第三節(jié)氧化磷酸化

第三節(jié)氧化磷酸化第1頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月一、概念生物體內(nèi)高能磷酸化合物ATP的生成主要由三種方式：

氧化磷酸化底物水平磷酸化光合磷酸化

第2頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月底物水平磷酸化指ATP的形成直接與一個代謝中間物（PEP）上的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移相偶聯(lián)的作用。

1、底物水平磷酸化特點：ATP的形成直接與中間代謝物進(jìn)行的反應(yīng)相偶聯(lián)；在有

O2或無O2條件下均可發(fā)生底物水平的磷酸化。第3頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月是與電子傳遞過程偶聯(lián)的磷酸化過程。即伴隨電子從底物到O2的傳遞，ADP被磷酸化生成ATP的酶促過程，這種氧化與磷酸化相偶聯(lián)的作用稱為氧化磷酸化。這是需氧生物合成ATP的主要途徑。真核生物的電子傳遞和氧化磷酸化均在線粒體內(nèi)膜上進(jìn)行。原核生物則在質(zhì)膜上進(jìn)行。2、氧化磷酸化第4頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月1、P/O比：

1940年，SOchoa測定了在呼吸鏈中O2的消耗與ATP生成的關(guān)系，為此提出P/O比的概念。（同位素實驗）當(dāng)一對電子經(jīng)呼吸鏈傳給O2的過程中所產(chǎn)生的ATP分子數(shù)。實質(zhì)是伴隨ADP磷酸化所消耗的無機(jī)磷酸的分子數(shù)與消耗分子氧的氧原子數(shù)之比,稱為P/O比。線粒體NADH+H+經(jīng)呼吸鏈氧化P/O比為2.5（3），F(xiàn)ADH2經(jīng)呼吸鏈氧化P/O比為1.5（2）。二、氧化磷酸化偶聯(lián)部位及P/O比

第5頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月2、形成ATP的部位（氧化與磷酸化偶聯(lián)部位）電子傳遞鏈將NADH和FADH2上的電子傳遞給氧的過程中釋放自由能，供給ATP的合成。其中釋放大量自由能的部位有3處，即復(fù)合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ，這3個部位就是ATP合成的部位，稱為偶聯(lián)部位。

關(guān)于論證ATP形成部位的實驗證據(jù)：（1）ΔG0’=-nFΔE0’第6頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）

琥珀酸氧化P/O=2，蘋果酸氧化P/O=3

表明在NADH——CoQ有一次磷酸化作用

（3）A.Lehninger用抗壞血酸使電子從細(xì)胞色素C進(jìn)入呼吸鏈，測得P/O=1，說明由cytaa3——O2有一次磷酸化（4）使用專一性電子傳遞鏈抑制劑亦可測出ATP的形成部位（舉例）第7頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月能量計算：NADH+H+被分子氧氧化生成水，總反應(yīng)為：NADH+H++1/2O2NAD++H2O求此反應(yīng)的ΔG0’：因為：1/2O2+2H++2e-H2O,E0’=0.82vNAD++2H++2e-NADH+H+,E0’=-0.32v所以：ΔE0’=0.82-(-0.32)=1.14V

ΔG0’=-2X23.063X1.14=-52.6(Kcal/mol)=-220(KJ/mol)3ADP+Pi3ATP+3H2OΔG0’=3X7.3=21.9(Kcal/mol)=91.6(KJ/mol)3個ATP的形成共截獲的能量為41%第8頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月1、有關(guān)氧化磷酸化機(jī)理的幾種假說化學(xué)偶聯(lián)假說構(gòu)象偶聯(lián)假說化學(xué)滲透假說三、氧化磷酸化作用的機(jī)理第9頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月（1）化學(xué)偶聯(lián)假說（1953年）（掌握要點）

chemicalcouplinghypothesis

認(rèn)為電子傳遞反應(yīng)釋放的能量通過一系列連續(xù)的化學(xué)反應(yīng)形成高能共價中間物，最后將其能量轉(zhuǎn)移到ADP中形成ATP。AH2+B+I-OHAI+BH2+OH-AI+X-H+OH-

X

I+A+H2O

XI+P-OHXP+I-OH

XP+ADPATP+X-HAH2+B+ADP+P-OHA+BH2+ATP+H2O第10頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月

