第10章 DNA生物合成課件

第十章DNA的生物合成第十章1

中心法則(TheCentralDogma)

遺傳信息從DNA到蛋白質(zhì)的傳遞規(guī)律.DNA的遺傳信息轉(zhuǎn)錄為RNA，RNA通過翻譯指導(dǎo)合成蛋白質(zhì)。DNA還通過復(fù)制將遺傳信息代代相傳。1970年發(fā)現(xiàn)RNA能逆轉(zhuǎn)錄為DNA，是對(duì)中心法則的補(bǔ)充。

逆轉(zhuǎn)錄 逆轉(zhuǎn)錄2

復(fù)制 DNA的生物合成 逆轉(zhuǎn)錄

復(fù)制（replication）：

以親代DNA為模板合成兩個(gè)相同子代DNA的過程。DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)堿基配對(duì)規(guī)律DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)3

第一節(jié)復(fù)制的特征第一節(jié)復(fù)制的特征4ParentalDNAPossiblemechanismsforreplicationParentalDNAPossiblemechanism5

半保留復(fù)制的實(shí)驗(yàn)依據(jù)(M.Meselson&F.W.Stahl,1958)半保留復(fù)制的實(shí)驗(yàn)依據(jù)6第10章DNA生物合成課件7

一.半保留復(fù)制 (semiconservativereplication)復(fù)制時(shí)，親代的雙鏈DNA解開成兩條單鏈，分別作為模板，以dNTP(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)為原料,

按照堿基配對(duì)(A－T、G－C)規(guī)律與模板上的堿基配對(duì),經(jīng)依賴DNA的DNA聚合酶(DNA-pol)催化,合成一條與模板互補(bǔ)的新鏈,新形成的兩個(gè)子代DNA分子與親代DNA堿基序列完全相同。每個(gè)子代DNA分子中一股單鏈?zhǔn)菑挠H代完整地接受過來,另一股單鏈?zhǔn)切潞铣傻?故稱為半保留復(fù)制。 一.半保留復(fù)制8

9第10章DNA生物合成課件10

半保留復(fù)制的意義

按半保留復(fù)制方式，子代DNA與親代DNA的堿基序列一致，即子代保留了親代的全部遺傳信息，體現(xiàn)了遺傳的保守性。是物種穩(wěn)定的分子基礎(chǔ)，但是相對(duì)的，不是絕對(duì)的。半保留復(fù)制的意義 11

二.雙向復(fù)制1.復(fù)制起始點(diǎn)(origin,ori)：多數(shù)生物體內(nèi)DNA分子兩條鏈同時(shí)復(fù)制。復(fù)制是在DNA分子的特定位點(diǎn)開始，稱為復(fù)制起始點(diǎn)，常用ori(origin)表示。原核生物的DNA只有一個(gè)Ori位點(diǎn)，復(fù)制從起點(diǎn)開始，到終點(diǎn)結(jié)束，完成整個(gè)DNA分子的復(fù)制,即原核生物的DNA只有一個(gè)復(fù)制單位,為單復(fù)制子，稱為復(fù)制體。

復(fù)制子：能獨(dú)立完成復(fù)制的功能單位。oriori12真核生物染色體DNA有多個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)。同時(shí)形成多個(gè)復(fù)制單位，從一個(gè)DNA復(fù)制起始點(diǎn)起始的DNA復(fù)制區(qū)域稱復(fù)制子(replicon)，每個(gè)復(fù)制子在一個(gè)細(xì)胞分裂周期中必須起動(dòng)而且只能起動(dòng)一次，真核生物染色體為多復(fù)制子。真核生物染色體DNA有多個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)。同時(shí)形成多個(gè)復(fù)制單位13

2.復(fù)制叉(replicationfork)

復(fù)制時(shí)，雙鏈DNA由起始點(diǎn)處打開，沿兩條張開的單鏈模板合成DNA新鏈，兩側(cè)形成的Y型結(jié)構(gòu)稱為復(fù)制叉(replicationfork)。

14

3.雙向復(fù)制(bidirectionalreplication)復(fù)制是從一個(gè)起始點(diǎn)開始，同時(shí)向兩個(gè)方向進(jìn)行，稱為雙向復(fù)制。

