranscriptionRegulatoryRegionDomainIdentify(HMMER,BLIMPS)Transmembrane(TMAP,TMHMM)LocalizationSites(Psort)Physical&ChemicalPara(PI/MW,EXTCOEF)Post-translationalmodifications(NetNGlyc…)ProteinAnnotation…GeneOntologyPathwayPredictedGeneOrGene原核（Prokaryote）基因編碼區(qū)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)非翻譯區(qū)被轉(zhuǎn)錄區(qū)起始密碼子終止密碼子5’3’上游

轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)下游基因組注釋SequenceGENESCANORFFinderGENEMARKGenePrediction…BlastnFastaHomologySearchTranscriptionRegulatoryRegionDomainIdentify(HMMER,BLIMPS)Transmembrane(TMAP,TMHMM)LocalizationSites(Psort)Physical&ChemicalPara(PI/MW,EXTCOEF)Post-translationalmodifications(NetNGlyc…)ProteinAnnotation…GeneOntologyPathwayPredictedGeneOrGene開放閱讀框ORF

(OpenReadingFrame)一段序列從起始密碼子（startcodon）開始,到終止密碼子（stopcodon）結(jié)束，而且其中不包含其它終止密碼子。微生物基因發(fā)現(xiàn)要解決的問題微生物基因組中80%-90%的序列參與編碼主要問題：如果有兩個(gè)或更多重疊的閱讀框，哪一個(gè)是基因(假定只可能有一個(gè))最可靠的方法–

同源搜索(使用BLAST或FASTA等)主要困難：在無已知同源性信息的情況下尋找基因預(yù)測(cè)軟件GetORFWebAccess

http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/getorf.htmlApplication(DownloadEmboss)

GETORF:AdvancedOptions

i.Codetouse：選擇不同的codonusagetable，包含有：

(1)Standard

(2)Standard(withalternativeinitiationcodons)

(3)VertebrateMitochondrial

(4)YeastMitochondrial

(5)Mold,Protozoan,CoelenterateMitochondrialandMycoplasma/Spiroplasma

(6)InvertebrateMitochondrial

(7)CiliateMacronuclearandDasycladacean

(8)EchinodermMitochondrial

(9)EuplotidNuclear

(10)Bacterial

(11)AlternativeYeastNuclear

(12)AscidianMitochondrial

(13)FlatwormMitochondrial

(14)BlepharismaMacronuclear

(15)ChlorophyceanMitochondrial

(16)TrematodeMitochondrial

(17)Scenedesmusobliquus

(18)ThraustochytriumMitochondrialGETORF:AdvancedOptionsii.最小的開放閱讀框由多少個(gè)核甘酸組成，預(yù)設(shè)值為30，也就是10個(gè)氨基酸。iii.Typeofoutput：可選擇不同的輸入結(jié)果，包含有：

(1)TranslationofregionsbetweenSTOPcodons

(2)TranslationofregionsbetweenSTARTandSTOPcodons

(3)NucleicsequencesbetweenSTOPcodons

(4)NucleicsequencesbetweenSTARTandSTOPcodons

(5)NucleotidesflankingSTARTcodons

(6)NucleotidesflankinginitialSTOPcodons

(7)NucleotidesflankingendingSTOPcodonsfastagcgphylipemblswissncbinbrfgenbankigcodatastrideracedbstadentextfitchmsfclustalphylipphylip3asn1Metagenomics

CommunityGenomics●EnvironmentalGenomicsWhoisthere?–diversity&abundanceWhattheyaredoing?–Metabolic&interactionWhytheyarethere?–EcologicalrelationsSpeciescomplexityAcidminedrainage1 100 1000 10000SeawaterHumangutSoilThecultivation-independentanalysisofthecollectivegenomesofmicrobialpopulationsobtaineddirectlyfromtheenvironmentTheComplexityofMetagenomicsAABCDA’Isolatedgenome–singlesourceofDNAMetagenome–multiplesourceofDNAXGenomeAnnotation,Metagenomics?readsassembliesgenesannotationTraditionalgenomicsreadsassembliesORFsannotationMetagenomics???

HugeMultipleorganismsFragmental

HugePartialORFsWrongORFsQ:Solution?

A:Clustering.ProteinfamiliesNovelfamiliesORFvalidation

HugeMultipleorganismsUnevencoverage真核生物的基因的完整結(jié)構(gòu)

及它的表達(dá)過程transcriptionRNAsplicingproteintranslationexon1DNAexon2exon3intron1intron2promotergtgtagagupstreamdownstream5’UTR3’UTRgtgtagagPrimaryRNAtranscript3`5’MatureRNAUTSuga,uaa,uag3`aaa…5’基因識(shí)別找出在一段DNA序列中，是否存在ORF，亦及“基因”。判明基因的結(jié)構(gòu),包括起止位置,外顯子/內(nèi)含子邊界,啟動(dòng)子,polyA區(qū)域,非轉(zhuǎn)譯區(qū)（UTR）等。預(yù)測(cè)真基因和“假基因”（pseudogene）及可能的剪切位點(diǎn)。基于同源性的基因預(yù)測(cè)法“從頭開始”(Abinitio)預(yù)測(cè)法綜合使用以上兩種方法:如TwinScan其它方法:如數(shù)字信號(hào)處理，Z曲線,等基因預(yù)測(cè)方法分類基于序列相似性的基因預(yù)測(cè)將基因組序列與EST（expressedsequencetag，表達(dá)序列標(biāo)記)或cDNA等相比較(用Sim4等方法),從而找出與mRNA相對(duì)應(yīng)的區(qū)域。將基因組序列與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫相比較(用BLASTX等方法)，從而找出可能的編碼區(qū)。將預(yù)測(cè)得到的多肽與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫相比較將基因組序列與同源性相近物種的基因組相比較,找出保守區(qū)域。優(yōu)點(diǎn)：基于已有的生物學(xué)數(shù)據(jù),因此結(jié)果更有生物學(xué)意義缺點(diǎn):

受限于已有的生物學(xué)數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)庫可能存在的誤差對(duì)于相似程度應(yīng)如何定義基于同源性的基因預(yù)測(cè)法優(yōu)缺點(diǎn)同源搜索HomologySearcha.序列局部相似比較。試圖發(fā)現(xiàn)有生物意義保守序列，而不一定要全局相似?？梢杂删植肯嗨频贸鰞尚蛄锌赡苡邢嗤δ芑蚬δ芟嚓P(guān)。b.比較得到的是相似性，并非同源性，我們必須根據(jù)相似性結(jié)合其他證據(jù)做出判斷。BlastWeb:/blast/Application:/BLAST/download.shtml如何正確看待比較結(jié)果BLAST找出的結(jié)果僅僅是表示兩條序列之間有局部相似，與同源性關(guān)系不大，認(rèn)定功能相同或相關(guān)也不是充分的。一定要結(jié)合其他的分析結(jié)果判斷。BLAST結(jié)果中相似部分需要認(rèn)真仔細(xì)觀察?？纯聪嗨频牟糠质巧锷瞎δ苤匾谋Ｊ夭糠?，還是一些無關(guān)緊要的重復(fù)序列結(jié)合已知的信息（比如該蛋白不可能有某種功能和可能有某種功能），注意在比較中排在后面的是否與其他已知信