自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤對(duì)乙醇誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞活化作用的研究

自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤對(duì)乙醇誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞活化作用的研究

酒精性肝炎（alf）是一種長期飲酒引起的慢性肝臟疾病。最初出現(xiàn)酒精性肝炎，然后發(fā)展為酒精性肝炎、肝纖維素酶分解和肝硬化。ALF是肝癌死亡的主要原因之一,是多基因、多階段、多途徑的復(fù)雜過程,然而至今仍缺乏早期、有效的治療措施,故探討ALF的發(fā)病機(jī)制及治療靶點(diǎn)尤為重要。自噬(autophagy)是指從粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的無核糖體附著區(qū)脫落的雙層膜包裹部分胞質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)需降解的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)等成分形成自噬體(autophagosome),并與溶酶體融合形成自噬溶酶體,降解其所包裹的內(nèi)容物,以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞本身的代謝需要和某些細(xì)胞器的更新,在細(xì)胞生長發(fā)育、蛋白質(zhì)代謝平衡及細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持等過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。在肝纖維化發(fā)生過程中,各種致病因素刺激下HSC活化,細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存的脂滴消失后,表型向肌纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)化,表達(dá)其活化標(biāo)志蛋白α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smoothmuscleactin,α-SMA)并大量分泌以I型膠原蛋白為主要成分的細(xì)胞外基質(zhì)并最終導(dǎo)致肝內(nèi)基質(zhì)沉積。目前關(guān)于自噬的研究多集中于炎癥、腫瘤、神經(jīng)退行性疾病等領(lǐng)域,而自噬在乙醇誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞活化進(jìn)而發(fā)生肝纖維化中的作用研究甚少。本實(shí)驗(yàn)使用不同劑量的自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)作用于乙醇刺激后的肝星狀細(xì)胞(HSC),觀察其HSC活化水平,并探討其作用機(jī)制。1材料和方法1.1生物技術(shù)來源大鼠肝星狀細(xì)胞系HSC-T6購自湘雅細(xì)胞庫,3-MA購自Sigma公司,培養(yǎng)基DMEM購自HyClone公司。胰蛋白酶、胎牛血清、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)購自Solarbio公司。TRIzol、DMSO購自北京全式金生物技術(shù)公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司。引物由上海生工生物工程公司合成。2×PCRMasterMix購自北京全式金生物技術(shù)公司?？偟鞍滋崛≡噭┖匈徸员本┢绽R基因技術(shù)有限公司。兔抗LC3多克隆抗體、兔抗SMA多克隆抗體、兔抗COL1A2多克隆抗體、小鼠抗β-肌動(dòng)蛋白(actin)單克隆抗體(mAb)購自Proteintech公司,辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗及山羊抗小鼠二抗購自北京中杉金橋公司。1.2方法1.2.1邏輯發(fā)揮pbs溶液3-MA粉末按100mmol/L溶解在1×無菌PBS溶液中,-20℃避光保存。使用時(shí)用含有100mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液稀釋至所需濃度。