15三.半不連續(xù)復(fù)制DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的兩條鏈走向相反，復(fù)制時(shí)兩條鏈都能作為模板合成子代DNA。DNA的新鏈合成只能沿5’→3’方向進(jìn)行。DNA解鏈并開始復(fù)制后，一條新鏈合成方向與復(fù)制叉移動(dòng)方向相同，即以3’→5’走向的親代鏈為模板，因此該鏈可沿5’→3’方向連續(xù)合成，這條新鏈稱為領(lǐng)頭鏈。另一條鏈合成方向與復(fù)制叉移動(dòng)方向相反，新鏈不能連續(xù)合成稱為隨從鏈。隨從鏈的復(fù)制必須待模板鏈解鏈至一定長(zhǎng)度才能進(jìn)行復(fù)制，隨復(fù)制叉延伸過程，可合成許多DNA片段(岡崎片段)，再經(jīng)連接酶催化形成連續(xù)的新鏈。這種領(lǐng)頭鏈連續(xù)復(fù)制，隨從鏈不連續(xù)復(fù)制的方式稱DNA復(fù)制的半不連續(xù)性。

三.半不連續(xù)復(fù)制DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的兩條鏈走向相反，復(fù)制時(shí)兩16

領(lǐng)頭鏈(leadingstrand)

順著解鏈方向生成的子鏈，其復(fù)制是連續(xù)進(jìn)行的，得到一條連續(xù)的子鏈。

17

隨從鏈(laggingstrand)

復(fù)制方向與解鏈方向相反，須等解開足夠長(zhǎng)度的模板鏈才能繼續(xù)復(fù)制，得到的子鏈由不連續(xù)的片段所組成。岡崎片段(Okazakifragment)岡崎片段(Okazakifragment)18

岡崎片段： 1968年日本生化學(xué)者岡崎利用電鏡及放射自顯影技術(shù)，觀察到DNA復(fù)制中出現(xiàn)一些不連續(xù)的片段，因而將這些不連續(xù)的片段稱為岡崎片段。 原核生物的岡崎片段為一至二千個(gè)核苷酸，真核生物約為數(shù)百個(gè)核苷酸。

19第10章DNA生物合成課件20

第二節(jié)DNA復(fù)制的酶學(xué)

21

DNA復(fù)制體系復(fù)制是在酶催化下的核苷酸聚合過程,需要多種物質(zhì)的共同參與:

底物：dNTP(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)；

聚合酶(polymerase)：依賴DNA的DNA聚合酶，簡(jiǎn)寫為DNA-pol或DDDP；

模板(template)：解開成單鏈的DNA母鏈；

引物(primer)：提供3′-OH末端的寡核苷酸；

其他的酶和蛋白質(zhì)因子

22

一、DNA聚合酶催化dNTP聚合到核酸鏈上的酶。是DNA復(fù)制的主要酶。全稱叫依賴DNA的DNA聚合酶（DNAdependentDNApolymerase）或DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶（DNA-directedDNApolymerase），均縮寫為DDDP。一、DNA聚合酶23

(一)DNA聚合酶催化的反應(yīng)

1.5′至3′的聚合活性

催化四種dNTP一個(gè)一個(gè)地接到DNA鏈上去。 (dNMP)n+dNTP→(dNMP)n+1+PPi

24

聚合反應(yīng)機(jī)理：依賴于引物和模板催化核苷酸聚合有方向性：5′

3′依賴于引物和模板25

聚合反應(yīng)的特點(diǎn)： (1)以單鏈DNA為模板 (2)以dNTP為原料 (3)引物提供3′-OH (4)聚合方向?yàn)?′→3′(5)形成3′-5′磷酸二酯鍵

26

2.核酸外切酶活性3′→5′外切酶活性：切除錯(cuò)配的核苷酸即時(shí)校讀5′→3′外切酶活性：切除引物切除突變的片段？3′→5′外切酶活性：5′→3′外切酶活性：？27

(二)DNA聚合酶的種類

1.原核生物的DNA聚合酶pol-I（400:pol-II40:pol-III20）5′→3′聚合酶活性+++3′→5′外切酶活性+++5′→3′外切酶活性+–-功能切除引物填補(bǔ)空隙修復(fù)合成不清復(fù)制的主要酶活性最高pol-Ipol-IIpol-III5′→3′聚合酶活性+28