（2）構(gòu)象偶聯(lián)假說（1964）

conformationalcouplinghypothesis

認(rèn)為電子沿電子傳遞鏈傳遞使線粒體內(nèi)膜的蛋白質(zhì)組分發(fā)生了構(gòu)象變化，形成一種高能構(gòu)象，這種高能形式通過ATP的合成而恢復(fù)其原來的構(gòu)象。迄今未能分離出這種高能蛋白質(zhì)。但在電子傳遞過程中蛋白質(zhì)組分的構(gòu)象變化還是存在的。

第11頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月（3）化學(xué)滲透假說（1961）

chemiosmotichypothesis

1961年由英國生物化學(xué)家PeterMitchell最先提出。認(rèn)為電子傳遞釋放的自由能和ATP的合成是與一種跨線粒體內(nèi)膜的質(zhì)子梯度相偶聯(lián)的。即電子傳遞釋放的自由能驅(qū)動H+從線粒體基質(zhì)跨過內(nèi)膜進(jìn)入膜間隙，從而形成跨線粒體內(nèi)膜的H+離子梯度，及一個電位梯度。這個跨膜的電化學(xué)電勢驅(qū)動ATP的合成。第12頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月NADH呼吸鏈中的三個復(fù)合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ起著質(zhì)子泵的作用，將H+

從線粒體基質(zhì)跨過內(nèi)膜進(jìn)入膜間隙。H+不斷從內(nèi)膜內(nèi)側(cè)泵至內(nèi)膜外側(cè)，而又不能自由返回內(nèi)膜內(nèi)側(cè)，從而在內(nèi)膜兩側(cè)建立起質(zhì)子濃度梯度和電位梯度即電化學(xué)梯度，也稱為質(zhì)子動力。當(dāng)存在足夠的跨膜電化學(xué)梯度時，強(qiáng)大的質(zhì)子流通過嵌在線粒體內(nèi)膜的F0F1-ATP合酶返回基質(zhì)，質(zhì)子電化學(xué)梯度蘊藏的自由能釋放，推動ATP的合成?；瘜W(xué)滲透假說示意圖獲得1978年的諾貝爾化學(xué)獎第13頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月支持化學(xué)滲透假說的實驗證據(jù)：氧化磷酸化作用的進(jìn)行需要封閉的線粒體內(nèi)膜存在。線粒體內(nèi)膜對H+OH-K+Cl-都是不通透的。破壞H+

濃度梯度的形成（用解偶聯(lián)劑或離子載體抑制劑）必然破壞氧化磷酸化作用的進(jìn)行。線粒體的電子傳遞所形成的電子流能夠?qū)+

從線粒體內(nèi)膜逐出到線粒體膜間隙。大量直接或間接的實驗證明膜表面能夠滯留大量質(zhì)子，并且在一定條件下質(zhì)子能夠沿膜表面迅速轉(zhuǎn)移。迄今未能在電子傳遞過程中分離出一個與ATP形成有關(guān)的高能中間化合物，亦未能分離出電子傳遞體的高能存在形式。

H+如何通過電子傳遞鏈“泵”出的？第14頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月關(guān)于H+通過電子傳遞鏈“泵”出的兩種假設(shè)

（一般了解）氧化-還原回路機(jī)制(Mitchell提出）：線粒體內(nèi)膜呼吸鏈的各個氧-還中心即FMNCoQCytC以及Fe-S中心的排列可能即執(zhí)行電子轉(zhuǎn)移又能轉(zhuǎn)移基質(zhì)的質(zhì)子。但是在電子傳遞鏈中，（H+e-）載體只有兩個即FMNCoQ，則三個ATP合成部位中還缺少一個（H+e-）載體，假設(shè)CoQ發(fā)揮兩次作用。（Q循環(huán)）質(zhì)子泵機(jī)制：電子傳遞導(dǎo)致復(fù)合體的構(gòu)象變化，而造成AA側(cè)鏈pK的變化，發(fā)揮質(zhì)子泵作用的側(cè)鏈暴露在內(nèi)膜內(nèi)側(cè)或外側(cè)（交替變化），從而使質(zhì)子發(fā)生移位。第15頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月線粒體內(nèi)膜的表面有一層規(guī)則地間隔排列著的球狀顆粒，稱為FOF1-ATP合酶，也叫ATP合酶復(fù)合體或ATP合酶，是ATP合成的場所。它由FO、F1兩部分組成，其中FO由4種6條不同的肽鏈組成，是復(fù)合體的柄（含質(zhì)子通道），鑲嵌到內(nèi)膜中.F1由5種9條肽鏈組成，呈球狀，是復(fù)合體的頭，與FO結(jié)合后這個頭伸向膜內(nèi)基質(zhì)。FO是膜外質(zhì)子返回膜內(nèi)的通道，F(xiàn)1是催化ATP合成的部位，當(dāng)膜外的質(zhì)子經(jīng)FO質(zhì)子通道到達(dá)F1時便推動ATP的合成。

