酶聯(lián)免疫吸附測定法課件

復(fù)雜生物體系中生命物質(zhì)的化學(xué)測量是揭示生命奧秘的重要手段，在食品檢驗、疾病診斷和預(yù)防的過程中也日益凸現(xiàn)其重要作用。

經(jīng)典的化學(xué)分析方法（滴定分析、重量分析、簡單的吸光光度法）是以簡單離子或分子為檢測對象的常量或微量分析，面對生物體系成分復(fù)雜且待測物濃度較低的測試條件則往往無能為力。

于是，一系列針對生物體系中化學(xué)成分的測量方法應(yīng)運而生。免疫化學(xué)分析即其重要成員，它將免疫學(xué)知識與化學(xué)分析手段有機(jī)結(jié)合，為生命體系中高特異性、超微量的分析提供了解決方法。復(fù)雜生物體系中生命物質(zhì)的化學(xué)測量是揭示生命奧秘的重要1

什么是酶聯(lián)免疫分析技術(shù)

ELISA的基本原理和方法ELISA的種類和變化ELISA的特點

ELISA的應(yīng)用實例什么是酶聯(lián)免疫分析技術(shù)ELISA的基本原理和方法EL2

1971年瑞典學(xué)者Engvail和Perlmann,荷蘭學(xué)者VanWeerman和Schuurs分別報道將免疫技術(shù)發(fā)展為檢測體液中微量物質(zhì)的固相免疫測定方法，即酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)。ELISA現(xiàn)在已成為目前分析化學(xué)領(lǐng)域中的前沿課題，它是一種特殊的試劑分析方法，是在免疫酶技術(shù)(immunoenzymatictechniques)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型的免疫測定技術(shù)。

1971年瑞典學(xué)者Engvail和Perlma3一、基本原理它采用抗原與抗體的特異反應(yīng)將待測物與酶連接，然后通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，用于定量測定。測定的對象可以是抗體也可以是抗原。在這種測定方法中有3種必要的試劑：①固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）②酶標(biāo)記的抗原或抗體（標(biāo)記物）③酶作用的底物（顯色劑）一、基本原理在這種測定方法中有3種必要的試劑：4

測量時，抗原（抗體）先結(jié)合在固相載體上，但仍保留其免疫活性，然后加一種抗體（抗原）與酶結(jié)合成的偶聯(lián)物（標(biāo)記物），此偶聯(lián)物仍保留其原免疫活性與酶活性，當(dāng)偶聯(lián)物與固相載體上的抗原（抗體）反應(yīng)結(jié)合后，再加上酶的相應(yīng)底物，即起催化水解或氧化還原反應(yīng)而呈顏色。測量時，抗原（抗體）先結(jié)合在固相載體上，但仍保留其免5

其所生成的顏色深淺與欲測的抗原（抗體）含量成正比。

這種有色產(chǎn)物可用肉眼、光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡觀察，也可以用分光光度計（酶標(biāo)儀）加以測定。

其方法簡單，方便訊速，特異性強。其所生成的顏色深淺與欲測的抗原（抗體）含量成正比。6二、酶及其底物酶結(jié)合物是酶與抗體或抗原,半抗原在交聯(lián)劑作用下聯(lián)結(jié)的產(chǎn)物。是ELISA成敗的關(guān)鍵試劑，它不僅具有抗體抗原特異的免疫反應(yīng)，還具有酶促反應(yīng)，顯示出生物放大作用，但不同的酶選用不同的底物，將得到不同的顏色反應(yīng).二、酶及其底物7酶底物顯色反應(yīng)

測定波長

辣根過氧化物酶鄰苯二胺

四甲替聯(lián)苯胺

氨基水楊酸

鄰聯(lián)苯甲胺

2,2‘-連胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)銨鹽

橘紅色

黃色

棕色

蘭色

藍(lán)綠色492460449

425

642

堿性磷酸酯酶

4-硝基酚磷酸鹽(PNP)

萘酚-AS-Mx磷酸鹽+重氮鹽黃色

紅色400

500葡萄糖氧化酶

ABTS+HRP+葡萄糖

葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑蘭黃色

深藍(lán)色405420β-Ｄ－半乳糖苷酶

甲基傘酮基半乳糖苷(4MuG)