DNA-polI:單一肽鏈的大分子，二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋為主，含A－R18個(gè)α-螺旋。曾被稱為復(fù)制酶(replicase)含量最多功能:對(duì)復(fù)制中的錯(cuò)誤進(jìn)行校讀，對(duì)復(fù)制和修復(fù)中出現(xiàn)的空隙進(jìn)行填補(bǔ)。proteaseDNA-polI:protease29

N-terminalC-terminalProtease小片段（323A.A）：具有5′→3′外切酶活性大片段（604A.A）：具有5’→3’聚合活性和3′→5′外切酶活性(Klenow片段)是實(shí)驗(yàn)室常用的工具酶?？杀凰獬蓛蓚€(gè)片段

N-terminalC-terminalProtease小30

DNA-polIII:是E.coli的復(fù)制酶，在復(fù)制延長(zhǎng)中真正起聚合新鏈作用的DNA聚合酶。由10種亞基組成的不對(duì)稱二聚體：?核心酶(α,ε,θ):3’→5’外切酶活性和5’→3’聚合酶活性?β亞基:slidingclampprotein?γ-復(fù)合物:識(shí)別帶引物的單鏈DNA，促進(jìn)全酶組裝至模板上，穩(wěn)定酶結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)核心酶活性。催化效率最高DNA-polIII:31第10章DNA生物合成課件32

2.真核生物的DNA聚合酶DNA-pol

—引物酶活性，復(fù)制起始引發(fā)DNA-pol

—沒有其他DNA-pol時(shí)才起作用DNA-pol

—催化線粒體DNA的復(fù)制DNA-pol

—復(fù)制中延長(zhǎng)子鏈的主要酶，有解螺旋酶活性DNA-pol

—與原核生物的DNA-polI相似，在復(fù)制中起校讀、修復(fù)和填補(bǔ)缺口作用。

33

(三)復(fù)制的保真性(fidelity)

至少依賴三種機(jī)制：

1.遵守嚴(yán)格的堿基配對(duì)規(guī)律； 2.聚合酶在復(fù)制延長(zhǎng)中對(duì)堿基的選擇功能； 3.復(fù)制中的即時(shí)校讀功能。

34第10章DNA生物合成課件35

二、解旋解鏈酶類 解開并理順DNA雙鏈，維持DNA處于單鏈狀態(tài)。主要有解螺旋酶、

DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶和單鏈DNA結(jié)合蛋白。

36

(一)解螺旋酶(helicase)

:

模板對(duì)復(fù)制的指導(dǎo)作用在于堿基的準(zhǔn)確配對(duì)，而堿基卻埋在雙螺旋的內(nèi)部。只有把DNA解開成單鏈，它才能起模板作用。 解螺旋酶是最早發(fā)現(xiàn)的與復(fù)制有關(guān)的蛋白質(zhì)，當(dāng)時(shí)稱為rep蛋白。作用是利用ATP供能，解開DNA雙鏈。

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復(fù)制相關(guān)蛋白的基因：dnaA、dnaB、dnaC……dnaX 相應(yīng)的表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)：DnaA、DnaB、DnaC……DnaX DnaA：辨認(rèn)復(fù)制起始位點(diǎn)

DnaB：解螺旋酶 DnaC：輔助解螺旋酶使其在起始點(diǎn)上 結(jié)合并打開雙鏈。

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(二)單鏈DNA結(jié)合蛋白(SSB)

:

大腸桿菌SSB是由177個(gè)氨基酸殘基組成的同源四聚體，結(jié)合單鏈DNA的跨度約32個(gè)核苷酸單位。 SSB與解開的DNA單鏈緊密結(jié)合，防止重新形成雙鏈，并免受核酸酶降解。在復(fù)制中維持模板處于單鏈狀態(tài)并保護(hù)單鏈的完整。

39第10章DNA生物合成課件40

(三)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶(topoisomerase)

