雌激素對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞op-hbmscsich信號通路的影響

雌激素對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞op-hbmscsich信號通路的影響

骨質(zhì)疏松癥是一種以骨量少為特征的系統(tǒng)性疾病，骨的微觀結(jié)構(gòu)破壞，骨的脆弱增加，容易發(fā)生骨折。骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機制仍不明確。雌激素缺乏是絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的重要原因。相關(guān)研究表明,給予雌激素替代療法的絕經(jīng)后婦女,發(fā)生因骨質(zhì)疏松癥導(dǎo)致的骨折概率明顯下降。骨質(zhì)疏松癥患者骨髓中脂肪細(xì)胞和松質(zhì)骨的骨量呈反比,骨質(zhì)疏松癥可能是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化失衡后過多向脂肪細(xì)胞分化所致。前期研究表明,雌激素可以通過雌激素受體α或者激活Wnt/β-Catenin信號通路改善人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的能力。盡管如此,雌激素治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥以及調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的相關(guān)機制仍然不詳。Notch信號通路在細(xì)胞分化潛能、細(xì)胞自我更新能力以及凋亡過程中是一個高度保守的信號通路。目前對于雌激素與Notch信號通路的研究主要集中在人類腫瘤以及大腦發(fā)育的研究。人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分化過程中,雌激素是否仍然通過影響Notch信號通路對分化及增殖產(chǎn)生影響的研究相對缺乏。本研究通過觀察Notch信號通路在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及分化過程以及在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥發(fā)病過程中的作用,以期進(jìn)一步探討雌激素調(diào)控人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞功能的具體機制。材料和方法知情同意書的簽署本研究經(jīng)第四軍醫(yī)大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號:20110405-5),所有受試者(無感染性疾病、無血液系統(tǒng)疾病的健康志愿者和絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松骨折患者)均簽署知情同意書?；颊吖撬鑱碓礋o菌收集術(shù)中切除的椎骨骨髓;骨髓穿刺獲得的髂骨內(nèi)骨髓;長骨骨干骨折時干骺端的紅骨髓;髖關(guān)節(jié)置換術(shù)擴髓時的紅骨髓;髂骨移植手術(shù)時,患者髂骨松質(zhì)骨內(nèi)骨髓。本實驗所用骨髓分別來自4名健康女性骨髓穿刺的髂骨內(nèi)骨髓(年齡<35歲)和4名患有絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥并發(fā)生股骨頸骨折行髖關(guān)節(jié)置換術(shù)時所取的髂骨內(nèi)骨髓(年齡>75歲)。納入標(biāo)準(zhǔn):根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)的診斷標(biāo)準(zhǔn):絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者標(biāo)準(zhǔn):>65歲,T值<-2.5SD,血清鈣、磷、堿性磷酸酶,Ⅰ型膠原羧基末端肽,尿中鈣排泄率等檢查指標(biāo)排除繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥。健康女性標(biāo)準(zhǔn):<35歲,T值>-2SD,無骨折史。排除可能存在的骨代謝疾病,無服用可能影響骨骼或鈣磷代謝的藥物史。試劑與pcrFicoll細(xì)胞分離液、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素、β-甘油磷酸鈉、地塞米松、L-抗壞血酸、吲哚美辛、IBMX、胰島素、雌激素均購自美國Sigma公司;BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒購自上海碧云天生物公司;RNA提取試劑盒購自美國Omega公司;SYBRue5f8PrimeScriptTMRT-PCRKit購自日本Takara公司;iQ5RealTimePCRDetectionSystem為美國Bio-Rad公司;基因引物由上海生工生物公司合成。細(xì)胞培養(yǎng)液lm-2m采用密度梯度離心法進(jìn)行人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離。步驟如下:用20mL注射器吸取5~10mL髂骨松質(zhì)骨骨髓,用0.5mL稀釋的2500U/mL肝素鈉清洗注射器。將無菌肝素化骨髓5~10mL與等體積培養(yǎng)基于離心管內(nèi)充分混合,1000r/min離心5min。離心結(jié)束可見試管內(nèi)混合物分為3層,從上至下分別為脂肪層、血清層及血液沉積層。用吸管吸取脂肪層和血清層,將血液沉積層吸出后貼壁緩慢注入已預(yù)置等體積Ficoll細(xì)胞分離液的試管內(nèi),使兩者間形成清晰界面,2500r/min離心25min。用滴管抽出中間乳白色云霧狀單核細(xì)胞層,置于無菌離心管內(nèi),用PBS緩沖液充分漂洗(800r/min離心5min)3次,棄上清。重懸于加入含10%FBS及100U/mL青鏈霉素的DMEM-低糖培養(yǎng)液中,以6×103/cm2細(xì)胞密度接種于25cm2培養(yǎng)基。靜止置37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中,3d后全量換液,棄未貼壁細(xì)胞,以后每3d全量換液一次。待細(xì)胞匯合成單層后加入0.25%胰酶消化,按照1∶2比例進(jìn)行傳代接種培養(yǎng)(第一代,P1),待培養(yǎng)到P3代用于后續(xù)實驗。