生物質(zhì)譜分析課件

生物分析技術(shù)第5講生物質(zhì)譜分析

2011年10月生物分析技術(shù)第5講生物質(zhì)譜分析1第一節(jié)概述第二節(jié)質(zhì)譜儀第三節(jié)生物質(zhì)譜的應(yīng)用主要內(nèi)容第一節(jié)概述主要內(nèi)容2質(zhì)譜分析法(MassSpectroscope,MS)是將化合物形成離子或碎片離子，按質(zhì)荷比(m/z)的不同進行測定，從而進行成分分析和結(jié)構(gòu)分析的一種方法。根據(jù)質(zhì)譜分析法的結(jié)果（質(zhì)譜圖）所提供的信息可以進行有機物、無機物的定性和定量分析，生物大分子的結(jié)構(gòu)分析，同位素的測定及固體表面的結(jié)構(gòu)和組成分析。生物質(zhì)譜就是用于生物分子分析的質(zhì)譜技術(shù)。由于生物分子大多數(shù)以其高相對分子質(zhì)量區(qū)別于分子質(zhì)量在幾十到幾千的無機或有機小分子，因而，生物質(zhì)譜要求測定上萬甚至幾十萬的分子質(zhì)量。第一節(jié)概述質(zhì)譜分析法(MassSpectrosco3早期，質(zhì)譜分析法僅限于小分子和中等分子的研究，因為要將質(zhì)譜應(yīng)用于生物大分子需要將其制備成氣相帶電分子，然后在真空中物理分解成離子。如何使蛋白分子經(jīng)受住離子化過程而又不喪失其結(jié)構(gòu)形態(tài)是個難題。20世紀70年代，解吸技術(shù)的出現(xiàn)成功地將蛋白分子轉(zhuǎn)化成氣相離子，而后快原子轟擊與其緊密相關(guān)的溶液基質(zhì)使得具有極性、熱不穩(wěn)定的蛋白分子可經(jīng)受住電離過程。但這些方法僅限于10kD以下蛋白分子的研究。80年代電噴霧電離(ESI)和基質(zhì)輔助激光解吸電離(MAILDI)技術(shù)的發(fā)展則使得質(zhì)譜方法成功應(yīng)用于高分子量蛋白分子的研究。早期，質(zhì)譜分析法僅限于小分子和中等分子的研41906年J.JThomson在實驗中發(fā)現(xiàn)帶電荷離子在電磁場中的運動軌跡與它的質(zhì)荷比有關(guān)并于1912年制造出第一臺質(zhì)譜儀1946年飛行時間質(zhì)量分析器1953年四極桿質(zhì)量分析器1959年質(zhì)譜儀首次用于多肽測序1965年離子共振質(zhì)譜

1968年電噴霧離子源1974年傅里葉變換離子回旋共振分析器1987年基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜質(zhì)譜儀的發(fā)展歷史1906年J.JThomson在實驗中5日本科學(xué)家田中耕一(KoichiTanaka)1959年出生于日本富山縣首府富山市，1983年獲日本東北大學(xué)學(xué)士學(xué)位，現(xiàn)任職于京都市島津制作所，為該公司研發(fā)工程師，分析測量事業(yè)部生命科學(xué)商務(wù)中心、生命科學(xué)研究所主任。他對化學(xué)的貢獻類似于約翰·芬恩，因此也得到了1／4的獎金。美國科學(xué)家約翰·芬恩1917年出生于美國紐約市，1940年獲耶魯大學(xué)化學(xué)博士學(xué)位，1967年到1987年間任該大學(xué)教授，1987年起被聘為該大學(xué)名譽教授，自1994年起任弗吉尼亞聯(lián)邦大學(xué)教授。他因為“發(fā)明了對生物大分子進行確認和結(jié)構(gòu)分析的方法”和“發(fā)明了對生物大分子的質(zhì)譜分析法”而獲得今年諾貝爾化學(xué)獎1／4的獎金。瑞士科學(xué)家?guī)鞝柼亍ぞS特里希1938年生于瑞士阿爾貝格，1964年獲瑞士巴塞爾大學(xué)無機化學(xué)博士學(xué)位，從1980年起擔(dān)任瑞士蘇黎世聯(lián)邦高等理工學(xué)校的分子生物物理學(xué)教授，還任美國加利福尼亞州拉霍亞市斯克里普斯研究所客座教授。他因“發(fā)明了利用核磁共振技術(shù)測定溶液中生物大分子三維結(jié)構(gòu)的方法”而獲得2002年諾貝爾化學(xué)獎一半的獎金。2002年諾貝爾化學(xué)獎獲得者日本科學(xué)家田中耕一(KoichiTanaka)1959年出6第二節(jié)質(zhì)譜儀一、質(zhì)譜儀的工作原理二、質(zhì)譜儀的基本結(jié)構(gòu)1.真空系統(tǒng)2.進樣系統(tǒng)3.離子源4.質(zhì)量分析器5.檢測與記錄第二節(jié)質(zhì)譜儀一、質(zhì)譜儀的工作原理7離子源質(zhì)量過濾/分析器樣品板LC或GCEI源FAB源MALDI源ESI源QuadruopoleIontrapTime-of-flight電子倍增器閃爍計數(shù)器+++++++++++++++++++++++++++++++++++++一、質(zhì)譜儀的工作原理樣品導(dǎo)入系統(tǒng)檢測器離子源質(zhì)量過濾/分析器樣品板EI源Quadruopole電子8

zU=(1/2)m

2m/z=2U/

2化合物分子在高真空條件下，受高速電子流“轟擊”或強電場其他作用，失去電子生成離子或發(fā)生化學(xué)鍵斷裂成為碎片離子，離子經(jīng)加速器進入磁場，其動能與加速電壓及電荷遵循：具有速度的帶電離子進入質(zhì)譜分析器的電磁場中，根據(jù)所選擇的分離方式，最終各種離子按質(zhì)荷比的不同實現(xiàn)分離。zU=(1/2)m2化合物分子在高真空條9質(zhì)譜儀的分類質(zhì)譜儀的分類10二、質(zhì)譜儀的基本結(jié)構(gòu)質(zhì)譜儀的構(gòu)造和功能計算機控制與數(shù)據(jù)處理1.真空系統(tǒng)2.進樣系統(tǒng)3.離子源4.質(zhì)量分析器5.檢測與記錄二、質(zhì)譜儀的基本結(jié)構(gòu)質(zhì)譜儀的構(gòu)造和功能計算機控制與數(shù)據(jù)處理111質(zhì)譜儀的離子源、質(zhì)量分析器和檢測器必須在高真空狀態(tài)下工作，一般應(yīng)在10-5～10-6Pa。