硝基酚半乳糖苷(ONPG)熒光

黃色

360,450

420

酶底物顯色反應(yīng)測定波長辣根過氧化物酶鄰苯二胺

四甲8ELISA的種類和變化

（一）雙抗體夾心法（二）間接法（三）競爭法（四）雙位點一步法（五）捕獲法測IgM抗體（六）應(yīng)用親和素和生物素的ELISA

ELISA的種類和變化（一）雙抗體夾心法9（一）雙抗體夾心法此法適用于檢驗各種蛋白質(zhì)等大分子抗原（一）雙抗體夾心法此法適用于檢驗各種蛋白質(zhì)等大分子抗原10獲得待分析物的未標(biāo)定抗體將特異性抗體與固相載體連接形成固相抗體洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)加入封閉蛋白溶液以封閉載體表面殘留的蛋白結(jié)合位點洗滌并除去未結(jié)合的封閉蛋白加受檢標(biāo)本（抗原）形成固相抗體－抗原復(fù)合物洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì)加酶標(biāo)抗體生成抗體—待測抗原—酶標(biāo)記抗體的復(fù)合物徹底洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體加底物進(jìn)行酶催化反應(yīng)根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量測定獲得待分析物的未標(biāo)定抗體將特異性抗體與固相洗滌除去未結(jié)合的加11449

425

6424-硝基酚磷酸鹽(PNP)

萘酚-AS-Mx磷酸鹽+重氮鹽飼料中鹽酸克倫特羅的測定ABTS+HRP+葡萄糖

葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑蘭眾所周知,酶是一種有機(jī)催化劑，很少量的酶即可誘導(dǎo)大量的催化反應(yīng)，產(chǎn)生可供觀察的顯色反應(yīng)現(xiàn)象。②酶標(biāo)記的抗原或抗體（標(biāo)記物）草不綠（Alachor）、①固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）這種有色產(chǎn)物可用肉眼、光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡觀察，也可以用分光光度計（酶標(biāo)儀）加以測定。360,450

420因此該體系常被稱為酶放大體系。因此該體系常被稱為酶放大體系。分別測定兩管的吸光度值，加入封閉蛋白溶液以封閉載體再加上酶的相應(yīng)底物，即起催化水解或氧化還原反應(yīng)而呈顏色。它采用抗原與抗體的特異反應(yīng)將待測物與酶連接，然后通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，用于定量測定。對照管由于只加酶標(biāo)抗原，與固相抗體充分結(jié)合，故分解底物顯色深；免疫化學(xué)分析即其重要成員，它將免疫學(xué)知識與化學(xué)分析手段有機(jī)結(jié)合，為生命體系中高特異性、超微量的分析提供了解決方法。360,450

420表面殘留的蛋白結(jié)合位點

間接法是檢測抗體最常用的方法，其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體以檢測已與固相結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。（二）間接法449

425

642間接法是檢測抗體最常用的方法，其12包被固相載體:用已知抗原包被固相載體加待檢標(biāo)本:使相應(yīng)抗體與固相抗原結(jié)合洗滌，除去無關(guān)的物質(zhì)加酶標(biāo)抗抗體:與固相載體上抗原抗體復(fù)合物結(jié)合；洗滌，除去未結(jié)合的酶標(biāo)抗抗體加底物顯色根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量測定包被固相載體:加待檢標(biāo)本:加酶標(biāo)抗抗體:加底物根據(jù)顏色反13（三）競爭法

此法可用于抗原和半抗原的定量測定，也可用于測定抗體。（三）競爭法此法可用于抗原和半抗原的定量測定，14用已知特異性抗體包被固相載體測定管加待測抗原和一定量的酶標(biāo)抗原使二者與固相抗體競爭結(jié)合對照管只加一定量酶標(biāo)抗原與固相抗體直接結(jié)合分別洗滌除去未結(jié)合的成分加底物顯色分別測定兩管的吸光度值，根據(jù)對照管與測定管吸光度值之比，計算標(biāo)本中待測抗原含量用已知特異性測定管加待測抗原和對照管只加一定量酶標(biāo)抗原分別洗15

對照管由于只加酶標(biāo)抗原，與固相抗體充分結(jié)合，故分解底物顯色深；測定管的顯色程度則隨待測抗原和酶標(biāo)抗原與固相抗體競爭結(jié)合的結(jié)果而異。如待測抗原量多，競爭性地抑制酶標(biāo)抗原與固相抗體結(jié)合，使固相上結(jié)合的酶標(biāo)抗原量減少。因此，加入底物后顯色反應(yīng)較弱。對照管由于只加酶標(biāo)抗原，與固相抗體充分結(jié)合，故分解底16特點一：靈敏性該測定法的靈敏度來自作為報告集團(tuán)的酶。眾所周知,酶是一種有機(jī)催化劑，很少量的酶即可誘導(dǎo)大量的催化反應(yīng)，產(chǎn)生可供觀察的顯色反應(yīng)現(xiàn)象。因此該體系常被稱為酶放大體系。ELISA實現(xiàn)了在細(xì)胞或亞細(xì)胞水平上示蹤抗原或抗體的所在部位，或在微克、甚至納克水平上對其進(jìn)行定量。例如，在測定血清中某一物質(zhì)的含量時，化學(xué)比色法的敏感度為mg/ml水平，酶反應(yīng)測定法的敏感度約為5~10μg/ml。

