芽孢桿菌防治植物病害的研究進展

芽孢桿菌防治植物病害的研究進展

植物病害嚴重威脅了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。施用化學(xué)藥劑一直是人類防治植物病害的主要策略,具有見效快、殺菌譜廣、成本低等優(yōu)點。然而,長期大量施用化學(xué)農(nóng)藥導(dǎo)致農(nóng)藥殘留及環(huán)境污染,最終危害人類健康并破壞生態(tài)平衡,同時也使病原菌對各種化學(xué)殺菌劑產(chǎn)生了嚴重的抗藥性。生物防治因其對環(huán)境、生態(tài)及人類健康安全、無毒等優(yōu)點得到了世界各國的廣泛重視并發(fā)揮著越來越重要的作用。利用多種有益微生物及其代謝產(chǎn)物已成功應(yīng)用于植物病害的生物防治中。這些微生物包括真菌、細菌、放線菌等多個生物種群。其中芽孢桿菌屬的細菌具有生長速度快、營養(yǎng)需求簡單、有較強的耐熱性及抗逆性、在植物表面易于存活與繁殖、對人畜無害、不污染環(huán)境、制劑穩(wěn)定、施用方便等優(yōu)點,不僅符合人們對綠色食品的需求,而且為農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供了保障。因此,芽孢桿菌作為一種較為理想的生防微生物,逐漸成為近年來研究的熱點。鑒此,筆者綜述了幾種主要芽孢桿菌防治植物病害的研究進展和應(yīng)用現(xiàn)狀、芽孢桿菌防治植物病害的主要作用機制、生防芽孢桿菌的遺傳改良研究進展,并對芽孢桿菌及其制劑在生物防治領(lǐng)域的發(fā)展前景進行了展望,旨在為芽孢桿菌在防治植物病害中的進一步開發(fā)與應(yīng)用提供參考。1殖與繁殖繁殖芽孢桿菌易從土壤和植株中分離得到,能產(chǎn)生耐熱、抗逆性的芽孢,具有顯著的生防潛力,利于生防菌劑的生產(chǎn)、劑型加工及在環(huán)境中存活、定殖與繁殖。目前,用于防治植物病害的芽孢桿菌主要有枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、側(cè)孢芽孢桿菌(B.laterosporus)、蠟樣芽孢桿菌(B.cereus)、地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)、蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensis)、多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)、短小芽孢桿菌(B.pumilus)等。1.1枯草芽孢桿菌的使用枯草芽孢桿菌是迄今為止研究最深入的一種芽孢桿菌,目前利用枯草芽孢桿菌防治植物病害成為生物防治植物病害研究的熱點,國內(nèi)外已有較多報道。現(xiàn)報道的從作物的根際土壤、根表、植株及葉片上分離篩選出的枯草芽孢桿菌菌株對不同植物的真菌和細菌病害具有防治作用,如糧食作物中的水稻紋枯病、稻瘟病、小麥紋枯病、豆類根腐病、水稻穗頸瘟、小麥全蝕病等,蔬菜病害中的番茄葉霉病、黃瓜枯萎病、黃瓜霜霉病、茄子灰霉病、茄子白粉病、辣椒疫病、番茄紋枯病等?？莶菅挎邨U菌還可控制采后水果的多種疫病,如蘋果霉心病、油桃褐腐病、柑橘青霉病、草莓灰霉病、草莓白粉病、香蕉枯萎病、香蕉冠腐病、香蕉炭疽病、蘋果梨青霉病、蘋果梨黑斑病、蘋果梨潰瘍病和金花梨果腐病。此外,枯草芽孢桿菌對楊樹潰瘍病、腐爛病、黑斑病及炭疽病、茶輪斑病、煙草炭疽病、黑脛病、根腐病以及棉花立枯病等也有較好的防治作用。生防枯草芽孢桿菌B29菌株對引起大豆根腐病的鐮刀菌、腐霉菌和立枯絲核菌具有強拮抗作用,田間防效達56.3%~89.1%,同時,該生防菌株還可刺激植株的增產(chǎn),增產(chǎn)率為9.4%~24.6%。