(1)真空度差，過多的氧氣將損耗或燒毀離子源的燈絲；

(2)高本低氣壓將干擾質(zhì)譜圖;

(3)電離空氣壓過高，會發(fā)生離子-分子反應(yīng)，改變碎片譜圖；(4)離子源內(nèi)的高氣壓將干擾電子束的調(diào)節(jié)；(5)電離氣或離子源內(nèi)的高氣壓，可能引起高達數(shù)千伏的離子加速電壓放電。1.真空系統(tǒng)質(zhì)譜儀的離子源、質(zhì)量分析器和檢測器必須在高真空狀態(tài)下工作，一12一般質(zhì)譜儀由機械真空泵(低真空泵)，擴散泵或分子泵(高真空泵)組成真空機組，使離子源和分析器部分的達到真空。只有在足夠高的真空下，離子才能從離子源到達接收器，真空度不夠則靈敏度低。一般質(zhì)譜儀由機械真空泵(低真空泵)，擴散泵或分子泵(高真空泵132.進樣系統(tǒng)要求：高效重復(fù)的將樣品引入到離子源中并且不能造成真空度的降低，而樣品導(dǎo)入離子源的方式?jīng)Q定于樣品的物理性質(zhì)。方式：

(1)間歇式進樣系統(tǒng)

(2)直接探針進樣

(3)毛細管進樣（從HPLC、GC及CE）

2.進樣系統(tǒng)要求：14(1)間歇式進樣系統(tǒng)可用于氣體、液體和中等蒸汽壓的固體樣品進樣，通過可拆卸式的試樣管將少量固體或液體試樣引入試樣儲存器中。由于進樣系統(tǒng)的低壓強及儲存器的加熱裝置，使試樣保持氣態(tài)。加之進樣系統(tǒng)的壓強比離子源的壓強大，樣品分子或離子可以通過分子漏隙以分子流的形式滲透進高真空的離子源。(1)間歇式進樣系統(tǒng)可用于氣體、液體和中等15(2)直接探針進樣通常將試樣放入小杯中，通過真空閉鎖裝置將其引入離子源，可以對樣品杯進行冷卻或加熱處理。(2)直接探針進樣通常將試樣放入小杯中，通16對于在間歇式進樣系統(tǒng)的條件下無法變成氣體的固體、熱敏性固體及非揮發(fā)性液體試樣，可直接引入到離子源。這種進樣方式不必使樣品充滿整個儲存器，因此，可適用樣品量較小和蒸汽壓較低的物質(zhì)。直接進樣法擴大了質(zhì)譜法的應(yīng)用范圍。對于在間歇式進樣系統(tǒng)的條件下無法變成氣體的17(3)毛細管進樣氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀

從毛細管氣相色譜柱流出的成分可直接引入質(zhì)譜儀的離子化室。(3)毛細管進樣氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀18液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀

采用離子噴霧及電噴霧技術(shù)除去流動相使樣品離子進入質(zhì)譜分析儀。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀19質(zhì)譜儀中產(chǎn)生離子的裝置稱為離子源，其功能是將進樣系統(tǒng)引入的氣態(tài)樣品分子轉(zhuǎn)化成離子。不同的分子離子化所需要的能量不同，因此，應(yīng)選擇不同的離解方式：硬電離：能給予樣品較大能量的電離方法。軟電離：給予較小能量的電離方法，適用于易破裂或易電離的樣品。3.離子源質(zhì)譜儀中產(chǎn)生離子的裝置稱為離子源，其功能是將進樣系統(tǒng)20(1)電子轟擊電離源(ElectronImpactIonization,簡稱EI):樣品需經(jīng)過汽化進入電離區(qū)，用約70eV能量的電子束與氣化的試樣分子相互作用，使分子中電離電位較低的價電子或非鍵電子電離，為硬電離方法。1980年以前的主要離子化方式，只能用于有機小分子