1.2.2高糖dmem培養(yǎng)基的培養(yǎng)HSC-T6復(fù)蘇后置于含10%胎牛血清、雙抗(100U/mL的青霉素和100mg/L的鏈霉素)的高糖DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中,37℃、飽和空氣濕度和5%的CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。設(shè)定4個(gè)不同處理組,分別為空白對(duì)照組、陽性對(duì)照組(乙醇刺激組)、低劑量組(5mmol/L3-MA+100mmol/L乙醇)、高劑量組(10mmol/L3-MA+100mmol/L乙醇)。1.2.3pcr檢測(cè)cacgtatrt-3,型膠原蛋白和-actin的表達(dá)采用Trizol提取RNA,合成cDNA后PCR擴(kuò)增目的基因,同一樣本以β-actin為內(nèi)參。根據(jù)GenBank上公布的大鼠的α-SMA、Ⅰ型膠原mRNA序列,應(yīng)用PrimerPrimier5軟件設(shè)計(jì)引物。引物序列:α-SMA引物上游5′-GAAGCTGCTCCAGCTATGTGT-3′,下游5′-CAACCATCACTCCCTGG-3′,126bp;Ⅰ型膠原引物上游5′-GATGGACTCAACGGTCTCCC-3′,下游5′-CGGCCAC-CATCTTGAGACTT-3′,185bp;β-actin引物上游5′-CACCC-GCGAGTACAACCTTC-3′,下游5′-CCCATACCCACCATCA-CACC-3′,221bp。α-SMA和β-actin的反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5min,94℃變性35s,退火35s(α-SMA、β-actin為60℃,Ⅰ型膠原蛋白為62℃),72℃延伸35s,35個(gè)循環(huán);最后72℃7min。取5μLPCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳,用暗箱式紫外透射儀觀察電泳結(jié)果并拍照。結(jié)果用BANDLEAD3.00軟件,以目的條帶/β-actin的光密度(OD)值進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。1.2.4小鼠sds-東南角蛋白表達(dá)水平的測(cè)定采用蛋白抽提液分別提取各組細(xì)胞的總蛋白,全自動(dòng)生化分析儀(Beckman,USA)測(cè)定蛋白濃度。取20~40μg細(xì)胞總蛋白經(jīng)5×上樣緩沖液和30g/LSDS配平蛋白至同體積后進(jìn)行100g/LSDS,轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。以50g/L脫脂奶粉4℃封閉過夜,分別與兔抗LC3多克隆抗體(1∶800)、兔抗SMA多克隆抗體(1∶800)、兔抗COL1A2多克隆抗體(1∶800)、小鼠抗β-actin單克隆抗體(1∶1000)孵育過夜,洗滌后分別加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗或山羊抗小鼠二抗,加入底物化學(xué)發(fā)光試劑后X線片曝光,曝光顯影的目的條帶用Quatityone4.62軟件進(jìn)行半定量分析,以內(nèi)參為參考標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算出目的條帶標(biāo)準(zhǔn)化后的OD值,以此判斷蛋白相對(duì)表達(dá)量。每次檢查均采用不同樣本重復(fù)3次。1.2.5mtt法檢測(cè)細(xì)胞多樣性收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞懸液濃度,每孔加入200U,鋪板使細(xì)胞密度為1×104/孔濃度接種于96孔板中,空白調(diào)零孔只加不含細(xì)胞的培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)處理后,每孔加入5g/LMTT溶液20μL,繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄上清,加入150μLDMSO,避光振蕩15min,酶標(biāo)儀測(cè)定492nm處各孔OD值,計(jì)算各組的平均值。每組6復(fù)孔,計(jì)算各組的平均值。