基因工程(2014本科)

第三章基因工程(GeneticEngineering)第一節(jié)概述一、基因工程的基本概念（一）基因工程的定義

將不同生物體的基因與載體拼接重組構(gòu)成新的遺傳組合，轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞后，使之穩(wěn)定遺傳并表達(dá)新性狀的過程（二）基因工程的基本過程1.目的基因與載體的獲得（分）2.目的基因與載體的內(nèi)切酶切割（切）3.目的基因與載體的連接（接）4.重組載體導(dǎo)入受體細(xì)胞（轉(zhuǎn)）5.重組受體細(xì)胞的鑒定與篩選（篩）6.外源目的基因的擴(kuò)增與表達(dá)（表）二、基因工程的發(fā)展歷史1944年遺傳信息的攜帶者是DNA1953年DNA分子雙螺旋模型的建立1958年DNA半保留復(fù)制方式的提出1958年中心法則的提出1961年基因表達(dá)的操縱子模式的建立1966年氨基酸的遺傳密碼的破解20世紀(jì)60-70年代限制性核酸內(nèi)切酶、DNA連接酶、反轉(zhuǎn)錄酶的應(yīng)用，大腸桿菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)、電泳、雜交技術(shù)的建立三、基因工程的應(yīng)用

基因工程技術(shù)已經(jīng)在農(nóng)業(yè)、工業(yè)、環(huán)境保護(hù)與醫(yī)學(xué)領(lǐng)域帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)與社會(huì)效益。其中，受益最多的是生物科學(xué)本身。第二節(jié)基因工程中常用的工具酶限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別特異序列，切割DNADNA連接酶連接DNA分子或片段DNA聚合酶合成雙鏈cDNA中的第二條鏈反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA多聚核苷酸激酶催化核酸羥基末端磷酸化末端轉(zhuǎn)移酶在3`羥基端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾堿性磷酸酶切除5`末端磷酸基一、限制性核酸內(nèi)切酶

識(shí)別特異的DNA序列，并在識(shí)別位點(diǎn)或其周圍切割雙鏈DNA的內(nèi)切酶（一）限制性核酸內(nèi)切酶的類型（二）限制性核酸內(nèi)切酶的命名法

HindIII屬種株序（三）限制性核酸內(nèi)切酶的基本特征

大部分II型酶識(shí)別由4-8個(gè)核苷酸組成的特定序列；這些序列常常具有回文結(jié)構(gòu)，即具有雙重旋轉(zhuǎn)對稱結(jié)構(gòu)的兩條DNA鏈的堿基序列的反向重復(fù)；切割DNA后產(chǎn)生5‘磷酸和3’羥基端；可以在兩條鏈上交錯(cuò)切割形成單鏈突出末端——黏末端，也可以形成沒有單鏈突出的末端——平末端；同位酶來源不同，識(shí)別序列相同，切割DNA的位點(diǎn)或方式可以相同或不同；同尾酶來源不同，識(shí)別序列不同，產(chǎn)生出相同粘性末端的酶；可變酶識(shí)別序列中的一個(gè)或多個(gè)堿基是可變的；被相同的限制性核酸內(nèi)切酶切割的兩個(gè)DNA分子是否可以連接？第三節(jié)基因工程中的載體載體（vector）：能攜帶外源DNA分子進(jìn)入受體細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)的運(yùn)載工具類型：克隆載體、表達(dá)載體宿主來源：原核載體、真核載體載體具備的條件：1、具有自我復(fù)制能力；2、有多個(gè)單一限制性核酸內(nèi)切酶切割位點(diǎn)；3、具有選擇標(biāo)志；4、分子質(zhì)量小，以容納較大的外源DNA分子；5、拷貝數(shù)高；6、具有較高的遺傳穩(wěn)定性；質(zhì)粒載體存在于細(xì)菌染色體之外的，具有自主復(fù)制能力的雙鏈環(huán)狀DNA分子松弛型質(zhì)粒適用于DNA重組中作為載體接受15kb以下的外源DNA分子的插入（一）pBR322質(zhì)粒載體（二）pUC質(zhì)粒載體系列第四節(jié)目的基因的獲取目的基因：待研究或應(yīng)用的特定基因，亦即待克隆或表達(dá)的基因

一、從基因文庫中篩選二、cDNA的合成和克隆三、化學(xué)法合成目的基因基因文庫(genelibrary)基因組文庫(genomiclibrary)

含有某種生物體全部基因片段的重組克隆群體cDNA文庫(cDNAlibrary)

含有某種細(xì)胞全部mRNA信息的重組克隆群體兩文庫的區(qū)別？在原核細(xì)胞中表達(dá)某真核細(xì)胞中的蛋白，應(yīng)當(dāng)選擇哪個(gè)文庫的基因作為基因表達(dá)的模板？第五節(jié)重組體的構(gòu)建、導(dǎo)入與篩選一、DNA的連接（一）黏性末端連接（二）平末端連接（三）人工接頭連接（四）同聚物加尾連接（五）T-A克隆為何在基因重組操作中，常常選擇兩種不同的限制性核酸內(nèi)切酶進(jìn)行酶切后連接操作？二、重組體的導(dǎo)入轉(zhuǎn)化將質(zhì)粒DNA分子或以質(zhì)粒為載體構(gòu)建的重組DNA分子導(dǎo)入細(xì)菌的過程感染或轉(zhuǎn)染將病毒（感染）或病毒為載體（轉(zhuǎn)染）構(gòu)建