拓?fù)洌菏侵肝矬w或圖像作彈性移位而又保持物體原有的性質(zhì)。

拓?fù)洚悩?gòu)酶：是一類可改變DNA拓?fù)錁?gòu)象的酶。對(duì)DNA分子的作用是既能水解、又能連接磷酸二酯鍵

可松弛DNA超螺旋，有利于DNA解鏈。

41

42

拓?fù)洚悩?gòu)酶I（topoI）:

在原核生物曾被稱為－蛋白。主要作用是切開DNA雙鏈中的一股，使DNA解鏈旋轉(zhuǎn)中不打結(jié)，DNA變?yōu)樗沙跔顟B(tài)再封閉切口。催化反應(yīng)不需要ATP。

43第10章DNA生物合成課件44

拓?fù)洚悩?gòu)酶II（

topoII）:

在原核生物又叫旋轉(zhuǎn)酶(gyrase)。能切斷DNA雙鏈，使螺旋松弛。在ATP參與下，松弛的DNA進(jìn)入負(fù)超螺旋，再連接斷端。

45

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三、引物酶和引發(fā)體引物酶(primase):依賴DNA的RNA聚合酶。

催化RNA引物的合成。

在大腸桿菌，引物酶是dnaG基因的產(chǎn)物。RNA引物：

在DNA模板的復(fù)制起始部位由引物酶催化NTP的聚合，形成短片段的RNA，為DNA聚合提供3′-OH末端。

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引發(fā)體(primosome):

是由DnaB、DnaC等蛋白因子一起形成復(fù)合體，再結(jié)合引物酶(DnaG)形成較大的聚合體，結(jié)合到模板DNA上。

復(fù)制開始時(shí)，在引發(fā)體的下游解開雙鏈，再由引物酶催化引物的合成。第10章DNA生物合成課件48

四、DNA連接酶（DNAligase）連接DNA鏈3

-OH末端和相鄰DNA鏈5

-P末端，形成磷酸二酯鍵，從而把兩段相鄰的DNA鏈連接成完整的鏈。反應(yīng)需要ATP/NAD+。只能連接堿基互補(bǔ)基礎(chǔ)上雙鏈中的單鏈缺口，不能連接單獨(dú)存在的DNA或RNA單鏈。若DNA兩股都有單鏈缺口，只要缺口前后堿基互補(bǔ)也可連接。ATPATP49

DNA連接酶在復(fù)制、DNA修復(fù)、

重組、剪接中均起縫合缺口作用。是重要的工具酶之一。

50

第三節(jié)DNA生物合成過程第三節(jié)51

一、原核生物DNA的生物合成（一）復(fù)制的起始1.識(shí)別復(fù)制起始點(diǎn)2.解開DNA雙鏈：由拓?fù)洚悩?gòu)酶松弛超螺旋，解螺旋酶解開雙鏈，SSB結(jié)合到單鏈上使其穩(wěn)定。3.形成引發(fā)體和生成引物

GenomeinE.coliGenomeinE.coli52E.coli復(fù)制起始點(diǎn)——oriC的序列特征

三組各13bp的串連重復(fù)序列（Tandemrepeats）

兩對(duì)9bp反向重復(fù)序列（invertedrepeats）,富含AT，是DnaA蛋白的結(jié)合部位。E.coli復(fù)制起始點(diǎn)——oriC的序列特征三組各53(1)DnaA辨認(rèn)并結(jié)合oriC處并使此區(qū)域DNA解鏈。(2)DnaB在DnaC協(xié)助下解開雙鏈并沿解鏈方向移動(dòng)，逐漸置換DnaA，SSB結(jié)合于解開的單鏈DNA上。(3)引物酶DnaG進(jìn)入，形成由DnaB、DnaC、DnaG和DNA起始復(fù)制區(qū)構(gòu)成的引發(fā)體。