特點一：靈敏性17特點二：特異性其特異性來自抗體或抗原的選擇性。抗原抗體的結(jié)合實質(zhì)上只發(fā)生在抗原的抗原決定簇與抗體的抗原結(jié)合位點之間。由于兩者在化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型上呈互補關(guān)系，所以抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性。

特點二：特異性18

例如乙肝病毒中的表面抗原（HBsAg）、e抗原（HBeAg）和核心抗體（HBcAg），雖來源于同一病毒，但僅與其相應(yīng)的抗體結(jié)合，而不與另外兩種抗體反應(yīng)?？乖贵w反應(yīng)的這種特異性使免疫測定能在一非常復(fù)雜的蛋白質(zhì)化合物（例如血清）中測定某一特定的物質(zhì)，而不需先分離待檢物。例如乙肝病毒中的表面抗原（HBsAg）、e抗原（HB19ELISA應(yīng)用實例ELISA應(yīng)用實例20

飼料中鹽酸克倫特羅的測定飼料中毒素的測定（主要包括黃曲霉毒素，簡曲霉毒素）飼料中有害微生物的快速篩檢（如沙門氏菌）

甲胺磷殘留分析甲基對硫磷殘留分析呋喃丹殘留分析ELISA在飼料安全檢測中的應(yīng)用ELISA用于農(nóng)藥殘留的檢測飼料中鹽酸克倫特羅的測定甲胺磷殘留分析ELISA在飼料21河豚毒素

植物毒素如罌粟鹼、嗎啡、藻類毒素苯并芘

主要有除草劑與殺蟲劑兩大類例如殺暝松（FN）、甲氟磷酸異已酶（SOMAN）、草不綠（Alachor）、西維因（Carbaryl）、多菌靈及克菌丹（Captan）等。農(nóng)藥的檢測：河豚毒素植物毒素如罌粟鹼、嗎啡、藻類毒素苯并芘主要有除22此法適用于檢驗各種蛋白質(zhì)等大分子抗原洗滌并除去未結(jié)合的封閉蛋白4-硝基酚磷酸鹽(PNP)

萘酚-AS-Mx磷酸鹽+重氮鹽獲得待分析物的未標(biāo)定抗體（五）捕獲法測IgM抗體例如，在測定血清中某一物質(zhì)的含量時，化學(xué)比色法的敏感度為mg/ml水平，酶反應(yīng)測定法的敏感度約為5~10μg/ml。其方法簡單，方便訊速，特異性強。因此，加入底物后顯色反應(yīng)較弱。這種有色產(chǎn)物可用肉眼、光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡觀察，也可以用分光光度計（酶標(biāo)儀）加以測定?？贵w—待測抗原—酶標(biāo)記抗體①固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）例如殺暝松（FN）、表面殘留的蛋白結(jié)合位點于是，一系列針對生物體系中化學(xué)成分的測量方法應(yīng)運而生。表面殘留的蛋白結(jié)合位點甲基傘酮基半乳糖苷(4MuG)

硝基酚半乳糖苷(ONPG)間接法是檢測抗體最常用的方法，其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體以檢測已與固相結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。甲氟磷酸異已酶（SOMAN）、ELISA試劑盒商業(yè)資訊西維因（Carbaryl）、ELISA檢測“非典型肺炎”冠狀病毒ELISA在結(jié)締組織病早期診斷中的應(yīng)用檢測抗異質(zhì)性胞核核糖蛋白A2（hnRNPA2）/類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（PtA）33抗體ELISA在疾病診斷中的作用ELISA法檢測幽門螺桿菌抗體此法適用于檢驗各種蛋白質(zhì)等大分子抗原ELISA檢測“非典23ELISA試劑盒商業(yè)資訊ELISA試劑盒商業(yè)資訊24ELISA試劑盒ELISA試劑盒25酶聯(lián)免疫吸附測定法課件26酶聯(lián)免疫井酶聯(lián)免疫井27DNM-9602G酶標(biāo)分析儀DNM-9602標(biāo)配酶標(biāo)分析儀