ATP的合成機(jī)制—FOF1-ATP合酶第16頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月第17頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月亞線粒體結(jié)構(gòu)證明FOF1-ATP合酶中FOF1的功能1960年，E.Racker的氧化磷酸化的重組實驗：超聲波胰蛋白酶或尿素重組亞線粒體囊泡有電子傳遞能力但不能使ADP磷酸化具備氧化磷酸化能力第18頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月根據(jù)當(dāng)前最新測定,H+經(jīng)NADH-Q還原酶、細(xì)胞色素bc1復(fù)合體（Ⅲ）、細(xì)胞色素氧化酶（復(fù)合體Ⅳ）從基質(zhì)泵到膜外時，一對電子泵出的質(zhì)子數(shù)依次為4、2、4，而合成一個ATP分子是由3個H+通過ATP合酶所驅(qū)動。所以電子從NADH傳至O2，共產(chǎn)生的ATP分子數(shù)是2.5個若從琥珀酸傳遞至O2，只有兩個偶聯(lián)部位，產(chǎn)生1.5個ATP。Fe-SFADH2琥珀酸-Q還原酶（復(fù)合體Ⅱ）第19頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月1、解偶聯(lián)劑（uncouplers）某些化合物能消除跨膜的質(zhì)子濃度梯度或電位梯度，使ATP不能合成，這種作用稱為解偶聯(lián)作用，這類化合物成為解偶聯(lián)劑。解偶聯(lián)劑不抑制電子傳遞。不抑制底物水平的磷酸化。解偶聯(lián)劑主要有三種類型：化學(xué)解偶聯(lián)劑：2、4-二硝基苯酚離子載體：解偶聯(lián)蛋白：不同的化學(xué)因素對氧化磷酸化作用的影響方式不同，據(jù)此將它們分成三大類：四、氧化磷酸化的解偶聯(lián)劑和抑制劑第20頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月化學(xué)解偶聯(lián)劑：2、4-二硝基苯酚

（2、4-dinitrophenol,DNP）

DNP在pH=7的環(huán)境中以解離形式存在，是脂不溶的，不能過膜。在酸性環(huán)境中接受H+,成為不解離形式，是脂溶性的，很容易過膜，同時將H+帶入膜內(nèi)，起消除質(zhì)子濃度梯度的作用。亦稱質(zhì)子載體。起同樣作用的有三氟甲氧基苯腙羰基氰化物（FCCP）。中性環(huán)境酸性環(huán)境第21頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月離子載體（離子載體抑制劑）是一類脂溶性物質(zhì)，能與H+以外的其他一價陽離子結(jié)合，并作為他們的載體使他們能過穿過膜，消除跨膜的電位梯度。纈氨霉素（K+）短桿菌肽（K+Na+）第22頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月解偶聯(lián)蛋白（產(chǎn)熱素）是存在于某些生物細(xì)胞線粒體內(nèi)膜上的蛋白質(zhì)，為天然解偶聯(lián)劑。它們能形成質(zhì)子通道，讓膜外的H+通過通道返回膜內(nèi)，消除跨膜質(zhì)子濃度梯度。如：動物的褐色脂肪組織，其產(chǎn)熱機(jī)制是線粒體氧化磷酸化解偶聯(lián)的結(jié)果。

人、新生無毛的哺乳動物以及冬眠的哺乳動物。第23頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月1、有關(guān)氧化磷酸化機(jī)理的幾種假說化學(xué)偶聯(lián)假說構(gòu)象偶聯(lián)假說化學(xué)滲透假說三、氧化磷酸化作用的機(jī)理第24頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月NADH呼吸鏈中的三個復(fù)合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ起著質(zhì)子泵的作用，將H+