第10章DNA生物合成課件54(4)引發(fā)體的蛋白質(zhì)在DNA鏈上可以移動(dòng),消耗ATP。(5)引物酶DnaG沿5’→3’方向催化NTP聚合，合成短鏈RNA引物。引物長(zhǎng)度約為十幾個(gè)到幾十個(gè)核苷酸不等。聚合酶Ⅲ催化第一個(gè)dNTP與引物3‘-OH生成磷酸二酯鍵。拓?fù)涿缸饔?使解鏈順利進(jìn)行。第10章DNA生物合成課件55復(fù)制的起始復(fù)制的起始56大腸桿菌DNA復(fù)制的步驟大腸桿菌DNA復(fù)制的步驟57參與復(fù)制起始的各種因子DnaA蛋白辨認(rèn)起始點(diǎn)解螺旋酶（DnaB蛋白，rep蛋白）解開DNA雙鏈DnaC蛋白協(xié)助解螺旋酶引物酶（DnaG蛋白）催化RNA引物生成SSB穩(wěn)定解開的單鏈拓?fù)洚悩?gòu)酶理順DNA鏈oriC(245bp的DNA組分)E.coli的復(fù)制起始點(diǎn)名稱功能參與復(fù)制起始的各種因子DnaA蛋白58

（二）復(fù)制的延長(zhǎng)

在DNA聚合酶催化下，以解開的單鏈為模板，以四種dNTP為原料，進(jìn)行聚合作用。即新進(jìn)入的dNTP與引物或延長(zhǎng)中的子鏈上3′－OH形成磷酸二酯鍵，由5′3′方向延長(zhǎng)子鏈。（二）復(fù)制的延長(zhǎng)59半不連續(xù)復(fù)制：（1）領(lǐng)頭鏈合成方向與解鏈方向一致,連續(xù)合成（2）隨從鏈方向與解鏈方向相反,5'→3'不連續(xù)合成

半不連續(xù)復(fù)制：60

同一復(fù)制叉上，領(lǐng)頭鏈先于隨從鏈復(fù)制，但兩鏈由同一DNA-polⅢ催化合成同一復(fù)制叉上，領(lǐng)頭鏈先于隨從鏈復(fù)制，61

62（三）復(fù)制的終止原核生物為環(huán)狀DNA，雙向復(fù)制，兩個(gè)復(fù)制叉的匯合點(diǎn)就是復(fù)制的終點(diǎn)(termination,Ter)E.coli的復(fù)制終點(diǎn)(32位點(diǎn))位于環(huán)形染色體和OriC相對(duì)處，有特異的終止區(qū)序列，剛好把DNA分成2個(gè)半圓,雙向復(fù)制進(jìn)行180度后在終點(diǎn)匯合。（三）復(fù)制的終止原核生物為環(huán)狀DNA，雙向復(fù)制，兩個(gè)復(fù)制叉的63

隨從鏈不連續(xù)片段的連接1.引物水解:前一個(gè)岡崎片段延長(zhǎng)至后一片段時(shí),DNA-polI水解引物；2.填補(bǔ)空隙:polⅠ利用前一個(gè)岡崎片段的3′-OH,催化dNTP聚合填補(bǔ)空缺；3.片段連接:DNA連接酶連接二個(gè)DNA片段，形成完整的DNA鏈。領(lǐng)頭鏈引物水解后的空隙由環(huán)狀DNA最后復(fù)制的3′-OH末端延長(zhǎng)填補(bǔ)并連接。復(fù)制終止后,2個(gè)子代DNA分子相互鉸鏈在一起,在拓?fù)涿涪蜃饔孟?將其分開。

64222222222222233333333333333333333333333333333333333332222222222222222222222223333333333333333333365真核生物細(xì)胞分裂的時(shí)相變化——細(xì)胞周期:

G1phase:periodgrowthofcell

Sphase:DNA合成期

G2phase:cellsprepareformitosis

Mphase:mitosis

Gophase:nondividingcellsDNAreplicateperiodically二.真核生物DNA的生物合成真核生物細(xì)胞分裂的時(shí)相變化——DNAreplicatep66真核生物DNA復(fù)制的特點(diǎn)真核染色質(zhì)DNA結(jié)構(gòu)龐大，DNA復(fù)制有多個(gè)起始點(diǎn)，通過許多獨(dú)立復(fù)制子完成。每個(gè)復(fù)制子有固定復(fù)制起點(diǎn)，雙向復(fù)制。各起點(diǎn)復(fù)制起始不同步。真核生物DNA聚合酶有DNA-polα、β、γ、δ、ε。DNA-polδ在復(fù)制延長(zhǎng)中起催化作用，有解螺旋酶活性。DNA-polα有引物酶活性。拓?fù)洚悩?gòu)酶復(fù)制因子(Replicationfactor,RF):RFA,RFC等.增殖細(xì)胞核抗原(Proliferationcellnuclearantigen,PCNA)聚合DNA速度比原核DNA-pol慢，但總體速度不慢。隨后鏈也是不連續(xù)合成，岡崎片段比原核細(xì)胞的短，只有數(shù)百個(gè)核苷酸。真核生物DNA復(fù)制的特點(diǎn)真核染色質(zhì)DNA結(jié)構(gòu)龐大，DNA復(fù)制67真核生物線性染色體:多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，復(fù)制叉到達(dá)下一個(gè)起點(diǎn)或分子末端時(shí)即終止。真核生物線性染色體:68第10章DNA生物合成課件69第10章DNA生物合成課件70真核DNA復(fù)制的同時(shí),組蛋白、非組蛋白同時(shí)合成,復(fù)制完成后,裝配成核蛋白,組成染色體。真核DNA復(fù)制的同時(shí),組蛋白、非組蛋白同時(shí)合成,復(fù)制完成后,71DNAligaseDNApolymeraseRNaseHRemoveRNAprimerFillthegapJoinDNAfragmentsDNApolεDNAligase真核生物復(fù)制的終止DNAligaseDNApolymeraseRNase72

染色體DNA呈線性，復(fù)制在末端停止。

73第10章DNA生物合成課件74

端粒與端粒酶

端粒(telomere)是位于真核細(xì)胞線性染色體末端的特殊結(jié)構(gòu),由一段串聯(lián)重復(fù)的富含T、G的DNA短序列與端粒結(jié)合蛋白構(gòu)成；端粒具有穩(wěn)定染色體，防止末端降解和融合的功能；并維持DNA復(fù)制的完整性。端粒DNA序列在進(jìn)化上高度保守，不同生物的端粒序列都很相似，由長(zhǎng)5-10bp的重復(fù)單位串聯(lián)而成，人類的重復(fù)序列為TTAGGG，長(zhǎng)約15kb；端粒平均長(zhǎng)度隨細(xì)胞分裂次數(shù)的增多及年齡的增長(zhǎng)而變短,端粒DNA逐漸變短而消失,可導(dǎo)致染色體穩(wěn)定性下降，細(xì)胞隨之衰老。端粒與端粒酶75熒光原位雜交顯示的端粒（上）和端粒序列（下）熒光原位雜交顯示的端粒（上）和端粒序列（下）76第10章DNA生物合成課件77端粒酶(telomerase)由RNA和蛋白質(zhì)構(gòu)成的一種核糖核蛋白復(fù)合體，RNA分子含復(fù)制端粒DNA所需的核苷酸模板，其蛋白質(zhì)部分具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性。能以自身的RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成端粒DNA，維持端粒的長(zhǎng)度。人類端粒酶含三部分：端粒酶RNA(HumantelomeraseRNA,hTR)、端粒酶協(xié)同蛋白(Humantelomeraseassociatedprotein1,hTP1)、端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(Humantelomerasereversetranscriptase,hTRT).除骨髓干細(xì)胞、胚胎原始干細(xì)胞等細(xì)胞外,大多數(shù)正常人體細(xì)胞檢測(cè)不到端粒酶活性。惡性腫瘤細(xì)胞中,85%～90%端粒酶強(qiáng)陽(yáng)性。端粒酶可作為腫瘤標(biāo)志和腫瘤治療靶點(diǎn).

端粒酶(telomerase)78

爬行模型：

79第10章DNA生物合成課件80第10章DNA生物合成課件81

端粒及端粒酶的意義：端粒的長(zhǎng)短及端粒酶活性變化與細(xì)胞水平的老化(aging)及腫瘤的發(fā)生有一定關(guān)系。

82第四節(jié)逆轉(zhuǎn)錄和其他復(fù)制方式一.逆轉(zhuǎn)錄病毒和逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄(reversetranscription)——以RNA為模板，dNTP為原料,在逆轉(zhuǎn)錄酶催化下,合成與RNA互補(bǔ)的DNA的過程。

