原生質(zhì)體培養(yǎng)方法課件

原生質(zhì)體培養(yǎng)方法液體淺層培養(yǎng)固-液體雙層培養(yǎng)固體平板培養(yǎng)瓊脂糖珠培養(yǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng)方法液體淺層培養(yǎng)固-液體雙層培養(yǎng)固體平板培養(yǎng)瓊脂1

液體淺層培養(yǎng):Liquidthinlayerculture將含有原生質(zhì)體的培養(yǎng)液在培養(yǎng)皿底部鋪一薄層，封口后進(jìn)行培養(yǎng)優(yōu)點(diǎn)：操作簡單，對原生質(zhì)體的損傷小，且易于添加新鮮培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)移培養(yǎng)物缺點(diǎn)：原生質(zhì)體分布不均勻，常發(fā)生原生質(zhì)體粘連現(xiàn)象而影響其進(jìn)一步生長和發(fā)育；難以跟蹤觀察某一個(gè)細(xì)胞的發(fā)育情況；一旦污染，全皿報(bào)廢液體淺層培養(yǎng):Liquidthinlayercult2

固體平板培養(yǎng):Solidculture固體培養(yǎng)也就是瓊脂糖包埋培養(yǎng)。低融點(diǎn)瓊脂糖可在30C左右融化與原生質(zhì)體混合而不影響原生質(zhì)體的生命活動(dòng)?；旌虾蟮暮性|(zhì)體的培養(yǎng)基鋪于培養(yǎng)皿底部，封口后進(jìn)行培養(yǎng)優(yōu)點(diǎn)：可以跟蹤觀察單個(gè)原生質(zhì)體的發(fā)育情況，易于統(tǒng)計(jì)原生質(zhì)體分裂頻率缺點(diǎn)：操作要求嚴(yán)格，尤其是混合時(shí)的溫度掌握必須合適，溫度偏高則影響原生質(zhì)體的活力，溫度偏低則瓊脂糖凝固太快原生質(zhì)體不易混合均勻固體平板培養(yǎng):Solidculture3

液體－固體雙層培養(yǎng):Liquidsolidculture即在培養(yǎng)皿底部鋪一層瓊脂糖固體培養(yǎng)基，再將原生質(zhì)體懸浮液滴于固體培養(yǎng)基表面優(yōu)點(diǎn)：固體培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)可以緩慢釋放到液體培養(yǎng)基，如果在下層固體培養(yǎng)基中添加一定量的活性炭，則還可以吸附培養(yǎng)物產(chǎn)生的一些有害物質(zhì)，促進(jìn)原生質(zhì)體的分裂和細(xì)胞團(tuán)的形成缺點(diǎn)：不易觀察細(xì)胞的發(fā)育過程液體－固體雙層培養(yǎng):Liquidsolidcultur4Semi-permeablemembraneonsolidmediumSemi-permeablemembraneonsol5Semi-permeablemembraneenhancesembryoregenerationincitrusprotoplastcultureSemi-permeablemembraneenhanc6

瓊脂糖珠培養(yǎng):Agarosebeadculture將含有原生質(zhì)體的液態(tài)瓊脂糖培養(yǎng)基用吸管以大約50l一滴的量滴于直徑6cm的培養(yǎng)皿，待其固化后向其中添加3ml液體培養(yǎng)基并于搖床上低速旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)(Thompson等，1986)。培養(yǎng)過程中，通過調(diào)整液體培養(yǎng)基的滲透壓來調(diào)節(jié)培養(yǎng)物的滲透壓以利于其進(jìn)一步的生長和發(fā)育。這種方法由于改善了培養(yǎng)物的通氣和營養(yǎng)環(huán)境，從而促進(jìn)了原生質(zhì)體的分裂和細(xì)胞團(tuán)的形成瓊脂糖珠培養(yǎng):Agarosebeadculture7原生質(zhì)體發(fā)育與植株再生細(xì)胞壁再生細(xì)胞分裂與生長愈傷組織形成植株再生原生質(zhì)體發(fā)育與植株再生細(xì)胞壁再生細(xì)胞分裂與生長愈傷組織形成植81.細(xì)胞壁再生原生質(zhì)體培養(yǎng)數(shù)小時(shí)后開始再生新的細(xì)胞壁，一至數(shù)天內(nèi)便可形成完整細(xì)胞壁新合成的細(xì)胞壁可用0.1％熒光增白劑（Calcofluor）染色后在熒光顯微鏡下觀察，可見到綠色熒光圍繞細(xì)胞表面，證明細(xì)胞壁已形成。也可用高滲溶液產(chǎn)生質(zhì)壁分離的方法、電子顯微鏡觀察技術(shù)和冰凍蝕刻法等進(jìn)行再生細(xì)胞壁的研究原生質(zhì)體培養(yǎng)數(shù)小時(shí)后新壁開始形成，先是質(zhì)膜合成形成細(xì)胞壁主要成分的微纖維，然后轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜表面進(jìn)行聚合作用產(chǎn)生多片層的結(jié)構(gòu)，之后在質(zhì)膜與片層結(jié)構(gòu)之間或在膜上產(chǎn)生小纖維絲，逐漸形成不定向的纖維團(tuán)，最后形成完整的細(xì)胞壁只有能形成完好細(xì)胞壁的再生細(xì)胞才能進(jìn)入細(xì)胞分裂階段1.細(xì)胞壁再生92.細(xì)胞分裂和生長原生質(zhì)體培養(yǎng)數(shù)天后，胞質(zhì)增加，細(xì)胞器增殖，RNA、蛋白質(zhì)及多聚糖合成增加，不久即可發(fā)生核的有絲分裂及胞質(zhì)分裂原生質(zhì)體一般培養(yǎng)2～7d開始第1次分裂，但第1次分裂的時(shí)間隨植物種類、分離原生質(zhì)體的材料、原生質(zhì)體質(zhì)量、培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件而異用幼苗下胚軸和子葉、幼根、懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞、未成熟種子的子葉等分離原生質(zhì)體，一般比用葉肉分離原生質(zhì)體容易誘導(dǎo)分裂，第一次分裂出現(xiàn)的時(shí)間較快2.細(xì)胞分裂和生長103.愈傷組織形成

