三聚氰胺致大鼠腎毒性的機制及病變特點

三聚氰胺致大鼠腎毒性的機制及病變特點

三聚氰胺是一種白色的傾斜晶，略微溶于水。大鼠的ld50為3.16g/kg，屬于低毒物質(zhì)。目前研究認為同時給予三聚氰胺和三聚氰酸喂飼動物可在腎臟形成晶體并導(dǎo)致急性腎衰竭。本課題之前已對有關(guān)三聚氰胺致大鼠腎損傷模型進行了研究。已證實單獨給予三聚氰胺亦可在腎臟形成晶體致大鼠腎衰竭。但對于晶體在體內(nèi)形成的過程及導(dǎo)致腎衰機制不明確。本研究旨在探討三聚氰胺致大鼠腎損傷發(fā)生機制。1材料和方法1.1大鼠的分組和毒種>4周齡清潔級Wistar大鼠,體重(80±10)g,由吉林大學(xué)實驗動物中心提供,許可證號:SCXK(吉)2003-0001。將大鼠隨機分為染毒組和對照組,每組20只,雌雄各半。屏障環(huán)境飼養(yǎng),動物房許可證號:SYXK(黑)2006-008[(溫度(24±2)℃,濕度(45±10)%]。1.2實驗儀器和試劑日立7080型全自動生化分析儀,TSQQuantumDiscoveryMAX(Thermo公司),X’PertPro型X射線衍射儀(帕納科公司)。摻入飼料的三聚氰胺為化學(xué)純(含量≥99%,國藥集團化學(xué)試劑有限公司)。液相色譜-質(zhì)譜分析用三聚氰胺、三聚氰酸對照品由中國計量科學(xué)研究院提供。1.3方法1.3.1小鼠肝腎組織病理學(xué)檢查飼料中三聚氰氨含量為250mg/kg,攝食量以10%體重計算,三聚氰胺染毒組每日染毒劑量為25mg/kg。對照組喂飼相同飼料但不加三聚氰胺。動物染毒第21天用代謝籠收集尿液,記錄24h尿量。4周后取血清進行生化檢測,剖檢動物腎臟進行大體觀察;徒手切片,解剖鏡下觀察形態(tài)學(xué)改變。以甲醛固定腎臟,常規(guī)制片,HE染色,進行組織病理學(xué)檢查。稱重腎臟,計算腎/體比值。1.3.2三聚氰胺和三聚氰酸的定量檢測取腎臟,加蒸餾水,制備勻漿,加乙腈超聲提取,以液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測三聚氰胺、三聚氰酸含量。1.3.3勻漿、干燥分別取三聚氰胺染毒組及對照組腎臟,制備勻漿,離心,干燥;分別配制三聚氰胺和三聚氰酸溶液,混合后瞬間混濁,離心,干燥,得到體外合成的三聚氰胺-三聚氰酸晶體。1.3.3.2x射線衍射儀的檢測1.4統(tǒng)計分析采用STATA8.0軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以表示。根據(jù)數(shù)據(jù)的正態(tài)性和方差齊性,選擇單因素方差分析比較兩組間差別。2結(jié)果2.1兩組體重、腎/體比值比較喂飼含三聚氰胺飼料3周左右,動物出現(xiàn)食欲下降,體重增長緩慢,少動,多尿。體重增長低于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);腎臟絕對重量和腎/體比值均顯著增加,與對照組比較,有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。第21天24h尿量與對照組比較,顯著增多,有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),見表1。2.2組三酯水平比較三聚氰胺染毒組血清尿素氮、肌酐和甘油三酯水平顯著升高,與對照組比較,有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。雄鼠高于雌鼠,有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),見表2。2.3兩組患者的血壓比較見表1肉眼可見雙腎臟明顯腫脹增大,呈土黃色沙石樣外觀(封三圖1),與對照組明顯不同。