熒光原位雜交FISH實驗步驟與方法

帥實驗步驟—、實驗儀器：熒光顯微鏡：高速離心機(jī)：可達(dá)12000r/min高壓滅菌鍋：160°C以上殺菌恒溫箱：為雜交提供恒左溫度恒溫水浴鍋照相機(jī)(與熒光顯微鏡配套)：熒光捕捉圖片二、試劑的配制：1、 0.2mol/L(pH7.4)磷酸緩沖溶液(PB)試劑為NaHfOo?2HoO和Na：HPO；-12比0。 0.2M的NalLPO,溶液：31.2gNalLPO,?2H：0,加蒸餡水lOOOmL溶解 0.2M的NazHPO,溶液：71.632gNaJlPO,-12比0加蒸憾水至1000ml溶解-一-0.2M(pH7.4)磷酸緩沖溶液(PB):19ml的NaHoPO,溶液和81ml的Na：HPO,溶液充分混合高壓滅菌，常溫保存。2、 0.03mol/L磷酸鹽緩沖溶液((PBS)試劑為NaCl和磷酸緩沖溶液PB 0.03MPBS溶液：22.8gNaCl,150ml磷酸緩沖溶液(PB),加蒸餡水至1000ml,混勻 0.02MPBS溶液:取100ml0.03MPBS溶液至150ml容量瓶中，加蒸餡水稀釋至150ml0.01MPBS溶液：取50ml0.03MPBS溶液至150ml容量瓶中，加蒸餡水稀釋至150ml高壓滅菌，常溫保存。3、 4%多聚甲醛溶液(1000ml)(在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行操作)----將略小于2/3體積的水(660ml)加熱到50°C, 40呂多聚甲醛pfa,邊攪拌邊加入到水中，繼續(xù)保持60°C 1滴2mol/LNaOH溶液，立即澄清，但仍有小顆粒。 1/3體積的PBS溶液，用氐1將尸11調(diào)至7.2，定容， 用孔徑為0.22Pm的濾膜過濾，一一4°C保存最多保存兩天，或者取少量保存在-20aC?(加熱時溫度不宜過高，為60°C-65°C,否則PFA容易降解，配置好后應(yīng)盡快使用，否則固定效果較差)。4、 lmol幾(pH8.O)Tris-HCl緩沖液的配置一-121.lgTris(三疑基氨基甲烷)，加800mL蒸憎水溶解，加入大約42mL的濃HC1-一用1M的HC1或1M的NaOH將pH調(diào)至8.0,最后加蒸憾水至1000M1高壓滅菌，4°C冰箱保存。5、 10%SDS—10gSDS(十二烷基硫酸鈉)于50ml火菌水中，加水至100ml，分裝后室溫保存?；鹁?，或用濾膜過濾

稱取SDS時需戴口罩！6、 0.5MEDTA（pH8.0）溶液的配置一一186.Ig乙二胺四乙酸二鈉加800mL蒸餡水溶解，劇烈攪拌（最好使用磁力攪拌機(jī)）用NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH至&0,然后定容至lOOOmLo7、 雜交緩沖液￡

152025100200300400500配置2ml雜交緩沖液于2ml離心管中，各試劑的加入順序：￡

152025100200300400500360uL5MNaCl：40uLlMTris—HC1xuL100%甲酰胺（見下表）yuL2uL無菌水（見下表）10%SDS0.22um孔徑的濾膜過濾，4°C保存甲酰胺濃度（％）甲酰胺體積X（UL）無菌水體積y（uL）001598J表1配置不同甲酰胺雜交液中甲酰胺和無菌水的體積1498139812981198109830600998*35700898.4080079845900698501000598LL口01100498（甲酰胺有劇毒，操作時需戴手套，在通風(fēng)處內(nèi)進(jìn)行，廢液需要回收）不同甲酰胺雜交液的配制甲酰胺濃度（%）5MNaCl溶液(mL)IMTris-HCl(mL)10%SDS(mL)甲酰胺體積x（mL）無菌水體積y（mL）207280.480239.6357280.4140179.6407280.4160159.6557280.422099.6 ]8、雜交后洗滌液的配置配制50mL雜交洗滌液于50mL離心管中，各試劑加入的順序如下:ZuL5MNaClImLlMTris-HCl（pH7.6）無菌水加至50mL50nL10%SDS