(400Da以下)的電離。

質(zhì)譜技術(shù)中的離子源(1)電子轟擊電離源(ElectronImpactIo21電子轟擊電離的優(yōu)缺點優(yōu)點靈敏度高；有達10萬個化合物的數(shù)據(jù)庫可快速檢索；可根據(jù)碎片方式鑒定未知物；從碎片離子判定結(jié)構(gòu)。缺點質(zhì)量范圍??；有可能汽化前發(fā)生解離；碎片過多有時看不到分子離子。電子轟擊電離的優(yōu)缺點優(yōu)點22質(zhì)譜技術(shù)中的離子源(2)化學(xué)電離源(ChemicalIonization,簡稱CI):高能電子束與小分子反應(yīng)氣（如甲烷、丙烷等）作用，使其電離生成初級離子，這些初級離子在與試樣分子反應(yīng)得到試樣離子，核心是質(zhì)子轉(zhuǎn)移。(3)場電離(FieldIonization,簡稱FI):在相距很近的電極間施加高電壓，產(chǎn)生強電場，依靠這個強電場將附近的試樣分子中的電子拉出來，使之形成離子。質(zhì)譜技術(shù)中的離子源(2)化學(xué)電離源(ChemicalIo23質(zhì)譜技術(shù)中的離子源(4)快原子轟擊源(FastAtomBombardment，簡稱FAB):20世紀80年代發(fā)展起來的新離子化方法，是讓稀有氣體（氙氣或氬氣）電離，通過電場加速，獲得較高動能成為快原子，然后轟擊試樣分子，通過能量的轉(zhuǎn)移，使試樣分子電離。質(zhì)譜技術(shù)中的離子源(4)快原子轟擊源(FastAtom24快原子轟擊技術(shù)優(yōu)點：分子離子和準分子離子峰強；碎片離子峰豐富；靈敏度高，適用于熱不穩(wěn)定、極性強的分子，如肽類、蛋白質(zhì)、多糖、金屬有機物等?？煸愚Z擊技術(shù)缺點：試樣涂在金屬板上，溶劑也被電離，使質(zhì)譜圖復(fù)雜化。快原子轟擊技術(shù)優(yōu)點：快原子轟擊技術(shù)缺點：25質(zhì)譜技術(shù)中的離子源(5)大氣壓化學(xué)電離源(AtmosphericPressureChemicalIonization，簡稱APCI):主要用于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，主要用來分析中等極性、弱極性化合物。APCI主要產(chǎn)生單電荷離子，分析化合物的相對分子質(zhì)量一般小于1000.質(zhì)譜技術(shù)中的離子源(5)大氣壓化學(xué)電離源(Atmosphe26APCI主要部件是一個雙層套管組成的電噴霧的噴嘴，噴嘴內(nèi)層是液相色譜流出物，外層是霧化氣，通常為大流量的N2，其作用是使噴出的液體分散成微滴。在噴嘴的下游有一個針狀放電電極，通過放電電極的高壓放電，使空氣中某些中性分子電離，產(chǎn)生H3O+,N2+,O2+等離子，這些離子與分析物分子進行離子-分子反應(yīng)，使分析物分子離子化。APCI主要部件是一個雙層套管組成的電噴霧27(6)電噴霧電離(ElectrosprayIonization，簡稱ESI):是一種使用強靜電場的電離技術(shù)。它主要應(yīng)用于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀或毛細管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用儀，既作為色譜和質(zhì)譜之間的接口裝置，同時又是電離裝置。質(zhì)譜技術(shù)中的離子源(6)電噴霧電離(ElectrosprayIonizat28電噴霧電離是在“離子蒸發(fā)”的原理基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種離子化方法。待測分子溶解在溶劑中，以液相方式通過毛細管到達噴口，在噴口高電壓作用下形成帶電荷的微滴，隨著微滴中的揮發(fā)性溶劑蒸發(fā)，微滴表面的電荷體密度隨微滴半徑的減少而增加，到達某一臨界點時，樣品將以離子方式從液滴表面蒸發(fā)，進入氣相，即實現(xiàn)了樣品的離子化，由于沒有直接的外界能量作用于分子，因此，對分子結(jié)構(gòu)破壞較少，是一種典型的軟電離方式。電噴霧電離是在“離子蒸發(fā)”的原理基礎(chǔ)上發(fā)展29電噴霧電離最大特點是容易形成多電荷離子，因此，在較小的m/z范圍內(nèi)可以檢測到大分子質(zhì)量的分子。電噴霧質(zhì)譜目前可測定分子質(zhì)量在100.000Da以下的蛋白質(zhì)，最高達150.000Da。適宜相對分子質(zhì)量大、穩(wěn)定性差的化合物，如極性強的大分子有機化合物，蛋白質(zhì)、肽、糖等。除分析大分子外，電噴霧質(zhì)譜也可分析小分子，對于分子量在1000Da以下的小分子，也可得到物質(zhì)的分子質(zhì)量。電噴霧電離最大特點是容易形成多電荷離子，因30影響電噴霧電離的因素：樣品的pKa和溶液的pH樣品離子取決于樣品在噴霧溶液中是否形成離子，正離子檢測中，溶液pH應(yīng)較低，負離子檢測，溶液pH應(yīng)較高。溶劑的性質(zhì)用于電噴霧電離的溶劑應(yīng)能使樣品在溶液中形成離子，既有較低的溶劑化能力以利于離子蒸發(fā)，具有較低的黏度和表面張力以利于霧化以及具有較低熱容量以利于溶劑化。影響電噴霧電離的因素：31電噴霧電離優(yōu)缺點優(yōu)點測定分子質(zhì)量高；靈敏度極高（10-15mol）；軟電離，可觀察生物分子非共價反應(yīng)；易于和LC串聯(lián)，直接分析流速為1ml/min的LC洗脫液；沒有基質(zhì)干擾；適于四極桿質(zhì)量分析器、離子阱質(zhì)量分析器做結(jié)構(gòu)分析；帶多電荷，允許質(zhì)量范圍窄的設(shè)備檢測高質(zhì)量數(shù)的離子，通過計算平均值給出更精確的質(zhì)量數(shù)；特別適于測多肽的修飾；樣品前處理簡單可直接分析RP-HPLC脫鹽處理的溶液。電噴霧電離優(yōu)缺點優(yōu)點32電噴霧電離優(yōu)缺點缺點耐鹽能力低；對某些化合物特別敏感，污染難清洗；樣品需先氣化；帶多電荷，在分析混合物時，產(chǎn)生混亂；定量時需內(nèi)校準。電噴霧電離優(yōu)缺點缺點33電噴霧與大氣壓化學(xué)電離的比較電離機理：電噴霧采用離子蒸發(fā)，而APCI電離是高壓放電發(fā)生了質(zhì)子轉(zhuǎn)移而生成[M＋H]+或[M-H]-離子。樣品流速：APCI源可從0.2到2ml／min；而電噴霧源允許流量相對較小,一般為0.2-1ml／min.斷裂程度；APCI源的探頭處于高溫，對熱不穩(wěn)定的化合物就足以使其分解.適用性：通常認為電噴霧有利于分析極性大的小分子和生物大分子及其它分子量大的化合物，而APCI更適合于分析極性較小的化合物。多電荷：APCI源不能生成一系列多電荷離子電噴霧與大氣壓化學(xué)電離的比較電離機理：電噴霧采用離子蒸發(fā)，而34(7)基質(zhì)輔助激光解吸離子化(MatrixAssistedLaserDesorption，簡稱MALDI):是近20年發(fā)展起來的離子化技術(shù)，特別適用于蛋白質(zhì)、多肽、寡核苷酸等生物大分子的離子化。通常用飛行時間檢測器作為質(zhì)量分析器，構(gòu)成基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜?？捎糜谏锎蠓肿游镔|(zhì)分子量的測定；蛋白質(zhì)高通量鑒定；有機小分子化合物分子量測定；寡核苷酸的分析；基因的單核苷酸多態(tài)性的分析等。質(zhì)譜技術(shù)中的離子源(7)基質(zhì)輔助激光解吸離子化(MatrixAssiste35基質(zhì)輔助激光解吸電離工作原理基質(zhì)輔助激光解吸離子化引入了固體基質(zhì)，使樣品液與基質(zhì)液混合，滴于靶面，在真空中快速干燥，制成極細的混晶。當激光束照射在涂有樣品和基質(zhì)混晶的靶面上時，基質(zhì)的有機分子在固態(tài)混晶中共振吸收能量，并將能量傳遞到基質(zhì)有機物晶體的晶格中，使晶格受到瞬時強烈擾動而解吸出離子或中性分子，并通過這些離子或分子將吸收的能量傳遞給生物大分子而使其電離?；|(zhì)輔助激光解吸離子化原理基質(zhì)輔助激光解吸電離工作原理基質(zhì)輔助激光解吸36基質(zhì)輔助激光解吸離子化特點