免疫組織化學(xué)法檢測細(xì)胞抗體檢測取第3代生長良好原代人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,用胰酶消化后,用PBS沖洗,離心。將細(xì)胞在離心管中重懸于100μLPBS中,每個離心管細(xì)胞數(shù)為106個。將細(xì)胞分為以下5組:空白對照組;1μLCD34-FITC組;CD44-FITC組;CD45-FITC組;CD105-鼠抗人異硫氰酸熒光素(fluoresceinisothiocyanate,FITC)進(jìn)行抗體染色組。將上述各組細(xì)胞4℃放置30min,用PBS沖洗一遍,離心,棄上清,加入1mLPBS重懸細(xì)胞行流式細(xì)胞分析。細(xì)胞分離、制備分別取健康女性與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松婦女P3骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,用0.25%胰酶常規(guī)消化細(xì)胞,離心收集細(xì)胞沉淀,重懸細(xì)胞,以104個/孔接種于96孔板中,隔日換液。在第1、2、3、4、5、6和7天取出96孔板,每孔加入MTT20μL,37℃孵育4h后,棄孔內(nèi)上清,每孔加入100μLDMSO,室溫下震蕩10min,使結(jié)晶完全溶解。在酶聯(lián)免疫分析儀上,選擇波長490nm測定吸光度值。細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)取絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者P3細(xì)胞,用0.25%胰酶常規(guī)消化細(xì)胞,離心收集細(xì)胞沉淀,重懸細(xì)胞,并以105個/孔的細(xì)胞密度接種于6孔板進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。隔日觀察細(xì)胞,待細(xì)胞生長融合至30%,將細(xì)胞置以下2種培養(yǎng)基:正常對照組(A),雌激素共培養(yǎng)組(17β-Estradiol,10-7mol/L)(B)。隔日更換相關(guān)培養(yǎng)基。培養(yǎng)7d后檢測Notch信號通路關(guān)鍵分子表達(dá)情況。細(xì)胞密度接種取P3細(xì)胞1瓶,用0.25%胰酶常規(guī)消化細(xì)胞,離心收集細(xì)胞沉淀,重懸細(xì)胞,并以105個/孔的細(xì)胞密度接種于6孔板進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。隔日觀察細(xì)胞,待細(xì)胞生長融合至60%,用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(地塞米松100nmol/L、L-抗壞血酸50mmol/L、β-甘油磷酸鈉10mmol/L)替代正常培養(yǎng)基,進(jìn)行成骨誘導(dǎo)。細(xì)胞密度接種取P3細(xì)胞1瓶,用0.25%胰酶常規(guī)消化細(xì)胞,離心收集細(xì)胞沉淀,重懸細(xì)胞,并以105個/孔的細(xì)胞密度接種于6孔板進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。隔日觀察細(xì)胞,待細(xì)胞生長融合至60%,用成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基(吲哚美辛200μmol/L、IBMX0.05mmol/L、胰島素10μg、地塞米松1μmol/L)替代正常的培養(yǎng)基,進(jìn)行成脂誘導(dǎo)。堿性磷酸酯酶顯色法細(xì)胞成骨誘導(dǎo)7d后,PBS沖洗3遍,4℃多聚甲醛固定30min,PBS洗3遍,每次5min,用BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒進(jìn)行堿性磷酸酶顯色。按試劑盒說明書配制染色液。PBS洗后,加入適量已配制好的BCIP/NBT染色液,以剛好可以鋪蓋細(xì)胞表面為準(zhǔn)。37℃避光保存30min。去除BCIP/NBT染色液,用PBS清洗3遍終止染色,拍照觀察。細(xì)胞表面鋪蓋細(xì)胞成脂誘導(dǎo)10d后,PBS沖洗3遍,4℃多聚甲醛固定30min,PBS再洗3遍,每次5min。按照油紅∶去離子水=3∶2的比例稀釋油紅儲存液,濾紙過濾,室溫放置10min。將稀釋好的油紅染色液加入培養(yǎng)板,以剛好可以鋪蓋細(xì)胞表面為準(zhǔn)。室溫保存15min后,用蒸餾水清洗3遍終止消化,顯微鏡下觀察并拍照。-ctrt-pcr方法的開發(fā)采用SYBRGreenⅠ進(jìn)行相對定量分析基因表達(dá),實驗按照2-ΔΔCt解析法進(jìn)行設(shè)計,引物由上海生工生物工程公司合成,引物見表1,實時定量PCR反應(yīng)體系見表2,實時定量PCR反應(yīng)程序見表3,采用2-ΔΔCt值法對于RT-PCR結(jié)果進(jìn)行分析。anoa分析采用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)分析軟件進(jìn)行ANOVA分析。采用獨立樣本t檢驗,數(shù)據(jù)用ue0af±s表示,P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果胞型成纖維細(xì)胞形態(tài)采用密度梯度離心法分別培養(yǎng)健康女性及絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞?？梢娊】蹬怨撬栝g充質(zhì)干細(xì)胞為典型成纖維細(xì)胞形態(tài),呈紡錘形,細(xì)胞密度較大,呈集落樣生長,邊緣清楚。而絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松組來源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)寬大扁平,呈單個樣生長,形態(tài)不規(guī)則,分散生長,細(xì)胞數(shù)量少(圖1)。MTT結(jié)果顯示絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖能力較低(P<0.01)(圖2)。alp染色及油紅o染色的誘導(dǎo)成骨、成脂方向分化將第3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)7d、成脂誘導(dǎo)10d后分別進(jìn)行ALP染色及油紅O染色,發(fā)現(xiàn)其誘導(dǎo)成骨、成脂方向分化(圖3)。