于解剖鏡下觀察新鮮腎臟冠狀切面約0.5mm切片,可見腎皮質(zhì)、髓質(zhì)彌漫分布的點片狀陰影(封三圖2A),與對照組比較明顯不同(封三圖2B)。2.4腎組織中皮細胞的破碎或形態(tài)擴張三聚氰胺組腎組織鏡下可見直徑不等的圓形晶體,間質(zhì)纖維增生,間質(zhì)細胞增多(封三圖3A)。結(jié)晶體單獨或積聚或呈扇形、楔形不規(guī)則碎片出現(xiàn)于腎小管中(封三圖3B)。并可見高度擴張的腎小管中的晶體周圍伴有壞死脫落的小管上皮細胞碎片及炎細胞(封三圖3C)。對照組腎小管上皮完整,管腔內(nèi)未見晶體及炎細胞(封三圖3D)。2.5三聚氰胺-三聚氰酸水溶液的質(zhì)量分析和定量檢測腎組織三聚氰胺含量為82μg/g(圖4A),三聚氰酸的含量為69μg/g(圖4B)。2.6顯微鏡下外晶體合成的結(jié)果體外合成的三聚氰胺-三聚氰酸晶體為針狀晶體(封三圖5)。2.7x射線檢測法對照組樣品為典型的非晶態(tài)結(jié)構(gòu),X射線衍射角在12°~32°之間有一寬的漫散峰,三聚氰胺組樣品在相同的位置也存在著漫散峰。三聚氰胺組樣品和體外合成的樣品三強峰的位置基本吻合,故經(jīng)X射線檢測可初步判定,體內(nèi)形成的晶體與體外合成的晶體結(jié)構(gòu)相同。由此可確定,三聚氰胺組動物腎臟中的晶體為三聚氰胺-三聚氰酸結(jié)合晶體(封三圖6)。3聚氰胺和三聚氰酸對肝腎的影響本研究給予大鼠喂飼含有250mg/kg三聚氰胺的飼料后,大鼠出現(xiàn)食量減少,體重增長緩慢、少動、多尿等異常表現(xiàn),血清尿素氮、肌酐和甘油三酯等生化指標(biāo)異常增高,表明動物出現(xiàn)腎功能衰竭。剖檢腎臟,肉眼觀察發(fā)生明顯病變。解剖鏡下腎組織中可見彌漫性分布的點片狀陰影,經(jīng)組織病理學(xué)檢查及液相色譜-質(zhì)譜檢測,證實其為存在于腎小管、腎盞和腎盂中的三聚氰胺-三聚氰酸結(jié)合晶體。由于腎臟存在大量結(jié)合晶體,腎小管高度擴張,致使腎臟血液供應(yīng)減少,導(dǎo)致腎體積增大,重量增加,呈特征性土黃色沙石樣外觀。分析三聚氰酸是由三聚氰胺在體內(nèi)水解而來。推測可能機制是三聚氰胺在胃內(nèi)由胃酸催化,部分水解生成三聚氰酸。兩者入血后隨血循環(huán)到腎臟,流經(jīng)腎小管時由于腎小管重吸收作用使其濃縮,血液經(jīng)濾過、重吸收形成終尿的過程約經(jīng)1000倍濃縮,使腎小管內(nèi)的三聚氰胺和三聚氰酸至飽和狀態(tài),達到結(jié)晶條件而形成結(jié)晶體留存于腎小管中。顯微鏡下所見體外合成的三聚氰胺-三聚氰酸晶體為針狀晶體(封三圖5),與腎小管中所見晶體形狀完全不同,可解釋為晶體的同質(zhì)多晶現(xiàn)象。兩者形成的環(huán)境條件不同,體內(nèi)的晶體是在腎小管中形成,腎小管管狀界面決定了晶體的形狀。由于腎小管直徑不同,所形成的晶體直徑亦不同。所以同一視野中見到的是直徑不等、具有相同結(jié)構(gòu)的圓形晶體(封三圖3A),組織病理學(xué)檢查可見存在于腎小管中的晶體使腎小管高度擴張,晶體周圍可見破壞脫落的上皮細胞和炎細胞形成的顆粒管型,表明腎小管上皮嚴(yán)重受損。晶體的阻塞和腎小管的病理損傷致腎小管重吸收功能障礙,表現(xiàn)為多尿、腎功能異常,最終致腎功能衰竭。由此可認為腎小管內(nèi)結(jié)晶體的阻塞和腎小管上皮的損傷是導(dǎo)致腎功能衰竭的直接原因。Brown等于2004年到2007年喂飼貓和犬含有三聚氰胺的飼料并發(fā)生腎功能衰竭的回顧性研究顯示,貓和犬腎臟中可見晶體。本研究中,大鼠腎臟中的晶體形狀與Brown等研究中所見晶體基本相同,由此可以認為,不同種屬動物攝食含一定量三聚氰胺的飼料均可在腎臟形成晶體,導(dǎo)致腎功能衰竭。并不因代謝方式不同而不同。因為三聚氰胺和三聚氰酸并不