DNM-9602A酶標(biāo)分析儀幾種酶標(biāo)分析儀DNM-9602G酶標(biāo)分析儀DNM-9602標(biāo)配酶標(biāo)分析儀28參考文獻(xiàn)：《生物體系中的化學(xué)測量》Kentk.StewartRichardE.EBEL著

生命經(jīng)緯普通免疫學(xué)課程參考文獻(xiàn)：29謝謝大家謝謝大家30酶底物顯色反應(yīng)

測定波長

辣根過氧化物酶鄰苯二胺

四甲替聯(lián)苯胺

氨基水楊酸

鄰聯(lián)苯甲胺

2,2‘-連胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)銨鹽

橘紅色

黃色

棕色

蘭色

藍(lán)綠色492460449

425

642

堿性磷酸酯酶

4-硝基酚磷酸鹽(PNP)

萘酚-AS-Mx磷酸鹽+重氮鹽黃色

紅色400

500葡萄糖氧化酶

ABTS+HRP+葡萄糖

葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑蘭黃色

深藍(lán)色405420β-Ｄ－半乳糖苷酶

甲基傘酮基半乳糖苷(4MuG)

硝基酚半乳糖苷(ONPG)熒光

黃色

360,450

420

酶底物顯色反應(yīng)測定波長辣根過氧化物酶鄰苯二胺

四甲31ELISA的種類和變化

（一）雙抗體夾心法（二）間接法（三）競爭法（四）雙位點一步法（五）捕獲法測IgM抗體（六）應(yīng)用親和素和生物素的ELISA

ELISA的種類和變化（一）雙抗體夾心法32獲得待分析物的未標(biāo)定抗體將特異性抗體與固相載體連接形成固相抗體洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)加入封閉蛋白溶液以封閉載體表面殘留的蛋白結(jié)合位點洗滌并除去未結(jié)合的封閉蛋白加受檢標(biāo)本（抗原）形成固相抗體－抗原復(fù)合物洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì)加酶標(biāo)抗體生成抗體—待測抗原—酶標(biāo)記抗體的復(fù)合物徹底洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體加底物進(jìn)行酶催化反應(yīng)根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量測定獲得待分析物的未標(biāo)定抗體將特異性抗體與固相洗滌除去未結(jié)合的加33特點一：靈敏性該測定法的靈敏度來自作為報告集團(tuán)的酶。眾所周知,酶是一種有機(jī)催化劑，很少量的酶即可誘導(dǎo)大量的催化反應(yīng)，產(chǎn)生可供觀察的顯色反應(yīng)現(xiàn)象。因此該體系常被稱為酶放大體系。ELISA實現(xiàn)了在細(xì)胞或亞細(xì)胞水平上示蹤抗原或抗體的所在部位，或在微克、甚至納克水平上對其進(jìn)行定量。例如，在測定血清中某一物質(zhì)的含量時，化學(xué)比色法的敏感度為mg/ml水平，酶反應(yīng)測定法的敏感度約為5~10μg/ml。

特點一：靈敏性34河豚毒素

植物毒素如罌粟鹼、嗎啡、藻類毒素苯并芘

主要有除草劑與殺蟲劑兩大類例如殺暝松（FN）、甲氟磷酸異已酶（SOMAN）、草不綠（Alachor）、西維因（Carbaryl）、多菌靈及克菌丹（Captan）等。農(nóng)藥的檢測：河豚毒素植物毒素如罌粟鹼、嗎啡、藻類毒素苯并芘主要有除35在這種測定方法中有3種必要的試劑：360,450

420分別測定兩管的吸光度值，洗滌并除去未結(jié)合的封閉蛋白甲基傘酮基半乳糖苷(4MuG)

硝基酚半乳糖苷(ONPG)（六）應(yīng)用親和素和生物素的ELISAStewartRichardE.經(jīng)典的化學(xué)分析方法（滴定分析、重量分析、簡單的吸光光度法）是以簡單離子或分子為檢測對象的常量或微量分析，面對生物體系成分復(fù)雜且待測物濃度較低的測試條件則往往無能為力。眾所周知,酶是一種有機(jī)催化劑，很少量的酶即可誘導(dǎo)大量的催化反應(yīng)，產(chǎn)生可供觀察的顯色反應(yīng)現(xiàn)象。草不綠（Alachor）、經(jīng)典的化學(xué)分析方法（滴定分析、重量分析、簡單的吸光光度法）是以簡單離子或分子為檢測對象的常量或微量分析，面對生物體系成分復(fù)雜且待測物濃度較低的測試條件則往往無能為力。ELISA的基本原理和方法再加上酶的相應(yīng)底物，即起催化水解或氧化還原反應(yīng)而呈顏色。橘紅色

