曹雪松畢業(yè)答辯PPT

石墨烯材料對(duì)蛋白核小球藻的毒性機(jī)理研究答辯人：曹雪松導(dǎo)師：王震宇教授2015.05.31青島主要內(nèi)容

研究背景與科學(xué)問題石墨烯材料的表征石墨烯材料對(duì)藻細(xì)胞的生長抑制

石墨烯材料對(duì)藻細(xì)胞的致毒機(jī)制

結(jié)論與致謝1.研究背景與科學(xué)問題石墨烯（Graphene）是一種由碳原子以sp2雜化軌道組成六角型呈蜂巢晶格的二維碳納米材料。氧化石墨烯（Grapheneoxide）是一種由石墨粉末經(jīng)化學(xué)氧化及剝離后的產(chǎn)物，是一種表面含有大量含氧官能團(tuán)的石墨烯層片。還原型氧化石墨烯（reducedGrapheneoxide）是一種通過氧化還原法制備得到的石墨烯層片，表面含有較少量含氧官能團(tuán)。1.1石墨烯材料簡(jiǎn)介GrapheneGrapheneoxidereducedGrapheneoxideZurutuzaetal.,2014,Naturenanotechnology1.2石墨烯材料應(yīng)用石墨烯材料是已知世上最薄、最堅(jiān)硬的納米材料，具有超高的導(dǎo)電導(dǎo)熱性能，使得石墨烯材料具有極大的應(yīng)用前景，石墨烯材料的相關(guān)研究也成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)1.3石墨烯材料可能的環(huán)境行為石墨烯廣泛關(guān)注1.4石墨烯材料毒性研究現(xiàn)狀細(xì)菌植物動(dòng)物人體細(xì)胞Begumetal.,2011,CarbonAkhavanetal.,2011,ACSnanoLietal.,2013,PNASFuetal.,2015,Biomaterials?藻類石墨烯材料1.5石墨烯材料對(duì)藻細(xì)胞毒性研究現(xiàn)狀Pretti等研究表明石墨烯能夠通過物理損傷及氧化脅迫抑制杜氏鹽藻藻細(xì)胞生長。Hu等研究表明石墨烯能夠通過氧化脅迫及DNA損傷抑制蛋白核小球藻藻細(xì)胞生長。Hu等研究表明研究表明氧化石墨烯能夠通過氧化脅迫及破壞新陳代謝過程抑制蛋白核小球藻藻細(xì)胞生長。表面官能團(tuán)邊緣狀態(tài)厚度石墨烯材料?致毒機(jī)制?三種石墨烯材料對(duì)藻細(xì)胞有哪些主要的毒性機(jī)制？這些毒性機(jī)制對(duì)三種石墨烯材料產(chǎn)生毒性效應(yīng)的貢獻(xiàn)如何？三種石墨烯材料對(duì)藻細(xì)胞的毒性是否具有差異性？哪些石墨烯性質(zhì)（如表現(xiàn)官能團(tuán)、厚度、邊緣狀態(tài)等）決定其對(duì)藻細(xì)胞毒性的強(qiáng)弱？1.6科學(xué)問題2.1石墨烯材料的制備2.石墨烯材料的制備與表征氧化石墨烯（Grapheneoxide，GO）：本實(shí)驗(yàn)中的氧化石墨烯采用改進(jìn)的Hummers’Method，即混合濃硫酸(H2SO4)、高錳酸鉀（KMnO4）和石墨在50°C水浴攪拌反應(yīng)15h，經(jīng)鹽酸、乙醇、蒸餾水反復(fù)清洗，得到氧化完全的GO還原型氧化石墨烯（reducedGrapheneoxide，rGO）：利用水合肼在95