從線粒體基質(zhì)跨過內(nèi)膜進(jìn)入膜間隙。H+不斷從內(nèi)膜內(nèi)側(cè)泵至內(nèi)膜外側(cè)，而又不能自由返回內(nèi)膜內(nèi)側(cè)，從而在內(nèi)膜兩側(cè)建立起質(zhì)子濃度梯度和電位梯度即電化學(xué)梯度，也稱為質(zhì)子動力。當(dāng)存在足夠的跨膜電化學(xué)梯度時，強(qiáng)大的質(zhì)子流通過嵌在線粒體內(nèi)膜的F0F1-ATP合酶返回基質(zhì)，質(zhì)子電化學(xué)梯度蘊藏的自由能釋放，推動ATP的合成?；瘜W(xué)滲透假說示意圖獲得1978年的諾貝爾化學(xué)獎第25頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月1、解偶聯(lián)劑（uncouplers）某些化合物能消除跨膜的質(zhì)子濃度梯度或電位梯度，使ATP不能合成，這種作用稱為解偶聯(lián)作用，這類化合物成為解偶聯(lián)劑。解偶聯(lián)劑不抑制電子傳遞。不抑制底物水平的磷酸化。解偶聯(lián)劑主要有三種類型：化學(xué)解偶聯(lián)劑：2、4-二硝基苯酚離子載體：解偶聯(lián)蛋白：不同的化學(xué)因素對氧化磷酸化作用的影響方式不同，據(jù)此將它們分成三大類：四、氧化磷酸化的解偶聯(lián)劑和抑制劑第26頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月直接作用于ATP合酶復(fù)合體而抑制ATP合成的一類化合物。由于影響（降低）O2的利用率，從而間接抑制電子傳遞。（區(qū)別于電子傳遞鏈抑制劑）寡霉素、雙環(huán)己基碳二亞胺（抑制FOF1某些蛋白的活性）寡霉素等對利用氧的抑制作用可被DNP解除。2、抑制劑第27頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月線粒體呼吸的5種狀態(tài)（B.ChanceandGRWilliams）懸浮的線粒體實驗：狀態(tài)I：無底物和ADP；狀態(tài)II：只有ADP狀態(tài)III：有底物和ADP狀態(tài)IV：有底物和加入的ADP狀態(tài)V：氧被耗盡時，線粒體呼吸停止。第28頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月寡霉素對氧消耗的抑制以及DNP解除寡霉素的抑制作用：第29頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月真核細(xì)胞細(xì)胞液中產(chǎn)生的NADH必須進(jìn)入線粒體才能經(jīng)呼吸鏈氧化并生成ATP.

磷酸甘油穿梭蘋果酸-天冬氨酸穿梭五、線粒體穿梭系統(tǒng)第30頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月1、磷酸甘油穿梭（P/O=2或1.5）NAD+NADH+H+P-甘油P-二羥丙酮P-甘油P-二羥丙酮3-P甘油脫氫酶（胞液）FAD

FADH23-P甘油脫氫酶（內(nèi)膜）CoQFe-SFP1cytb胞液外膜膜間空間內(nèi)膜昆蟲飛行肌細(xì)胞溶膠NADH利用此穿梭第31頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月2、蘋果酸-天冬氨酸穿梭（P/O=3或2.5）蘋果酸草酰乙酸NAD+NADH+H+蘋果酸草酰乙酸NAD+NADH+H+天冬氨酸谷氨酸α-酮戊二酸天冬氨酸谷氨酸α-酮戊二酸ⅠⅡ1243胞液膜間空間外膜內(nèi)膜基質(zhì)1、胞液的蘋果酸脫氫酶2、線粒體基質(zhì)的蘋果酸脫氫酶3、胞液的天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶4、線粒體基質(zhì)的天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶Ⅰ、蘋果酸-α酮戊二酸反向交換載體Ⅱ天冬氨酸-谷氨酸反向交換載體1動物心臟及肝臟胞質(zhì)溶膠內(nèi)NADH利用此穿梭第32頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月3、外NADH脫氫酶（真菌和高等植物）

NADH脫氫酶（復(fù)合物Ⅰ）內(nèi)膜內(nèi)側(cè)，朝向基質(zhì)

催化線粒體內(nèi)部的NADH脫氫交給其輔基FMN

將氫傳遞給CoQ

外NADH脫氫酶內(nèi)膜外側(cè)，朝向膜間