①基質(zhì)輔助激光解吸離子化中，激光的能量大量消耗于晶格擾動中，并不是直接作用與生物大分子使之裂解，因此是一種非常溫和的離子化方式；

②激光采用N2激光源，波長為337nm，為脈沖式工作方式；

③基質(zhì)輔助激光解吸電離源與飛行時間質(zhì)量分析儀所構(gòu)成的質(zhì)譜儀，得到的質(zhì)譜信息主要是分子離子、準分子離子，而碎片離子和多電荷離子較少?；|(zhì)輔助激光解吸離子化特點①基質(zhì)輔助激光解37基質(zhì)輔助激光解吸電離源的關(guān)鍵是使用基質(zhì)來實現(xiàn)軟電離，基質(zhì)的具體作用：從激光束吸收激光能量并轉(zhuǎn)變?yōu)槟巯嗟募ぐl(fā)能；基質(zhì)包圍樣品分子，使之相互隔離，限制聚集體的形成，避免聚集體大分子對解吸和分析的影響；促進樣品分子的離子化過程?；|(zhì)輔助激光解吸電離源的關(guān)鍵是使用基質(zhì)來實現(xiàn)38基質(zhì)輔助激光解吸電離源的基質(zhì)種類很多，對于不同的分析對象應(yīng)選擇不同的基質(zhì)，否則對分析結(jié)果影響很大。基質(zhì)必須滿足一些共性：在合適溶劑中具有良好的溶解性；對激光具有良好的吸收性能，以使能量在基質(zhì)中積累；合適的反應(yīng)活性?；|(zhì)輔助激光解吸電離源的基質(zhì)種類很多，對于不39常用基質(zhì)基質(zhì)縮寫適用范圍α-氰基-4-羥基肉桂酸HCCA生物高分子、糖蛋白、肽類、有機化合物、聚合物等3,5-二甲氧基-4-羥基肉桂酸SA蛋白質(zhì)、肽類、氨基酸2,5-二羥基苯甲酸DHB200～1000Da的有機化合物、氨基酸、肽類及糖蛋白3-羥基吡啶甲酸HPA約10000Da的聚合物、肽類、寡核苷酸、糖蛋白、糖肽及水溶性聚合物2,4,6-三羥基苯乙酮THAP蛋白質(zhì)、肽類、氨基酸2,6-二羥基苯乙酮DHAP糖蛋白、糖肽、磷酸化肽常用基質(zhì)基質(zhì)縮寫適用范圍α-氰基-4-羥基肉桂酸HCCA生物40基質(zhì)輔助激光電離源的優(yōu)缺點優(yōu)點質(zhì)量數(shù)可達300,000Da；10-15至10-18級靈敏度；軟電離方式，無或極少碎片離子；耐鹽（樣品含鹽可達毫摩爾濃度）；適于分析復(fù)雜混合物。缺點分辨率低；1000Da以下基質(zhì)峰干擾；激光解吸附離子化有可能使樣品光降解；不能分析非共價鍵相互作用；定量時需要內(nèi)校準；如沒有反射飛行裝置，不能分析多肽修飾?；|(zhì)輔助激光電離源的優(yōu)缺點優(yōu)點缺點414.質(zhì)量分析器質(zhì)譜儀的質(zhì)量分析器位于離子源和檢測器之間，依據(jù)不同的方式將樣品離子按質(zhì)荷比分開。離子通過分析器后，按不同質(zhì)荷比(m/z)分開，將相同的m/z離子聚焦在一起。質(zhì)量分析器的類型：(1)磁分析器(2)四極桿分析器(3)離子阱(4)飛行時間分析器(5)傅立葉變換離子回旋共振分析器4.質(zhì)量分析器質(zhì)譜儀的質(zhì)量分析器位于離子源42(1)磁分析器磁分析器依據(jù)不同質(zhì)量的離子在磁場中有不同的運動行為，從而將離子分開。主要有兩種形式單聚焦分析器和雙聚焦分析器。(1)磁分析器磁分析器依據(jù)不同質(zhì)量的離子在磁43單聚焦分析器只有一個磁場，當磁場強度和加速電場的電壓不變時，離子運動的軌道半徑僅僅取決于離子本身的質(zhì)荷比(m／z)。因此，具有不同質(zhì)荷比的離子，由于運動半徑的不同而被分析器分開。缺點是分辨率較低，設(shè)計良好的單聚焦分析器的分辨率可達5000。它只適、化學(xué)電離源。合于離子能量分散較小的離子源，如電子轟擊源單聚焦分析器單聚焦分析器只有一個磁場，當磁場強度和加速電場的電44雙聚焦分析器在單聚焦分析器中，離子源產(chǎn)生的離子在進入加速電場之前，其初始能量并不為零，且各不相同。若具有相同的質(zhì)荷比的離子，其初始能量存在差異，在通過分析器后，是不能完全聚焦在一起。為了解決離子能量分散的問題，提高分辨率，可采用雙聚焦分析器。所謂雙聚焦，是指同時實現(xiàn)方向聚焦和能量聚焦。雙聚焦分析器除了磁場外，還有一個靜電場，具有質(zhì)量色散和能量色散，能夠?qū)崿F(xiàn)方向聚焦。雙聚焦分析器在單聚焦分析器中，離子源產(chǎn)生的離45(2)四極分析器由四根截面為雙曲面或圓形的棒狀電極組成，兩組電極間施加一定的直流電壓和頻率為射頻范圍的交流電壓。(2)四極分析器由四根截面為雙曲面或圓形的棒46四極質(zhì)量分析器的工作原理與扇形磁場是不同的。扇形磁場靠離子動量的差別而把不同質(zhì)荷比的離子分開，而四極質(zhì)量分析器則是靠質(zhì)荷比不同把離子分開。四極質(zhì)量分析器又稱四極濾質(zhì)器。當離子束進入筒形電極所包圍的空間后，離子作橫向擺動，在一定的直流電壓、交流電壓和頻率，以及一定的尺寸等條件下，只有某一種（或某一范圍）質(zhì)荷比的離子能夠到達收集器并發(fā)出信號（稱共振離子），其它離子在運動的過程中撞擊在筒形電極上而被“過濾”掉，最后被真空泵抽走（稱為非共振離子）。四極質(zhì)量分析器的工作原理與扇形磁場是不同的。47因此，四極場只允許一種具有適當穩(wěn)定振幅質(zhì)荷比的離子通過。四個電極上的交流和直流電壓從零到一最大值同步增加，可使不同質(zhì)荷比的離子依次分離，按順序通過四極場實現(xiàn)質(zhì)量掃描。其掃描范圍可由交流和直流的電壓來調(diào)節(jié)。如果使交流電壓的頻率不變而連續(xù)地改變直流和交流電壓的大小（但要保持它們的比例不變，電壓掃描），或保持電壓不變而連續(xù)地改變交流電壓的頻率（頻率掃描），就可使不同質(zhì)荷比的離子依次到達收集器而得到質(zhì)譜圖。因此，四極場只允許一種具有適當穩(wěn)定振幅質(zhì)48優(yōu)點：①分辨率較高；②分析速度極快，滿質(zhì)量范圍掃描一般只需幾毫秒；③制作工藝簡單，儀器緊湊，最適合與氣相色譜和高效液相色譜儀聯(lián)用。缺點：①質(zhì)量測量上限為2000～4000Da；②準確度和精密度低于磁偏轉(zhuǎn)型質(zhì)量分析器。四極質(zhì)量分析器的優(yōu)缺點優(yōu)點：四極質(zhì)量分析器的優(yōu)缺點49離子阱分析器近幾年開始作為一種簡易的質(zhì)譜儀而出現(xiàn)的，一般與毛細管氣相色譜儀聯(lián)用。它的離子源與質(zhì)量分析器同處一室。由色譜儀流出的組分直接送入兼作離子源和分析器的阱內(nèi)。(3)離子阱離子阱的特點是結(jié)構(gòu)小巧，質(zhì)量輕，靈敏度高，而且還有多級質(zhì)譜功能，它可以用于GC-MS，也可以用于LC-MS。離子阱分析器近幾年開始作為一種簡易的質(zhì)譜儀50離子阱的主體是一個環(huán)電極和上下兩個端蓋電極，環(huán)電極和上下兩端蓋電極都是繞z軸旋轉(zhuǎn)的雙曲面，直流電壓U和射頻電壓V加在環(huán)電極和端蓋電極之間。