逆轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase,依賴RNA的DNA聚合酶) 1.RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性 2.RNA水解酶活性 3.DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性第四節(jié)逆轉(zhuǎn)錄和其他復(fù)制方式833DmodelofHIVreversetranscriptase3DmodelofHIVreversetransc84

逆轉(zhuǎn)錄過程：逆轉(zhuǎn)錄酶催化的DNA合成反應(yīng)也是5′→3′方向。需要的引物是病毒本身的一種tRNA。逆轉(zhuǎn)錄酶催化的DNA合成反應(yīng)也是5′→3′方向。85第10章DNA生物合成課件86第10章DNA生物合成課件871.Aretrovirus-specificcellulartRNAhybridizeswithacomplementaryregioncalledtheprimer-bindingsite(PBS).2.ADNAsegmentisextendedfromtRNAbasedonthesequenceoftheretroviralgenomicRNA.3.TheviralRandU5sequencesareremovedbyRNaseH.4.Firstjump:DNAhybridizeswiththeremainingRsequenceatthe3'end.5.ADNAstrandisextendedfromthe3'end.6.MostviralRNAisremovedbyRNaseH.7.AsecondDNAstrandisextendedfromtheviralRNA.8.BothtRNAandtheremainingviralRNAareremovedbyRNaseH.9.Secondjump:ThePBSregionofthesecondstrandhybridizeswiththePBSregionofthefirststrand.10.ExtensiononbothDNAstrands.

LTRstandsfor"longterminalrepeat".第10章DNA生物合成課件88

RNA病毒經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄成為雙鏈DNA，能整合入宿主細(xì)胞基因組，并隨宿主細(xì)胞復(fù)制和表達(dá),可能使宿主細(xì)胞發(fā)生癌變。RNA病毒經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄成為雙鏈DNA，能整合入宿主細(xì)胞基因組，89第10章DNA生物合成課件90Atypical,"minimal"retrovirusconsistsof:1.anouterenvelopewhichwasderivedfromtheplasmamembraneofitshost2.manycopiesofanenvelopeproteinembeddedinthelipidbilayerofitsenvelope3.acapsid;aproteinshellcontaining4.twomoleculesofRNAand5.moleculesoftheenzymereversetranscriptaseAtypical,"minimal"retroviru91HumanImmunodeficiencyVirus(HIV)

HumanImmunodeficiencyVirus(92第10章DNA生物合成課件93Reversetranscription

invirus分子生物學(xué)研究可應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄酶合成DNA。以mRNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成的與mRNA堿基序列互補(bǔ)的DNA鏈，稱為互補(bǔ)DNA(complementaryDNA,cDNA)cDNAReversetranscription分子生物學(xué)研究可94

二.滾環(huán)復(fù)制和D環(huán)復(fù)制

一些簡(jiǎn)單低等生物或染色體以外的DNA復(fù)制的特殊形式。

95D環(huán)復(fù)制滾環(huán)復(fù)制線粒體DNA為D環(huán)復(fù)制D環(huán)復(fù)制的特點(diǎn)是復(fù)制起點(diǎn)不在雙鏈DNA同一位點(diǎn)，內(nèi)、外環(huán)復(fù)制有時(shí)序差別

D環(huán)復(fù)制滾環(huán)復(fù)制線粒體DNA為D環(huán)復(fù)制D環(huán)復(fù)制的特點(diǎn)是復(fù)制起96

第四節(jié)

DNA損傷與修復(fù)

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突變(mutation)： 是指遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)改變而引起的遺傳信息的改變，也稱為DNA損傷(DNAdamage)。 從分子水平來看，突變就是DNA分子上堿基的改變。

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一、突變的意義(一)突變是進(jìn)化、分化的分子基礎(chǔ)

進(jìn)化過程是突變的不斷發(fā)生所造成的。沒有突變就沒有今天的五彩繽紛的世界。遺傳學(xué)家認(rèn)為：沒有突變就不會(huì)有遺傳學(xué)。

大量的突變都屬于由遺傳過程自然發(fā)生的，叫自發(fā)突變或自然突變（spontaneousmutation）。

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(二)突變導(dǎo)致基因型改變

這種突變只有基因型的改變，而沒有可察覺的表型改變。

多態(tài)性(polymophism)：是用來描述個(gè)體之間的基因型差別現(xiàn)象。利用DNA多態(tài)性分析技術(shù)，可識(shí)別個(gè)體差異和種、株間差異。