℃下還原GO得到還原完全的rGO多層石墨烯（

Multi-layerGraphene，G）購買于美國GrapheneSupermarketGGOrGO2.2石墨烯材料的表征X射線衍射

（XRD）GO的層間距經(jīng)計(jì)算為8.68?，與Marcano等利用改進(jìn)Hummers’Method制備的GO層間距一致rGO層間距減少至3.72?，與Park等利用水合肼還原制備rGO的層間距一致G層間距經(jīng)計(jì)算為為3.36

?，為石墨烯標(biāo)準(zhǔn)層間距10.223.926.5GO含有大量含氧官能團(tuán)（羥基、羧基、羰基、環(huán)氧基），因此GO具有較好的親水性和較好的懸浮性rGO和G表面官能團(tuán)較少，因此rGO和G具有較高的疏水性，在水中有較弱的懸浮性3518cm-1-OH1757cm-1–C=O1639cm-1–C=C1238cm-1–C-O1130cm-1C-O-C傅立葉紅外光譜（FTIR）

─GO

─

rGO─

GGOrGOG原子力顯微鏡（AFM）1.8~2.5nm0.9~1.2nm5~8nm

單層GO的厚度約為1.1nm，表明GO約為雙層氧化石墨烯

單層rGO的厚度約為0.56nm，表明rGO約為雙層還原型氧化石墨烯

單層G的厚度約為0.35nm，表明G約為18層的多層石墨烯Graphene

materialsBETspecificsurfacearea(m2/g)Zetapotentialindistilledwater(mV)Zetapotentialinmedium(mV)ElementalcompositionC(%)O(%)H(%)S(%)N(%)GO264.6-41.9±1.3-27.3±1.339.255.22.812.79NOrGO617.6-32.7±1.3-24.7±0.762.330.12.090.195.32G129.7-25.6±1.5-19.6±1.192.55.710.561.23NO*NO表明該元素含量低于元素分析儀檢測(cè)線比表面積、Zeta電位、元素組成rGO具有最大的比表面積，是GO的2.2倍，G的4.7倍GO表面帶有大量負(fù)電荷，與其表面大量含氧官能團(tuán)相關(guān)；三種石墨烯材料Zeta電位在藻細(xì)胞培養(yǎng)液中明顯降低，會(huì)降低石墨烯材料的懸浮性GO含氧量達(dá)到55.2%，表明GO被充分氧化；rGO含氧量降低到30.1%，表明rGO得到充分還原3.石墨烯材料對(duì)藻細(xì)胞的生長抑制實(shí)驗(yàn)材料受試生物：蛋白核小球藻（真核，2~5μm）石墨烯材料：多層石墨烯（Multi-layergraphene，G）氧化石墨烯（Grapheneoxide，GO）還原型氧化石墨烯（reducedgrapheneoxide，rGO）多壁碳納米管（Multiwalledcarbonnanotube，CNT）石墨（Graphite，Gt）■GO■rGO■

G■CNT■Gt3.1不同暴露時(shí)間下，石墨烯材料對(duì)藻細(xì)胞生長的抑制石墨烯材料及CNT、Gt（50mg/L）暴露不同時(shí)間后，藻細(xì)胞生長的抑制率隨暴露時(shí)間的增加，石墨烯材料對(duì)藻細(xì)胞的抑制率逐漸增加石墨烯材料對(duì)藻細(xì)胞的毒性顯著強(qiáng)于CNT和Gt■GO■rGO■