Daivasikamani等使用枯草芽孢桿菌來防治咖啡銹病的病原菌咖啡銹菌(Hemileiavastatrix),體外抑制試驗結(jié)果表明枯草芽孢桿菌試驗劑量為1×108cfu/ml時對Hemileiavastatrix孢子萌發(fā)的抑制率高達68.20%,而在體內(nèi)試驗中枯草芽孢桿菌在相同劑量下對Hemileiavastatrix孢子萌發(fā)的抑制率也能達到42.98%。國外對枯草芽孢桿菌的研究較多,且一些枯草芽孢桿菌菌株已作為商品生產(chǎn)和出售。美國現(xiàn)有4株枯草芽孢桿菌生防菌株,分別是QST713、GBO3、MBI600和FZB24,已得到美國環(huán)保署(EPA)商品化或有限商品化生產(chǎn)應(yīng)用許可。QST713粉劑配以一定量水噴灑在葉面,可抑制枯萎病、痂病、灰霉病和幾種霉菌病害的病原真菌菌絲體和植物疾病。GBO3菌株可產(chǎn)生抗真菌化合物,分泌的揮發(fā)性物質(zhì)可直接促進植物生長。該菌株可直接施于土壤,主要抑制由絲核菌(Rhizoctonia)、鐮刀菌(Fusarium)、曲霉(Aspergillus)等引起的植物根部病害。美國Gustafson公司和MicrobioLtd公司將能夠分解淀粉的枯草芽孢桿菌和MBI600菌株制成混合生防藥劑,稱為BioYieldTM。FZB24菌株在液體培養(yǎng)液中可產(chǎn)生伊枯草菌素等脂肽類抗生素,可防治鐮刀菌、絲核菌引起的根腐病和枯萎病。此外,1990年由日本AHCLtd公司分離得到的DB9011菌株安全性好、無毒害,得到東京食品安全協(xié)會的認可,并在美國和歐洲等7個國家得到專利認證。在我國,利用枯草芽孢桿菌防治植物病害也取得較大進展,現(xiàn)已開發(fā)成功并投入生產(chǎn)的商品制劑有亞寶、百抗、麥豐寧、紋曲寧等。此外,江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所開發(fā)的B.subtilisB916也已進行農(nóng)藥登記,對水稻紋枯病的田間防效連續(xù)10年在50%~80%。1.2對抗菌性能的影響側(cè)孢芽孢桿菌(Brevibaeilluslaterosporus)具有多種生物學(xué)活性,如抗菌活性、抗腫瘤活性、殺蟲活性等。早期的研究主要集中在殺蟲活性方面,而近年來側(cè)孢芽孢桿菌產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì)對植物病害生物防治的研究越來越受到研究者的關(guān)注。側(cè)孢芽孢桿菌X10固體菌劑的田間應(yīng)用效果試驗表明,固體菌劑對番茄青枯病有很好的防治效果,同時還能夠促進番茄植株的生長和增加產(chǎn)量。Zhao等在種植芒果的土壤中分離到的側(cè)孢短芽孢桿菌A60的代謝產(chǎn)物對辣椒瘡痂病菌(Xanthomonasvesicatoria)、黃瓜棒孢葉斑病菌(Corynesporacassicola)和番茄早疫病菌(Alternariasolani)等多種植物病原菌都有抑菌活性。此外,杜春梅等開展了對側(cè)孢芽孢桿菌BL-21的研究,發(fā)現(xiàn)該菌發(fā)酵液對黃瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum)、甜瓜枯萎病菌(F.oxysporum)、水稻惡苗病菌(F.moniliforme)、小麥赤霉病菌(F.graminearum)等多種植物病原真菌具有抗菌活性。通過Sephadex層析和CM-SepharoseFastFlow離子交換層析從發(fā)酵液中分離得到4種抗菌物質(zhì),初步推測可能為蛋白類或抗菌肽,或者是含有肽鍵結(jié)構(gòu)的抗菌物質(zhì)。1.3病原菌對耐藥菌的影響蠟樣芽孢桿菌對多種植物病害有較明顯的抑制作用。