1.3均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差的計(jì)算應(yīng)用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ue0af±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2各組大鼠體內(nèi)-sma、型膠原、lc3的蛋白表達(dá)水平比較與空白對(duì)照組比較,陽性對(duì)照組中α-SMA、Ⅰ型膠原的mRNA表達(dá)明顯增加,高劑量組表達(dá)明顯減少;與陽性對(duì)照組比較,低劑量組、高劑量組表達(dá)減少;與低劑量組比較,高劑量組表達(dá)明顯減少,見表1。與空白對(duì)照組比較,陽性對(duì)照組中α-SMA、Ⅰ型膠原、LC3Ⅱ的蛋白表達(dá)明顯增加,高劑量組表達(dá)明顯減少;與陽性對(duì)照組比較,低劑量組、高劑量組表達(dá)減少;與低劑量組比較,高劑量組表達(dá)明顯減少,見表2、圖1。與空白對(duì)照組比較,陽性對(duì)照組中細(xì)胞增殖活力明顯增加,高劑量組明顯減少;與陽性對(duì)照組比較,低劑量組、高劑量組減少;與低劑量組組比較,高劑量組明顯減少,見表2。3-ma與自噬抑制劑對(duì)乙醇誘導(dǎo)hsc活化的作用肝纖維化是酒精性肝病發(fā)病過程中的轉(zhuǎn)折點(diǎn),如能及時(shí)去除導(dǎo)致肝纖維化的不利因素則有可能中止肝纖維化的進(jìn)程,甚至使病變向良性方面轉(zhuǎn)歸。一旦發(fā)展成肝硬化,病變則不可逆轉(zhuǎn)。酒精性肝纖維化是多因素疾病,在肝纖維化發(fā)展過程中,乙醇代謝相關(guān)的氧化應(yīng)激,谷胱甘肽耗竭,蛋氨酸代謝異常,營養(yǎng)不良,Kupffer細(xì)胞激活所致的大量炎性細(xì)胞因子釋放,肝星狀細(xì)胞激活,免疫反應(yīng)及遺傳多態(tài)性等諸多因素均起到重要作用。研究認(rèn)為,HSC的增殖和激活是各類慢性肝病包括酒精性肝病發(fā)生肝纖維化的中心環(huán)節(jié)。當(dāng)細(xì)胞處于缺氧、能量代謝異常時(shí),常常通過自噬提高其自噬水平來維持細(xì)胞內(nèi)能量代謝供給。Thoen等研究發(fā)現(xiàn),HSCs活化過程中伴有其自噬水平的升高,若抑制HSCs自噬將顯著抑制其活化。Hernández-Gea等發(fā)現(xiàn)自噬作為細(xì)胞內(nèi)大分子物質(zhì)及細(xì)胞器,參與自我更新及能量代謝的重要生物學(xué)過程,在促進(jìn)HSC中能量代謝并維持HSC活化狀態(tài)中發(fā)揮了重要作用。劉曼等研究證實(shí)3-MA能影響HSC增殖活化,然而,乙醇刺激HSC后,HSC的活化水平如何,自噬水平是否會(huì)發(fā)生改變?nèi)匀晃粗?。因此若能有效控制乙醇誘導(dǎo)的肝纖維化的發(fā)生,將為治療酒精性肝硬化發(fā)生帶來的新希望。本研究所用的HSC-T6,系SV40轉(zhuǎn)染SD大鼠HSC而成,具有活化HSC的表型,能表達(dá)高水平的Ⅰ型膠原蛋白mRNA等,能檢測(cè)出自噬標(biāo)志性蛋白LC3Ⅱ的表達(dá),表明HSC-T6本身有一定的自噬水平。加入乙醇刺激后,自噬標(biāo)志性蛋白LC3Ⅱ的表達(dá)增加,表明乙醇刺激HSC-T6后能增加其自噬水平。3-MA是自噬調(diào)控信號(hào)通路Ⅲ型PI3K(hVps34)抑制劑,能抑制胞質(zhì)型LC3Ⅰ向自噬體膜蛋白LC3Ⅱ的轉(zhuǎn)化,從而抑制自噬水平。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),3-MA作用HSC-T6后,自噬水平隨著劑量的增加而下降,而α-SMA、Ⅰ型膠原的mRNA及蛋白的表達(dá)量亦隨自噬水平的降低而相應(yīng)的減少。這表明HSC自噬水平在維持其活化狀態(tài)中起到重要作用。為了明確自噬抑制劑對(duì)乙醇誘導(dǎo)的HSC的增殖情況,本實(shí)驗(yàn)采用了MTT法檢測(cè)不同劑量的自噬抑制劑對(duì)乙醇誘導(dǎo)的HSC增殖水平,結(jié)果表明,3-MA能顯著抑制HSC的增殖,并隨著濃度的升高,其抑制效應(yīng)越強(qiáng)。然而,自噬抑制劑對(duì)乙醇誘導(dǎo)的HSC活化的抑制作用是通過何種途徑實(shí)現(xiàn)仍不明確。有研究表明,乙醇所致氧化應(yīng)激是激活HSC的重要因素,過度攝入的乙醇及其代謝產(chǎn)物是引起肝臟內(nèi)氧化應(yīng)激的主要介質(zhì),這些代謝產(chǎn)物可以直接攻擊HSC促其活化,也能通過誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β、p38、NF-κB、JNK等信號(hào)通路和AP-1、MAPK等炎癥信號(hào)通路激活HSC細(xì)胞。Komatsu等發(fā)現(xiàn),自噬基因atg7敲除后小鼠自噬水平顯著下降,并伴有P62大量