離子阱的主體是一個環(huán)電極和上下兩個端蓋電極，51離子阱構(gòu)造離子阱構(gòu)造52飛行時間質(zhì)量分析器（timeofflightanalyzer）的主要部分是一個離子漂移管。樣品受到陰極燈絲發(fā)出的電子轟擊后變成離子，柵極G1上的負脈沖將離子引出離子室，G1，G2間的直流電壓差使離子受到加速并進入無場漂移管，最終按m／z值不同先后到達離子接收極。(4)飛行時間分析器1-電離室；2-電子接收極；3-陰極；4-離子接收極飛行時間質(zhì)量分析器（timeoffl53根據(jù)離子運動動能與電場勢能的關(guān)系式：可以推導(dǎo)為：離子以速度ν進入漂移區(qū)，假定離子在漂移區(qū)飛行的時間為T，漂移區(qū)長度為L，則可得：根據(jù)離子運動動能與電場勢能的關(guān)系式：可以推導(dǎo)為：離54因此，離子在漂移管中飛行的時間與離子質(zhì)量的平方根成正比。對于能量相同的離子，離子的質(zhì)量越大，達到接收器所用的時間越長，質(zhì)量越小，所用時間越短。根據(jù)這一原理，可以把不同質(zhì)量的離子分開。飛行時間質(zhì)量分析器的特點是質(zhì)量范圍寬，掃描速度快，既不需要電場，也不需要磁場。但是，存在分辨率低這一缺點。因此，離子在漂移管中飛行的時間與離子質(zhì)量的55造成分辨率低的主要原因在于離子進入漂移管前的時間分散、空間分散和能量分散。這樣，即使是質(zhì)量相同的離子，由于產(chǎn)生時間的先后不同，產(chǎn)生空間位置不同和初始動能的不同，達到檢測器的時間就不相同，因而降低了分辨率。目前，采用離子延遲引出技術(shù)和離子反射技術(shù)，可以在很大程度上克服上述3個原因造成的分辨率下降。造成分辨率低的主要原因在于離子進入漂移管前的56通過離子反射技術(shù)，質(zhì)量相同能量不同的離子進入反射器后，能量大的離子速度快，但走的距離遠，能量小的離子速度慢，但走的距離近，經(jīng)過反射后，二者同時到達檢測器，這樣就消除了由于能量分散造成的分辨率降低。1-離子源；2-檢測器；3-反射器通過離子反射技術(shù)，質(zhì)量相同能量不同的離子進入57離子不是直線飛行，而是在中途被反射后再到達檢測器。這種方法有兩點好處:①系統(tǒng)具有“雙聚焦”功能，相同質(zhì)量不同能量的離子被反射后能同時到達檢測器；②離子的飛行路程增加了一倍。兩者均有助于提高儀器的分辨率。飛行時間質(zhì)譜儀的分辨率可達20000以上，最高可檢質(zhì)量超過300000Da，并且具有很高的靈敏度。離子不是直線飛行，而是在中途被反射后再到達檢58生物質(zhì)譜分析課件59(5)傅立葉變換離子回旋共振分析器傅里葉變換離子回旋共振分析器（Fouriertransformioncyclotronresonanceanalyzer，F(xiàn)TICR）是在原來回旋共振分析器的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。假定質(zhì)荷比為m/z的離子進入磁感應(yīng)強度為B的磁場中，由于受磁場力的作用，離子做圓周運動（半徑R），如果沒有能量的損失和增加，圓周運動的離心力和磁場力相平衡，可得到：為離子運動的回旋頻率（單位為弧度/秒）(5)傅立葉變換離子回旋共振分析器傅里葉變換離子60可以看出，離子的回旋頻率與離子的質(zhì)荷比成線性關(guān)系，當磁場強度固定后，只需精確測得離子的共振頻率，就能準確地得到離子的質(zhì)量。測定離子共振頻率的辦法是外加一個射頻輻射，如果外加射頻頻率等于離子共振頻率，離子就會吸收外加輻射能量而改變圓周運動的軌道，作螺旋加速運動，離子收集器放在適當?shù)奈恢镁湍苁盏焦舱耠x子。改變輻射頻率，就可以接收到不同的離子?？梢钥闯觯x子的回旋頻率與離子的質(zhì)荷比成線性61普通的回旋共振分析器掃描速度很慢，靈敏度低，分辨率也很差。傅里葉變換離子回旋共振分析器采用了線性調(diào)頻脈沖來激發(fā)離子，即在很短的時間內(nèi)進行快速頻率掃描，使很寬范圍分布的質(zhì)荷比離子幾乎同時受到激發(fā)，因而掃描速度和靈敏度比普通回旋共振分析器高得多。