研究表明,將香蕉苗根系經(jīng)蠟樣芽孢桿菌和病原菌分別處理后,根系中與抗病性調(diào)控相關(guān)的酶的活性明顯提高。蠟樣芽孢桿菌BC98-Ⅰ發(fā)酵液與其抑菌粗提物對黃瓜枯萎病菌具有良好的抑制作用,使孢子萌發(fā)率降低、菌絲生長異常,且抑菌特性穩(wěn)定,對外界環(huán)境有很強的耐受性和適應(yīng)性。1.4地衣芽孢桿菌防治地衣芽孢桿菌產(chǎn)生的多種抗菌物質(zhì)對一些植物病原菌,尤其是病原真菌有較好的抑制作用。地衣芽孢桿菌可用于防治番茄灰霉病、棉花枯萎病、黃萎病、水稻稻瘟病、辣椒病害,也可用于防治采后水果病害。地衣芽孢桿菌W10的發(fā)酵液和除菌發(fā)酵液都可誘導(dǎo)番茄植株對灰霉病的系統(tǒng)抗性,持續(xù)時間達12d以上。1.5真菌代謝產(chǎn)物前人對蘇云金芽孢桿菌(Bt)的研究主要集中在殺蟲特性方面,然而近年來Bt在植物真菌病害防治方面的研究也逐漸增多,現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物如幾丁質(zhì)酶、脂肽類抗生素等對植物的真菌病害有較好的抑制作用。William等誘變BtHD-548后篩出一株高產(chǎn)幾丁質(zhì)酶、廣譜抑真菌的突變菌株,并于2001年申報了菌株及基因?qū)＠?。Driss等也發(fā)現(xiàn)產(chǎn)幾丁質(zhì)酶Btkurstaki菌株的發(fā)酵上清液對黑曲霉有很強的抑制作用。1.6山魚植物的生長多粘類芽孢桿菌對人或動植物沒有致病性,某些菌株可產(chǎn)生如抗生素、拮抗蛋白、植物激素、酶、絮凝劑等多種生物活性物質(zhì),也是一類重要的植物生防細菌和植物根際促生菌(Plantgrowth-promotingrhizobacteria,PGPR),并在植物病害防治以及人和動物疾病治療方面具有很好的應(yīng)用前景。Choong-Min等報道,多粘類芽孢桿菌E681可抑制猝倒病等多種芝麻土傳病害,促進芝麻生長。其抑菌譜廣,對終極腐霉菌(Pythiumultimum)、德巴利腐霉(Pythiumdebaryanum)、立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)、尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)、灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)、番茄葉霉病菌(Cladosporiumfulvum)等也有明顯的抑制作用。1.7對抗菌性能的影響在防治植物病害中除上述芽孢桿菌種類外,其他種類抗菌能力強的芽孢桿菌也逐漸被發(fā)現(xiàn)、篩選和研究。Swadling等報道,短小芽孢桿菌NCIMB13374能抑制草莓灰霉病菌的生長。另外,短小芽孢桿菌D82對小麥根腐病有強抗生作用。短小芽孢桿菌和乳芽孢桿菌(Lactobacillussp.)都有防治豆類和番茄灰霉病的作用,能降低灰葡萄孢分生孢子的萌發(fā)和片腐爛的嚴重程度。近年來,有報道海洋芽孢桿菌(B.marinus)、堅強芽孢桿菌(B.firmus)、萎縮芽孢桿菌(B.velezensis)、莫哈韋氏芽孢桿菌(Bacillusmojavensis)以及一些新篩選的未定種的芽孢桿菌都具有拮抗植物病原菌的作用。2芽孢桿菌的作用機制近年來,國內(nèi)外研究者在芽孢桿菌對植物病菌的作用機制方面進行了大量研究,認為不同的芽孢桿菌其作用機制和方式是多樣的,主要包括拮抗作用、競爭作用和誘導(dǎo)植物抗性等幾個方面。2.1抗菌活性物質(zhì)拮抗作用主要指2種或2種以上的微生物共同生長時,一種微生物在同化作用中產(chǎn)生1種或幾種特異次生代謝產(chǎn)物(如抗生素、抗菌蛋白等抗菌物質(zhì)),改變其微環(huán)境,從而抑制甚至殺死另一種微生物的現(xiàn)象。