500uLEDTA表2 根據(jù)雜交緩沖液中甲酰胺濃度而左的探針清洗液液中NaCl體積數(shù)甲酰胺濃度％NaCl體積z(uL)NaCl最終濃度（mM）09000900JL6400640I104600上1532804603282022502252515901593011203580011280.405605645400405028028LL20020不同甲酰胺對應(yīng)的洗滌液的配制甲酰胺濃度（%）imTris-HCl 10%SDS（mL）0.5MEDTA5MNaCl溶液無菌水體積(mL)(mL)(mL)(mL)2080.4418369.63580.446.4381.24080.444.48383.125580.441.63869、 A9,6-diamidino-2-phenylindoldihydrochlorid（DAPI）常備：1mgHl-1需要稀釋為：1Pgh滅菌儲存在-20°C（用鋁箔覆蓋管子）DAPI可誘變致癌，所以在使用時要戴手套并且收集廢液，包括早使用移液管時。為了避免使用時對溶液造成污染，所有的溶液應(yīng)取出置于50ml管中，夠每天使用的量。三、實驗步驟：1、玻片的預(yù)處理：⑴玻片預(yù)處理1）玻片清洗：載玻片與蓋玻片用熱肥皂水刷洗干*爭，在實驗室可用超聲清洗代替刷洗（4?5次每次10min），然后用清水浸泡過夜；2）硅化處理:第二天換用1%的鹽酸浸泡24小時，然后用蒸餡水清洗干凈后放入高壓滅菌鍋火菌，60。C烘干。蓋玻片用錫紙包好TC保存?zhèn)溆?。（蓋玻片干凈即可不用處理）（2）黏附劑涂片制備載玻片放入APES與丙酮的1:50溶液（現(xiàn)配現(xiàn)用）中約lmin,取出用高壓滅菌處理過的蒸^留水清洗后于室溫下干燥（也町放入烘箱里25。C烘「），然后置4°C保存?zhèn)溆?、 熒光探針的選擇和標(biāo)記（見fish探針的選擇表）3、 樣品的制備與固定（1） 用已火菌的聚乙烯取樣管取反應(yīng)器內(nèi)泥水混合液ImL,加適量火菌蒸餡水振蕩混勻，并用超聲波處理使細(xì)菌分散。取處理后的懸濁液約0.5ml進(jìn)行后續(xù)處理。（2） 將懸濁液混合均勻后，按1：1加入4%多聚甲醛，于4°C固定24小時，（3） 然后置于12000r/min離心5min去除固定劑，將固定樣本加入lml0.01mol/LPBS以lOOOOr/min的速度離心漂洗兩次，棄去上清液。（4） 米用PBS與乙醇的1：1溶液稀釋泄容至lml于吃0°C保存?zhèn)溆?、 樣品的預(yù)處理（1） 用微型振蕩器將樣品混合均勻，取10口1樣品在載玻片上涂抹20mmX20mm大?。ú灰螅?，37C的烘箱熱固定2h,最高溫度不超過60°C（2） 風(fēng)干后于50%、80%、95%的乙醇中各脫水3min,自然風(fēng)干。（脫水:準(zhǔn)備三個瓷盤，然后將載玻片取出依次放入瓷盤中！50%乙醇淹沒裁玻片脫水3mim取出放入第二、三個瓷盤然后用80%乙割脫水96%乙醇脫水。脫水后魄0%、96倜乙醇回收。）脫水后的玻片可以在室溫下保存幾個月，可在-209的條件下保存幾個月5、 原位雜交探針濃度為50ng/LXL,在密閉的雜交盒內(nèi)鋪滿吸水紙（經(jīng)高壓火菌烘干），用雜交液濕潤，使雜交環(huán)境保持一龍的濕度。用移液槍分別取24UL的雜交液和1PL探針滴入帶有樣品的載玻片上（均勻覆蓋涂片而積），（加蓋硅化蓋玻片，不用）放入雜交盒內(nèi)進(jìn)行雜交反應(yīng)。雜交溫度與雜交時間如下。所有有關(guān)探出t的操作在處理時都應(yīng)避光處理！探針種類溫度（’C時間（h）甲酰胺濃度％備注EUBMIX46L20同步染色法AOBMIX46—355重復(fù)染色法NOBMIX46510重復(fù)染色法GAOMIX462.530同步染色法HGC69a462.530同步染色法PA0651462.530同步染色法6、 雜交后洗滌從恒溫箱中取出玻片之前將盛有清洗液的容器放入到48°C的水浴中預(yù)熱20分鐘。雜交完成后取出玻片，立即放入到預(yù)熱好的容器中。注意不能讓玻片干燥，不然將很難洗去非特異性結(jié)合的信號，增加背景染色。清洗液的量應(yīng)當(dāng)淹沒玻片，清洗1520分鐘后取出，用清水洗去剩余的清洗液，然后室溫下晾干。7、 DAPI染色每個玻片用10ULDAPI（用甲醇稀釋至lUg/UL）滴加到載玻片樣品上，在冰上染色lOmin,用水沖洗多次，室溫下自然晾干，鏡檢前加蓋蓋玻片。8、熒光顯微鏡觀察經(jīng)過以上處理的樣品，用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。探針目標(biāo)菌群探針序列甲酰胺濃度修飾EUB338DomainBacteriaGCTGCCTCCCGTAGGAGT20%HEXNS0190AmmoniaKoxidizingbacteriaCGATCCCCTGCTTTTCTCC55%HEXNIT3Nitrite^oxidizingbacteriaCCTGTGCTCCATGCTCCG40%FITCcNIT3bCCTGTGCTCCAGGCTCCGGAOQ989CompetibacterTTCCCCGGATGTCAAGGC35%Cy5?HGC69aActinobacteriaTATAGTTACCACCGCCGT25%FITCPA0651AccumulibacterCCCTCTGCCAAACTCCAG35%Cy3?DenitrifierCGGGAGGCAGCAGT35%FAM注：。探針濃度均為50ng/uL：bcNIT3為硝酸菌探針門T3的競爭探針。AbbreviationmaximumabsorptionMaximumemissionFiltersetFITC（綠色）492nm528nm10(Zeiss)DAPI（藍(lán)色）365nm418nm02(Zeiss)CY3（橙色/紅色）554nm570nm15(Zeiss)CY5（紅外線檢測）650nm667nm26(Zeiss)HEX探針的選用選用EUBMIX（EUB338.EUB338II、EUB338III）來檢測活性污泥中的全部的細(xì)菌匚選用PAOMIX來檢測活性污泥中的聚磷菌，選用AOBMIXNOBMIX來檢測活性污泥中的硝化菌。選用GAOMIX探針來檢測活性污泥中的聚糖菌，選用HGC69a探針來檢測反硝化聚磷菌的優(yōu)勢菌種Actinobacteria,用PA0651來檢測優(yōu)勢菌種Rhodocyclust雜交后用