普通的回旋共振分析器掃描速度很慢，靈敏度低，62傅里葉變換離子回旋共振分析器示意圖質(zhì)量分析室是一個立方體結(jié)構(gòu)，由3對相互垂直的平行板電極組成，置于高真空和由超導(dǎo)磁體產(chǎn)生的強磁場中。第一對電極為捕集極，它與磁場方向垂直，電極上加有適當正電壓，其目的是延長離子在室內(nèi)的滯留時間；第二對電極為發(fā)射極，用于發(fā)射射頻脈沖；第三對電極為接收極，用來接收離子產(chǎn)生的信號。傅里葉變換離子回旋共振分析器示意圖質(zhì)量分63樣品離子引入分析室后，在強磁場作用下被迫以很小的軌道半徑做回旋運動，由于離子都是以隨機的方式運動，因此不產(chǎn)生可檢出的信號。如果在發(fā)射極上施加一個很快的掃頻電壓，當射頻頻率和某離子的回旋頻率一致時，共振條件得到滿足。離子吸收射頻能量，軌道半徑逐漸增大，變成螺旋運動，經(jīng)過一段時間的相互作用和能量傳遞，所有離子都做共振運動，產(chǎn)生可被檢出的信號。樣品離子引入分析室后，在強磁場作用下被迫以64共振運動的正離子運動至靠近接收極的一個極板時，吸收此極板表面的電子，當其繼續(xù)運動到另一極板時，又會吸引另一極板表面的電子。這樣便會感生出所謂的“相電流”。相電流是一種正弦形式的時間域信號，正弦波的頻率和離子的固有回旋頻率相同，其振幅則與分析室中該質(zhì)量的離子數(shù)目成正比。共振運動的正離子運動至靠近接收極的一個極板時65如果分析室中各種質(zhì)量的離子都滿足共振條件，那么，實際測得的信號是同一時間內(nèi)做共振軌道運動的各種離子所對應(yīng)的正弦波信號的疊加。將測得的時間域信號重復(fù)累加，放大并經(jīng)模數(shù)轉(zhuǎn)換后輸入計算機進行快速傅里葉變換，便可檢出各種頻率成分，然后利用頻率和質(zhì)量的已知關(guān)系，便可得到常見的質(zhì)譜圖。

如果分析室中各種質(zhì)量的離子都滿足共振條件，那66FT-MS有很多明顯的優(yōu)點：①分辨率極高，商品儀器的分辨可超過106。②分析靈敏度高，且在高靈敏度下可以得到高分辨率。③具有多級質(zhì)譜功能。④可以和任何離子源相連，拓展了儀器功能。⑤掃描速度快，性能穩(wěn)定可靠，質(zhì)量范圍寬。當然，F(xiàn)T-MS由于需要很高的超導(dǎo)磁場，因而需要液氦，儀器售價和運行費用都比較貴。FT-MS有很多明顯的優(yōu)點：67幾種質(zhì)量分析器優(yōu)缺點對比優(yōu)點缺點磁分析器價廉分子離子分辨率低。四極桿質(zhì)量精度高，分辨率好碰撞能量低，碎片不完全離子阱相對價廉，質(zhì)量精度高，分辨率好，適合多級質(zhì)譜低能量碰撞TOF質(zhì)量精度高，分辨率好，ESI、MALDI均可接需高真空，價高FTMS質(zhì)量精度最高，分子離子分辨率好，非常適合多級質(zhì)譜低能量碰撞，需超導(dǎo)磁體，價高幾種質(zhì)量分析器優(yōu)缺點對比優(yōu)點缺點磁分析器價廉分子離子分辨率低685.檢測與記錄電子倍增器是現(xiàn)代質(zhì)譜儀廣泛使用的檢測裝置。一般具有10～20個電極（鈹銅合金或其他材料）。檢測5.檢測與記錄電子倍增器是現(xiàn)代質(zhì)譜儀廣泛使用的檢測69從質(zhì)量分析器射出的具有一定能量的離子，打在第一極上并產(chǎn)生較多的二次電子，這些電子打在第三極上又產(chǎn)生數(shù)量更多的三次電子，在每一極上都重復(fù)這一過程。這樣經(jīng)過多極使電子不斷倍增，最后被檢測。電子倍增器響應(yīng)快，靈敏度高。隨著使用時間的延長，電極會老化，增益會降低，具有一定的壽命。從質(zhì)量分析器射出的具有一定能量的離子，打在第70信號增益與倍增器電壓有關(guān)，提高倍增器電壓可以提高靈敏度，但同時會降低倍增器的壽命，因此，應(yīng)該在保證儀器靈敏度的情況下，采用盡量低的倍增器電壓。由倍增器出來的電信號被送入計算機儲存，這些信號經(jīng)計算機處理后可以得到色譜圖、質(zhì)譜圖及其他各種信息。質(zhì)譜儀常用的檢測器還有閃爍檢測器、法拉第杯和照相底板等。