G■CNT■Gt3.2不同暴露濃度下，石墨烯材料對(duì)藻細(xì)胞生長的抑制隨暴露濃度的增加石墨烯材料對(duì)藻細(xì)胞的抑制率逐漸增加rGO、GO、G對(duì)蛋白核小球藻的半數(shù)效應(yīng)濃度(EC50)分別為34.0、37.4和62.2mg/L不同濃度的石墨烯材料、CNT、Gt在暴露96h后，對(duì)藻細(xì)胞生長的抑制率4.石墨烯材料對(duì)藻細(xì)胞的致毒機(jī)制遮蔽效應(yīng)損傷細(xì)胞膜養(yǎng)分耗竭ROSGOtreatmentControl4.1石墨烯材料對(duì)藻細(xì)胞的遮蔽效應(yīng)遮蔽效應(yīng)裝置石墨烯材料通過遮蔽效應(yīng)對(duì)藻細(xì)胞生長的抑制GOtreatment0hGOtreatment96hGO-藻細(xì)胞懸浮液在加入GO96h后的顏色變化情況GO能夠通過遮蔽效應(yīng)抑制藻細(xì)胞的生長，rGO和G對(duì)藻細(xì)胞沒有顯著的遮蔽效應(yīng)GO具有的良好的懸浮性及GO-藻細(xì)胞懸浮液在96h后明顯變黑可能是GO產(chǎn)生遮蔽效應(yīng)的主要原因；rGO和G因容易發(fā)生團(tuán)聚沉降，是其未產(chǎn)生遮蔽效應(yīng)的主要原因17%流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞膜完整性石墨烯材料（50mg/L）處理96h后，藻細(xì)胞細(xì)胞膜均顯著被破壞石墨烯材料對(duì)細(xì)胞膜的破壞程度：rGO>G>GOCKrGOGGO4.2.1細(xì)胞膜損傷檢測(cè)膜損傷的細(xì)胞比率4.2石墨烯材料對(duì)藻細(xì)胞細(xì)胞膜的損傷石墨烯材料（50mg/L,96h）能夠破壞藻細(xì)胞細(xì)胞膜，導(dǎo)致鉀離子滲漏，rGO能夠明顯導(dǎo)致DNA滲漏鉀離子滲漏程度與流式細(xì)胞儀檢測(cè)膜損傷程度相同4.2.2胞內(nèi)物質(zhì)滲漏鉀離子滲漏DNA滲漏氧化脅迫石墨烯材料（50mg/L）處理96h后，胞內(nèi)ROS總量顯著增加，并進(jìn)一步引起脂質(zhì)過氧化石墨烯材料導(dǎo)致氧化脅迫程度：rGO>GO≈G4.2.3細(xì)胞膜損傷的原因胞內(nèi)ROS總量脂質(zhì)過氧化A1A3rGOrGOrGO物理損傷4.2.3細(xì)胞膜損傷的原因GGGSEM觀察石墨烯材料處理96h后藻細(xì)胞表面狀況，rGO和G通過鋒利的尖角穿透藻細(xì)胞表面，GO未發(fā)現(xiàn)有穿刺藻細(xì)胞現(xiàn)象CKGOGSEM觀察石墨烯材料處理藻細(xì)胞96h后藻細(xì)胞形態(tài)變化，GO、rGO、G均出現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)畸形的現(xiàn)象CKGOrGOGnonspherocyticshriveledshriveledrGOG4.2.3細(xì)胞膜損傷的原因物理損傷SEM觀察石墨烯材料處理藻細(xì)胞96h后藻細(xì)胞形態(tài)變化，rGO、G出現(xiàn)細(xì)胞開裂及部分缺失現(xiàn)象4.3石墨烯材料導(dǎo)致養(yǎng)分耗竭實(shí)驗(yàn)方法培養(yǎng)藻細(xì)胞培養(yǎng)藻細(xì)胞培養(yǎng)藻細(xì)胞4.3.1石墨烯材料引起養(yǎng)分耗竭程度石墨烯材料會(huì)吸附培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致養(yǎng)分耗竭，從而抑制藻細(xì)胞生長，GO、rGO、G導(dǎo