流式細(xì)胞術(shù)鑒定根據(jù)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記分子表達(dá)分別為CD34(-)、CD45(-)、CD44(+)、CD105(+)的特征,采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分子表型鑒定的結(jié)果表明,培養(yǎng)細(xì)胞骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞CD44、CD105陽性率>95%;CD34、CD45陽性率<5%(圖4)。兩組etch信號通路關(guān)鍵分子表達(dá)水平比較絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者h(yuǎn)BMSCs中Notch信號通路關(guān)鍵分子表達(dá)水平較正常組降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01,n=4)(圖5)。治療骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中etp信號通路活性的變化對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞給予雌激素刺激,與未給與雌激素刺激的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相比,發(fā)現(xiàn)前者Notch信號通路活性增加(圖6)。即雌激素可升高絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中減弱的Notch信號通路活性。髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化前后etch信號通路活性的變化在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞處于未分化狀態(tài)時,雌激素可提高Notch信號通路活性。在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化的關(guān)鍵時間點(3、7、14d),在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化以及成脂分化成熟的過程中,雌激素刺激組與未給與雌激素刺激組相比,發(fā)現(xiàn)Notch信號通路活性均增高(圖7、8)。激素對小鼠血清中酸性磷酸酶的影響將絕經(jīng)后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與雌激素共培養(yǎng),在成骨誘導(dǎo)7d時進(jìn)行堿性磷酸酶染色,可見雌激素刺激組堿性磷酸酶染色較深,堿性磷酸酶密度較大;成脂誘導(dǎo)第8天進(jìn)行油紅O染色,可見雌激素刺激組脂滴染色較淺,密度較低。根據(jù)以上結(jié)果表明雌激素可促進(jìn)絕經(jīng)后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化,但抑制成脂分化(圖9)。引導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞激活作用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有多向分化的能力,通過成骨誘導(dǎo)和成脂誘導(dǎo)及ALP和油紅O染色均可證明其分化潛能。本研究根據(jù)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面表達(dá)黏附分子CD44和CD105,不表達(dá)存在于造血干細(xì)胞前體的CD34和CD45的特性,采用流式細(xì)胞儀對分離細(xì)胞進(jìn)行鑒定,證實可培養(yǎng)出純度較高的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。Notch1信號通路在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元細(xì)胞中發(fā)揮重要作用。有文獻(xiàn)報道Notch1介導(dǎo)的信號通路是決定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化潛能的重要影響因素。本實驗比較了絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥與健康女性骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞Notch1信號通路關(guān)鍵信號分子Notch1、Jagged1和Hes1的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)上述關(guān)鍵信號分子在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的表達(dá)明顯低于正常組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。已有文獻(xiàn)報道,骨質(zhì)疏松患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖能力和分化能力均有所降低,本實驗結(jié)果與其一致。由此推測,Notch信號通路的減弱與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞減弱增殖能力及分化能力有關(guān),可能是導(dǎo)致絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者骨量降低的原因之一。本實驗證實,雌激素可以逆轉(zhuǎn)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞已減弱的Notch信號通路關(guān)鍵分子的表達(dá),使用雌激素干預(yù)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后,受體Notch1與配體Jagged1表達(dá)均升高,Hes1也顯著升高。提示雌激素與Notch信號通路間可能存在一定聯(lián)系。在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨、成脂分化過程中給予雌激素刺激,發(fā)現(xiàn)在成骨分化的早期以及成脂分化的過程中,Notch信號通路關(guān)鍵分子表達(dá)較未給予雌激素刺激組均增高。圖7表明,在