信號增益與倍增器電壓有關(guān)，提高倍增器電壓可71光電轉(zhuǎn)換倍增器（閃爍計數(shù)器）電子發(fā)射撞擊熒光屏，熒光屏發(fā)射光子由光子放大器檢測。光子放大器密封在容器中，光子可穿過密封玻璃，避免表面污染，壽命為5年。光電轉(zhuǎn)換倍增器（閃爍計數(shù)器）電子發(fā)射撞擊熒72記錄現(xiàn)代質(zhì)譜儀一般都配有高性能計算機，應(yīng)用功能強大的操作軟件，設(shè)置儀器工作參數(shù)，采集和處理數(shù)據(jù)，打印出報告。記錄現(xiàn)代質(zhì)譜儀一般都配有高性能計算機，應(yīng)用功73第三節(jié)生物質(zhì)譜的應(yīng)用生物質(zhì)譜主要用于解決兩個生物大分子的分析問題：其一是精確測定生物大分子，如蛋白質(zhì)、核苷酸和糖類等的分子量，并提供它們的分子結(jié)構(gòu)信息；其二是對存在于生命復(fù)雜體系中的相互作用。生物質(zhì)譜的應(yīng)用主要包括：一、生物質(zhì)譜在蛋白質(zhì)和多肽研究中的應(yīng)用二、生物質(zhì)譜在多糖結(jié)構(gòu)測定中的應(yīng)用三、生物質(zhì)譜在核酸分析中的應(yīng)用第三節(jié)生物質(zhì)譜的應(yīng)用生物質(zhì)譜主要用于解決74一、生物質(zhì)譜在蛋白質(zhì)和多肽研究中的應(yīng)用1.相對分子質(zhì)量測定2.肽譜測定3.肽序列測定4.蛋白質(zhì)翻譯后修飾5.蛋白質(zhì)組分定量分析6.蛋白質(zhì)相互作用研究一、生物質(zhì)譜在蛋白質(zhì)和多肽研究中的應(yīng)用1.相對分子質(zhì)量測定75相對分子質(zhì)量是蛋白質(zhì)、多肽、核酸、寡糖與多糖的最基本的物理參數(shù)之一，是蛋白質(zhì)、多肽識別與鑒定中首先要測定的參數(shù)，也是基因工程產(chǎn)品申報新藥的重要數(shù)據(jù)之一。相對分子質(zhì)量正確與否代表著所測定的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)正確與否，或者意味著一種新的蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn)。生物質(zhì)譜可測定分子質(zhì)量高達400kDa的生物大分子，準確度高達0.001%～0.1%，遠遠高于目前常規(guī)應(yīng)用的SDS電泳或高效凝膠色譜技術(shù)。1.相對分子質(zhì)量測定相對分子質(zhì)量是蛋白質(zhì)、多肽、核酸、寡糖與多糖762.肽譜測定肽譜：是蛋白質(zhì)經(jīng)過化學(xué)裂解或酶解后所獲得的多肽混合物的圖譜。肽譜分析結(jié)合蛋白質(zhì)的氨基酸分析、序列分析所得到綜合信息是鑒定蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的重要技術(shù)手段。通過質(zhì)譜獲得的肽譜又稱為肽質(zhì)量指紋圖譜，它是將蛋白質(zhì)經(jīng)酶解后得到的肽混合物進行質(zhì)譜分析，給出全部肽段的準確質(zhì)量，結(jié)合蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫檢索，可實現(xiàn)對蛋白質(zhì)的快速鑒別和高通量篩選，也成為目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究中必不可少的重要技術(shù)手段。2.肽譜測定肽譜：是蛋白質(zhì)經(jīng)過化學(xué)裂解或酶解77肽譜鑒定流程樣品酶解酶解片斷一級質(zhì)譜PMF肽指紋圖譜串聯(lián)質(zhì)譜對庫檢索序列數(shù)據(jù)庫成功鑒定PSMs及后篩選序列分析未知蛋白肽譜鑒定流程樣品酶解酶解片斷一級質(zhì)譜PMF串聯(lián)質(zhì)譜對庫序列數(shù)78胰蛋白酶酶解采用含乙腈的脫色液脫色至膠塊變?yōu)榘咨婵崭稍飪x中冷凍干燥胰蛋白酶酶解過夜采用含TFA和乙腈的溶液溶進行肽提取真空干燥采用含TFA和乙腈的溶液溶解樣品并點樣進行質(zhì)譜測試胰蛋白酶酶解采用含乙腈的脫色液脫色至膠塊變?yōu)榘咨?9質(zhì)譜分析MALDI-TOF/TOF4800質(zhì)譜儀先用MS反射模式得到一級圖譜一級質(zhì)譜激光掃描次數(shù):800次選擇5-10個母離子做MS/MS分析二級MS/MS激光掃描次數(shù):2000次，碰撞能量1KV質(zhì)譜分析MALDI-TOF/TOF4800質(zhì)譜儀80數(shù)據(jù)庫檢索采用GPSExplore(V3.6，ABI)軟件進行分析使用MASCOT（V2.1,MatrixScience,London,U.K）搜庫軟件對本地數(shù)據(jù)庫進行檢索檢索數(shù)據(jù)庫為NCBInr，切割的酶為trypsin，允許最大的未被酶切位點數(shù)為1,可變修飾為半胱氨酸乙酰胺化和甲硫氨酸氧化，沒有固定修飾，母離子質(zhì)量容差為50ppm，片段離子質(zhì)量容差為0.25Da數(shù)據(jù)庫檢索采用GPSExplore(V3.6，ABI)81肽指紋圖譜鑒定PMF（PeptideMassFingerprinting）是根據(jù)一級質(zhì)譜（MS）所測酶解片段的精確分子質(zhì)量鑒定蛋白質(zhì)的一種方法一般采用MALDI-TOF進行鑒定。因為MALDI質(zhì)譜圖中的離子一般只帶一個電荷，比較容易計算其原理就是利用了蛋白序列數(shù)據(jù)庫中的多肽質(zhì)量的信息與實際測得的質(zhì)量信息進行對比而實現(xiàn)鑒定肽指紋圖譜鑒定PMF（PeptideMassFinger82優(yōu)點與缺點優(yōu)點：一級質(zhì)譜鑒定蛋白質(zhì)的經(jīng)典方法，算法簡單，速度快缺點：質(zhì)量相近的多肽增加匹配難度無法實現(xiàn)混合蛋白的鑒定優(yōu)點與缺點優(yōu)點：83二級質(zhì)譜鑒定質(zhì)譜儀選擇一級質(zhì)譜中的一個峰，讓這些峰所代表的離子高速撞擊質(zhì)譜儀中的惰性氣體，使其肽鍵斷裂，并對庫搜索鑒定蛋白質(zhì)常用MALDI-TOF／TOF儀器進行二級質(zhì)譜鑒定質(zhì)譜儀選擇一級質(zhì)譜中的一個峰，讓這些峰所代表的離84優(yōu)點與缺點優(yōu)點：鑒定準確度更高，可以得到蛋白的序列可以實現(xiàn)多個蛋白的鑒定缺點：增加了一步操作算法更復(fù)雜，而且需要更多的操作經(jīng)驗優(yōu)點與缺點優(yōu)點：85串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)果——質(zhì)譜圖從一級質(zhì)譜圖里選出部分峰做二級質(zhì)譜一級質(zhì)譜圖二級質(zhì)譜圖串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)果——質(zhì)譜圖從一級質(zhì)譜圖里選出部分峰做二級質(zhì)譜一級863.