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(三)突變導(dǎo)致死亡突變發(fā)生在對(duì)生命至關(guān)重要的基因上，可導(dǎo)致個(gè)體或細(xì)胞的死亡。(四)突變是某些疾病的發(fā)病基礎(chǔ)包括遺傳病、腫瘤及有遺傳傾向的病。有些已知其遺傳缺陷所在。但大多數(shù)尚在研究中。

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二、引發(fā)突變的因素

大量的突變屬自發(fā)突變，發(fā)生頻率為10-9。

用生活環(huán)境中導(dǎo)致突變的因素，在實(shí)驗(yàn)室可以誘發(fā)突變，稱為誘變，導(dǎo)致突變的因素稱為誘變劑。主要有物理和化學(xué)因素。

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物理因素：紫外線和各種輻射二聚體的形成影響了DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu),使復(fù)制和轉(zhuǎn)錄受阻二聚體的形成影響了DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu),使復(fù)制和轉(zhuǎn)錄受阻103

化學(xué)因素：常見的化學(xué)誘變劑化合物類別分子改變堿基類似物(如：5-BU)A→5-BU→G羥胺類(NH2OH)T→C亞硝酸鹽(NO2-)C→U烷化劑(如：氮芥類)G→mG化合物類別分子改變堿基類似物(如：5-BU)A→5-104AmesassayHis-SalmonellaHistidineDeficientplatesControlplatePlate+chemicalBenefits:two-dayassay;verycheapAmes實(shí)驗(yàn)是檢驗(yàn)致癌劑的常用方法，將鼠傷寒沙門氏桿菌組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株接種到含待測(cè)物的無(wú)組氨酸培養(yǎng)基平皿中，若待測(cè)物含有誘變劑，可發(fā)生回復(fù)突變，長(zhǎng)出的菌落多少可以反映誘變劑的強(qiáng)弱。AmesassayHis-SalmonellaHist105AmesassayReliesonthehighcorrelationbetweencarcinogenesisandtheDNA-damaging,ormutagenicagents;UsesadisabledSalmonellaTyphimurium,withdefectivecellwall,allowingeasyimportofchemicals;His-;

withdefectiverepairingsystem;Lookforreversemutations(回復(fù)突變)ingenesforHistidinebiosynthesisMutantgeneswillallowsurvivalandgrowthofthebacteriaonhistidinedeficientplatesAmajorshortfallofAmestestisthatitusesbacteria,insteadofeukaryoticcells.AmesassayReliesonthehighc106AmesassayAmestestdetectsdirectactingmutagensSomechemicalsaremutagenic,butnotcarcinogenicManychemicalsarecarcinogenic,butnotmutagenicAmesassayAmestestdetectsdi107

三、突變的類型(一)錯(cuò)配（點(diǎn)突變）

——指DNA分子上一個(gè)堿基的變異（置換）。

1.轉(zhuǎn)換(transition)： 發(fā)生在同型堿基之間的置換嘌呤←→嘌呤嘧啶←→嘧啶 2.顛換(transversion)： 發(fā)生在異型堿基之間的置換嘌呤←→嘧啶

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鐮形紅細(xì)胞貧血病人的Hb(HbS)與正常成人的Hb(HbA)比較HbSHbA基因模板鏈CACCTC

mRNAGUGGAG肽鏈第6位氨基酸ValGluHbSHbA基因模板鏈CACCTCmRNAGUGGA109

(二)缺失(deletion)和插入(insertion)

1.缺失：一個(gè)堿基或一段核苷酸鏈從DNA大分子上缺失 2.插入：DNA大分子上插入一個(gè)堿基或一段核苷酸鏈

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框移突變(frame-shiftmutation):

缺失和插入引起的三聯(lián)體密碼的閱讀方式改變，造成蛋白質(zhì)氨基酸排列順序發(fā)生改變。通常使基因產(chǎn)物完全失活，出現(xiàn)終止碼會(huì)使翻譯提前終止。

正常 5′……GCA

GUA

CAU

GUC…… 丙纈組纈