)致養(yǎng)分耗竭對(duì)藻細(xì)胞生長的抑制分別占它們總毒性的53%、35%、27%充足的養(yǎng)分可以緩解石墨烯材料的毒性，表明石墨烯材料能夠引起養(yǎng)分耗竭，從而抑制藻細(xì)胞的生長石墨烯材料導(dǎo)致藻細(xì)胞養(yǎng)分耗竭程度：GO>rGO>G35%27%MediumSufficientnutritionmedium石墨烯材料吸附96h后的營養(yǎng)液對(duì)藻細(xì)胞生長的抑制充足養(yǎng)分的營養(yǎng)液對(duì)石墨烯毒性的緩解GraphenematerialsMediumaftergraphenematerialsadsorption石墨烯材料對(duì)微量元素（Fe、Mn、Cu、Zn）沒有吸附石墨烯材料明顯的吸附了大量元素(N、P、Mg、Ca)，石墨烯材料對(duì)大量元素的吸附是引起養(yǎng)分耗竭的主要原因大量元素缺失程度：GO>rGO>G4.3.2石墨烯材料對(duì)營養(yǎng)元素的吸附加入石墨烯材料96h后，營養(yǎng)液中微量元素的濃度變化情況加入石墨烯材料96h后，營養(yǎng)液中大量元素的濃度變化情況結(jié)論石墨烯材料對(duì)藻細(xì)胞的毒性：rGO>GO>GGO因良好的懸浮性對(duì)藻細(xì)胞產(chǎn)生遮蔽效應(yīng)，且遮蔽效應(yīng)產(chǎn)生的毒性是其總毒性的17%；rGO和G因較弱的懸浮性沒有產(chǎn)生遮蔽效應(yīng)石墨烯材料均能夠顯著破壞藻細(xì)胞細(xì)胞膜，石墨烯材料對(duì)細(xì)胞膜的破壞程度：rGO>G>GO；rGO和G可以通過氧化脅迫和物理損傷破壞藻細(xì)胞細(xì)胞膜；GO主要通過氧化脅迫破壞細(xì)胞膜石墨烯材料能夠吸附藻細(xì)胞營養(yǎng)液中的營養(yǎng)元素（N、P、Mg、Ca）引起養(yǎng)分耗竭，且養(yǎng)分耗竭程度：GO>rGO>G；GO、rGO、G導(dǎo)致養(yǎng)分耗竭對(duì)藻細(xì)胞生長的抑制分別是它們總毒性的53%、35%和27%創(chuàng)新點(diǎn)首次研究了不同石墨烯材料對(duì)藻細(xì)胞的毒性差異，揭示了石墨烯材料能夠通過遮蔽效應(yīng)、膜損傷、養(yǎng)分耗竭等致毒機(jī)制對(duì)藻細(xì)胞產(chǎn)生毒性，并對(duì)不同致毒機(jī)制在石墨烯材料對(duì)藻細(xì)胞毒性效應(yīng)中的貢獻(xiàn)進(jìn)行了定量分析揭示了石墨烯材料會(huì)吸附藻細(xì)胞培養(yǎng)液中營養(yǎng)元素（N、P、Mg、Ca），導(dǎo)致培養(yǎng)液養(yǎng)分耗竭，進(jìn)而抑制藻細(xì)胞生長探究石墨烯材料能否進(jìn)入藻細(xì)胞，及其進(jìn)入藻細(xì)胞的方式及機(jī)理，其進(jìn)入藻細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)是否能夠造成基因毒性仍有待深入研究如果石墨烯材料可以進(jìn)入藻細(xì)胞體內(nèi)，藻細(xì)胞作為水體生態(tài)系統(tǒng)的初級(jí)生產(chǎn)者，其進(jìn)入藻細(xì)胞后隨食物鏈的遷移、轉(zhuǎn)化、富集情況尚不明確，需要進(jìn)一步研究。研究展望致謝衷心感謝導(dǎo)師王震宇教授在人生道路上的指引，及在我遇到挫折時(shí)的鼓勵(lì)！感謝趙建老師在課題設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)室工作、論文撰寫、做事準(zhǔn)則等各個(gè)方面給予我悉心指導(dǎo)和無私