拮抗作用是生防芽孢桿菌最主要的作用,也是研究較為深入廣泛的一種抗病機理,常作為生防菌初步篩選的重要指標(biāo)。芽孢桿菌產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì)主要有細胞壁降解酶類(如幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶)、細菌素類、抗生素類(包括脂肽類抗生素和多肽類抗生素)等抗菌物質(zhì)。BacillussubtilisTG-26產(chǎn)生的抗真菌小肽LP-1對瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)、玉蜀黍赤霉病菌(Gibberellazeae)、長柄鏈格孢(Alternarialongipes)和水稻稻梨孢(Pyriculoriaoryzae)等有很強的抑制作用。另外,有些菌株還能產(chǎn)生聚酮類、酚類、大環(huán)內(nèi)酯類和多烯類抗菌物質(zhì)以及揮發(fā)性抗菌物質(zhì)。海洋枯草芽孢桿菌Bs-1可產(chǎn)生一種有抗真菌活性的化合物,該化合物含有共軛雙鍵但無氨基酸殘基,這與芽孢桿菌抗生素的結(jié)構(gòu)不同,很可能是一種新的非肽類化合物。還有些抗菌物質(zhì)主要通過溶解細胞壁或細胞膜造成原生質(zhì)泄漏,使菌絲斷裂或畸形,同時抑制病原菌孢子的萌發(fā)。有些抗菌物質(zhì)如表面活性素能在植物根部形成一層生物膜,保護植物根部免受病原菌的入侵。結(jié)構(gòu)不同的抗菌物質(zhì)其抑菌機理也不同,某些菌株能同時分泌多種結(jié)構(gòu)相似的抗菌物質(zhì),這些抗菌物質(zhì)還表現(xiàn)出協(xié)同增效的作用。2.2鐵載體對植物病原菌真菌的作用芽孢桿菌的競爭作用主要包括空間位點競爭和營養(yǎng)競爭。以空間位點競爭占優(yōu)勢,即在植物根際、體表、體內(nèi)及土壤中快速、大量繁衍和定殖,有效地排斥、阻止和干擾植物病原微生物在植物上的定殖與侵染,達到抑菌控病的效果。營養(yǎng)競爭包括對土壤中磷、氮和鐵等元素的競爭。能否利用到營養(yǎng)決定了某種微生物在其小生境中是否為優(yōu)勢菌群。鐵載體對鐵的競爭是很多細菌生防菌劑抑制植物病原真菌的重要特征。Yu等對枯草芽孢桿菌CAS15進行研究時發(fā)現(xiàn),CAS15菌株產(chǎn)生的鐵載體與鐵結(jié)合具有高特異性和親和力,在低鐵環(huán)境下與病原微生物競爭鐵離子,從而限制病原菌的生長。CAS15不僅對辣椒枯萎病有很好的生防效果,還可促進植株生長。枯草芽孢桿菌B47菌株能通過番茄根、莖和葉的傷口進入植株體內(nèi),入侵后主要定殖在番茄維管束的導(dǎo)管中,再接種番茄青枯病菌,對番茄青枯病的防治效果達81.25%。郭榮君等利用營養(yǎng)競爭平板篩選法,將芽孢桿菌與植物病原真菌在大豆麥麩培養(yǎng)基上共培養(yǎng),枯草芽孢桿菌菌株B010和B006快速利用培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì),在培養(yǎng)基上迅速生長蔓延,可完全抑制尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)和茄病鐮刀菌(Fusariumsolani)菌絲生長,對真葉期大豆根腐病的防治效果分別為63.5%和74.6%,同時大豆產(chǎn)量分別增加24.0%和13.8%。2.3水稻葉生物酶系統(tǒng)sar誘導(dǎo)植物抗性是生防芽孢桿菌發(fā)揮生防作用的一個重要方面。芽孢桿菌可作為植物激活劑,誘導(dǎo)植物系統(tǒng)獲得抗性(Inducedsystemicresistance,ISR),與病原物誘導(dǎo)的植物獲得性抗性(Systemicacquiredresistance,SAR)具有相同的表型特征。