黃色

棕色

蘭色

藍(lán)綠色此法可用于抗原和半抗原的定量測定，也可用于測定抗體。橘紅色

黃色

棕色

蘭色

藍(lán)綠色360,450

420洗滌并除去未結(jié)合的封閉蛋白其方法簡單，方便訊速，特異性強。甲氟磷酸異已酶（SOMAN）、這種有色產(chǎn)物可用肉眼、光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡觀察，也可以用分光光度計（酶標(biāo)儀）加以測定。眾所周知,酶是一種有機(jī)催化劑，很少量的酶即可誘導(dǎo)大量的催化反應(yīng)，產(chǎn)生可供觀察的顯色反應(yīng)現(xiàn)象。橘紅色

黃色

棕色

蘭色

藍(lán)綠色加入封閉蛋白溶液以封閉載體例如殺暝松（FN）、免疫化學(xué)分析即其重要成員，它將免疫學(xué)知識與化學(xué)分析手段有機(jī)結(jié)合，為生命體系中高特異性、超微量的分析提供了解決方法。此法可用于抗原和半抗原的定量測定，也可用于測定抗體。ELISA的種類和變化酶結(jié)合物是酶與抗體或抗原,半抗原在交聯(lián)劑作用下聯(lián)結(jié)的產(chǎn)物。眾所周知,酶是一種有機(jī)催化劑，很少量的酶即可誘導(dǎo)大量的催化反應(yīng)，產(chǎn)生可供觀察的顯色反應(yīng)現(xiàn)象。4-硝基酚磷酸鹽(PNP)

萘酚-AS-Mx磷酸鹽+重氮鹽其方法簡單，方便訊速，特異性強。4-硝基酚磷酸鹽(PNP)

萘酚-AS-Mx磷酸鹽+重氮鹽植物毒素如罌粟鹼、嗎啡、藻類毒素ELISA的基本原理和方法加入封閉蛋白溶液以封閉載體其方法簡單，方便訊速，特異性強。因此該體系常被稱為酶放大體系。ELISA的種類和變化4-硝基酚磷酸鹽(PNP)

萘酚-AS-Mx磷酸鹽+重氮鹽表面殘留的蛋白結(jié)合位點什么是酶聯(lián)免疫分析技術(shù)例如，在測定血清中某一物質(zhì)的含量時，化學(xué)比色法的敏感度為mg/ml水平，酶反應(yīng)測定法的敏感度約為5~10μg/ml。鄰苯二胺

四甲替聯(lián)苯胺

氨基水楊酸

鄰聯(lián)苯甲胺

2,2‘-連胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)銨鹽于是，一系列針對生物體系中化學(xué)成分的測量方法應(yīng)運而生。固相抗體－抗原復(fù)合物ELISA的種類和變化洗滌并除去未結(jié)合的封閉蛋白橘紅色

黃色

棕色

蘭色

藍(lán)綠色4-硝基酚磷酸鹽(PNP)

萘酚-AS-Mx磷酸鹽+重氮鹽ELISA試劑盒商業(yè)資訊測定的對象可以是抗體也可以是抗原。4-硝基酚磷酸鹽(PNP)

萘酚-AS-Mx磷酸鹽+重氮鹽ELISA的基本原理和方法洗滌并除去未結(jié)合的封閉蛋白ELISA的基本原理和方法ELISA在飼料安全檢測中的應(yīng)用因此，加入底物后顯色反應(yīng)較弱?？乖贵w反應(yīng)的這種特異性使免疫測定能在一非常復(fù)雜的蛋白質(zhì)化合物（例如血清）中測定某一特定的物質(zhì)，而不需先分離待檢物。ELISA的種類和變化《生物體系中的化學(xué)測量》表面殘留的蛋白結(jié)合位點ELISA試劑盒商業(yè)資訊其方法簡單，方便訊速，特異性強。因此，加入底物后顯色反應(yīng)較弱。（六）應(yīng)用親和素和生物素的ELISA抗體—待測抗原—酶標(biāo)記抗體甲基傘酮基半乳糖苷(4MuG)

硝基酚半乳糖苷(O