肽序列測定技術(shù)肽序列測定技術(shù)C端酶解法：利用氨肽酶和羧肽酶，局限性大，靈敏度低。質(zhì)譜法：靈敏度高，準確性好，易操作，具有普適性。N端化學(xué)降解法：用探針試劑氨基酸苯異硫氰酸酯與游離氨基作用，再用各種層析技術(shù)分離；測序速度慢，樣品用量大、純度要求高。3.肽序列測定技術(shù)肽序列測定技術(shù)C端酶解法：利用氨肽酶和羧肽87串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)可直接用于肽序列測定，通過采用不同的質(zhì)譜技術(shù)選擇具有特定質(zhì)荷比的離子，并對其進行碰撞誘導(dǎo)解離，通過推斷肽片的斷裂，可將肽序列導(dǎo)出。通常在低能氣相碰撞的條件下，肽離子碎片沿著骨架在酞胺鍵處斷裂，產(chǎn)生一個序列離子階梯。通過減掉相鄰序列離子的質(zhì)量，由一種或兩種離子系列可推測出氨基酸的序列。串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)可直接用于肽序列測定，通過采用不同884.蛋白質(zhì)翻譯后修飾大多數(shù)生物所表達的蛋白質(zhì)需經(jīng)過一系列的翻譯后加工和修飾才能形成最終復(fù)雜的功能執(zhí)行體，所以蛋白質(zhì)的翻譯后修飾成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要方面。蛋白質(zhì)的修飾類型主要有磷酸化、糖基化等。蛋白質(zhì)磷酸化的分析最令人關(guān)注，因為蛋白質(zhì)的磷酸化和去磷酸化幾乎調(diào)節(jié)著生命活動的所有過程。4.蛋白質(zhì)翻譯后修飾大多數(shù)生物所表達的蛋白質(zhì)89蛋白質(zhì)糖基化修飾的研究最近也有報道，主要是利用蛋白質(zhì)組結(jié)合生物質(zhì)譜技術(shù)，通過核素標記研究N-糖基化蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)修飾的研究一般采用二維電泳-免疫印跡-質(zhì)譜技術(shù)，即用親和技術(shù)提取修飾肽段，并用串聯(lián)質(zhì)譜鑒定修飾肽段來研究蛋白質(zhì)磷酸化或糖基化。蛋白質(zhì)糖基化修飾的研究最近也有報道，主要是90質(zhì)譜確定蛋白質(zhì)的磷酸化位點的方法：①用磷酸酯酶處理和MALDI-TOF-MS-PMF相結(jié)合找出混合肽段中哪一個肽段被磷酸化了;②采用三級四級桿串聯(lián)質(zhì)譜的前體離子掃描技術(shù)進行檢測;③用傅立葉變換離子回旋質(zhì)譜的電子捕獲解離技術(shù)鑒定肽片段的磷酸化位點。質(zhì)譜確定蛋白質(zhì)的磷酸化位點的方法：①用磷酸酯酶處理和MALD915.蛋白質(zhì)組分定量分析為了在質(zhì)譜分析中實現(xiàn)對蛋白質(zhì)的準確定量，1999年引入了核素編碼親和標簽(ICTA)技術(shù)。ICTA是一種人工合成的化學(xué)試劑，其結(jié)構(gòu)包括專一的化學(xué)反應(yīng)基團（與蛋白質(zhì)的半胱氨酸反應(yīng)）、核素標記的連接子和親核反應(yīng)基團。分別用不同的ICTA標記不同的蛋白，再進行等量混合、胰酶消化、親合層析和在線LC-MS/MS分析，就能找到表達差異的蛋白，并用MS/MS鑒定出是何種蛋白。最近又發(fā)展了新一代的標記試劑，在連接子和親和反應(yīng)基團之間增加了一個酶解位點，這樣使裂解后核素標簽的分子量減小。5.蛋白質(zhì)組分定量分析為了在質(zhì)譜分析中實926.蛋白質(zhì)相互作用研究大部分蛋白質(zhì)的功能執(zhí)行是通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用來實現(xiàn)的，因此，蛋白質(zhì)相互作用成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要組成部分。質(zhì)譜技術(shù)對蛋白質(zhì)相互作用的研究主要有兩種策略：①首先通過生化的方法純化蛋白質(zhì)復(fù)合體，然后用質(zhì)譜鑒定其組分。②將混合蛋白質(zhì)直接酶解，用多維色譜串聯(lián)質(zhì)譜進行鑒定。6.蛋白質(zhì)相互作用研究大部分蛋白質(zhì)的功能執(zhí)93二、生物質(zhì)譜在多糖結(jié)構(gòu)測定中的應(yīng)用多糖是醛糖和(或)酮糖通過糖苷鍵連接在一起的天然聚合物，它可參與細胞的生命活動，具有多種生物學(xué)功能。然而并不是所有的多糖都具有活性，多糖的活性在很大程度上是由它的結(jié)構(gòu)決定的，因此對于糖結(jié)構(gòu)的研究，無論是對高活性糖的尋求和開發(fā)，還是對糖生物學(xué)中構(gòu)效關(guān)系的探索與研究，都具有至關(guān)重要的意義。二、生物質(zhì)譜在多糖結(jié)構(gòu)測定中的應(yīng)用多糖是醛94質(zhì)譜技術(shù)于20世紀50年代末開始用于糖的分析，它可以提供相對分子質(zhì)量、多糖的單糖組成、糖苷鍵的連接方式以及分支狀況等多種信息，在糖類的分析中發(fā)揮著不可替代的作用。近年來，各種軟電離技術(shù)相繼誕生,使質(zhì)譜技術(shù)在糖生物學(xué)的研究中取得了很大的進展。主要包括以下應(yīng)用：1.相對分子質(zhì)量測定2.寡糖結(jié)構(gòu)分析3.寡糖序列分析質(zhì)譜技術(shù)于20世紀50年代末開始用于糖的分析，它可以提供相對951.相對分子質(zhì)量測定化學(xué)電離質(zhì)譜傳遞的能量較少而容易得到準分子離子峰。在多糖分析中常用的反應(yīng)氣有異丁烷和氨氣。如以NH3為反應(yīng)氣體就能給出[M+NH4]+作為基峰，從而很容易推導(dǎo)出相對分子質(zhì)量?？煸愚Z擊質(zhì)譜，通過正離子方式增加一個質(zhì)子或陽離子、也可通過負離子方式失去一個質(zhì)子產(chǎn)生準分子離子作為譜圖的主要信號，并給出反映連接順序等信息的碎片。因此，可用來測定寡糖鏈的相對分子質(zhì)量，同時還可以根據(jù)相對分子質(zhì)量計算出寡糖的聚合度。1.相對分子質(zhì)量測定化學(xué)電離質(zhì)譜傳遞的能量較962.寡糖結(jié)構(gòu)分析GC-MS可以提供有關(guān)寡糖殘基類型、鏈的連接方式、糖的序列和糖環(huán)形式、聚合度等多種結(jié)構(gòu)信息。多糖為大分子物質(zhì)，不能直接揮發(fā),因而須將多糖降解為結(jié)構(gòu)單糖或寡糖，并且將其衍生成具有易揮發(fā),對熱穩(wěn)定的衍生物。在應(yīng)用GC-MS進行多糖的結(jié)構(gòu)分析時，通常