作用機制主要是通過組織木質(zhì)化增強細胞機械屏障和產(chǎn)生植保素,該過程涉及POD、PPO、PAL與SOD的活性變化。它們共同作用可抵抗真菌、細菌和病毒,保護植物免受病原菌的危害,降低損失,顯著減少病害程度,并能促進作物生長。Tang發(fā)現(xiàn)B.subtilisB3菌株能誘導(dǎo)小麥POD活性增強,并產(chǎn)生一些新的POD。水稻紋枯病生防菌B916能誘導(dǎo)水稻葉鞘細胞PAL、POD、PPO和SOD活性增強,且分別在24、48、72和24h內(nèi)達到最高。Romeiro等對分離到的BacilluscereusUFV-101研究時發(fā)現(xiàn),該菌株的發(fā)酵上清液能誘導(dǎo)番茄葉片對丁香假單胞桿菌番茄致病變種(Pseudomonassyringaepv.tomato)產(chǎn)生抗性,以減輕植物病害。3蘑菇的遺傳改良生防芽孢桿菌的遺傳改良的主要目的是增強其抗菌活性、擴大抑菌譜、增強其在植物寄主上的定殖能力,從而提高防病能力。3.1ilis14菌的鑒定韓文霞等將6.5kbDNA的幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)入芽孢桿菌D2中獲得了工程菌株D2-chib。構(gòu)造好的工程菌株對番茄灰霉病的抑制率顯著好于原始菌株,粗酶液酶活為4.06U/ml,是原始菌株酶活的33.8倍,顯著提高了菌株對番茄灰霉病的生防效果,在番茄溫室大棚防效試驗中防效顯著,100倍的發(fā)酵稀釋液對番茄灰霉病的抑病率達到91.34%。Coutte等將功能基因sfp重組入B.subtilis168菌中,使重組型啟動子PrepU取代菌株中的原始啟動子srfA,經(jīng)液體培養(yǎng)基培養(yǎng)6h后發(fā)酵液中分泌的表面活性素含量是原始菌株的6倍,顯著提高了對植物病原真菌的抑菌活性。aiiA基因是報道的第1個群體感應(yīng)淬滅酶基因,是從芽孢桿菌240B1中克隆到的酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶基因(aiiA),編碼一個AHL內(nèi)酯水解酶。編碼AHLs降解酶的基因可能廣泛存在于多種原核生物中。該基因所表達的蛋白是一種具有降解AHL分子作用的特異性內(nèi)酯水解(AHL-Lactonase,簡稱AiiA蛋白)蛋白。該類蛋白通過水解信號分子AHLs[AI-1型信號分子即N-?；呓z氨酸內(nèi)酯(N-acyl-homoserinelactones,AHL或acyl-HSL)]的內(nèi)酯鍵,降低致病菌群中AHL分子的濃度,從而減弱致病菌的致病性。朱晨光等通過重疊延伸PCR技術(shù),采用將aiiA基因自身的啟動子換成殺蟲晶體蛋白基因cry3Aa的啟動子,構(gòu)建出融合基因pro3A-aiiA。將融合基因裝入穿梭載體pHT304的BamHI/SphI位點,得到了重組質(zhì)粒pBMB686并轉(zhuǎn)化Bt無晶體突變株BMBl71,重組菌株BMB686的表達AiiA蛋白的能力大大增加,對信號分子AHLs的降解能力和對胡蘿卜軟腐歐文氏菌感染馬鈴薯產(chǎn)生軟腐病害的抑制能力也明顯加強。3.2抗病毒種的融合子將殺蟲基因?qū)肷谰昕赏档头乐纬杀尽U大防治對象,我國率先在該方面進行了研究。Tang等將殺蟲基因?qū)隑.subtilisB908,將B.thuringiensis7216與B.subtilisB908原生質(zhì)體融合構(gòu)建了具有防病增產(chǎn)和殺蟲作用雙功能的融合子CF103。田間試驗結(jié)果表明,CF103能兼防水稻紋枯病和稻縱卷葉螟,對照區(qū)病情指數(shù)為49.8%,蟲害率為41.5%,而防治區(qū)相應(yīng)為0~36.