1）多數(shù)情況下，原生質(zhì)體培養(yǎng)2周后，可形成多細(xì)胞團(tuán)，3周后形成肉眼可見的小細(xì)胞團(tuán)，5-6周后形成直徑1mm的小愈傷組織2）原生質(zhì)體培養(yǎng)15-20天后，需要及時(shí)添加新鮮培養(yǎng)基，同時(shí)降低滲透壓，否則細(xì)胞團(tuán)不會(huì)繼續(xù)生長。待小愈傷組織長至1-2mm時(shí)，應(yīng)及時(shí)轉(zhuǎn)移至固體培養(yǎng)基使其進(jìn)一步生長3.愈傷組織形成114.植株再生原生質(zhì)體培養(yǎng)再生的愈傷組織可直接轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基，一步成苗（器官發(fā)生）。愈傷組織也可通過體細(xì)胞胚發(fā)生，先形成胚狀體，再誘導(dǎo)生芽、生根。不同植物種屬，其再生方式不同4.植株再生12仙客來原生質(zhì)體的再生仙客來原生質(zhì)體的再生13香蕉原生質(zhì)體再生—Assani等2006看護(hù)培養(yǎng)香蕉原生質(zhì)體再生—Assani等2006看護(hù)培養(yǎng)14Sugarbeet（糖甜菜）callusandprotoplastregenerationSugarbeet（糖甜菜）callusandprot15影響原生質(zhì)體培養(yǎng)的主要因素

基因型番茄與秘魯番茄有性雜交后性狀分離的遺傳分析表明，其愈傷組織再生能力受2個(gè)顯性基因決定(Koornneef等1987)。Cheng和Veilleux(1991)對芙薯(S.phureja)原生質(zhì)體培養(yǎng)能力進(jìn)行遺傳分析，證明從原生質(zhì)體培養(yǎng)到形成愈傷組織受2個(gè)獨(dú)立位點(diǎn)的顯性基因控制(Cheng等1991)Dudits等（1991）以苜蓿不同基因型深入研究，表明某個(gè)基因型在離體培養(yǎng)時(shí)難以形成體細(xì)胞胚。若將對激素調(diào)節(jié)有作用的發(fā)根農(nóng)桿菌rolB和rolC基因引入并表達(dá)，可能促使其體細(xì)胞胚形成影響原生質(zhì)體培養(yǎng)的主要因素

基因型16原生質(zhì)體來源

供體材料類型：向日葵幼葉、子葉和下胚軸原生質(zhì)體培養(yǎng)，只有下胚軸原生質(zhì)體培養(yǎng)得到了細(xì)胞團(tuán)和體細(xì)胞胚，而幼葉和子葉原生質(zhì)體均未獲得成功供體細(xì)胞的分化程度：同一個(gè)基因型的植株生長在不同的環(huán)境條件下，其生理狀態(tài)會(huì)有改變。供試植株最好生長在控制條件下，以提高原生質(zhì)體的細(xì)胞分裂頻率和再生能力，并且可提高實(shí)驗(yàn)重復(fù)性

柑橘：葉肉原生質(zhì)體無論單獨(dú)培養(yǎng)還是共培養(yǎng)均不能再生，只有胚性愈傷組織來源的原生質(zhì)體才能再生原生質(zhì)體來源17

起始培養(yǎng)密度與培養(yǎng)基起始培養(yǎng)密度：適宜密度為1-5×105/ml

培養(yǎng)基激素水平：柑橘不添加外源激素，也可再生培養(yǎng)基營養(yǎng)成分完全性：越豐富越好

起始培養(yǎng)密度與培養(yǎng)基18Protoplastdensitycounting25格×16格（0.1mm3）的血球計(jì)數(shù)板計(jì)算公式：原生質(zhì)體細(xì)胞數(shù)/ml=80小格（左上、右上、左下、右下、中5個(gè)中格）內(nèi)原生質(zhì)體細(xì)胞個(gè)數(shù)/80×400×104×稀釋倍數(shù)1ml=1cm3=1000mm3Protoplastdensitycounting25格19三、原生質(zhì)體再生植株遺傳及變異染色體變異植株性狀變異三、原生質(zhì)體再生植株遺傳及變異染色體變異植株性狀變異20染色體變異染色體倍性變異是原生質(zhì)體再生植株的常見變異類型原生質(zhì)體再生植株的倍性與分離原生質(zhì)體的起始材料有關(guān)由莖尖、葉肉和胚性組織細(xì)胞分離的原生質(zhì)體能較好保持原來的倍性用懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，特別是長期繼代培養(yǎng)的細(xì)胞系分離的原生質(zhì)體，較易出現(xiàn)染色體倍性及數(shù)目的變化Grosser等（1984）報(bào)道，由三葉草葉肉原生質(zhì)體再生的植株為二倍體（2n=16），而由培養(yǎng)細(xì)胞分離的原生質(zhì)體再生的植株為四倍體（2n=32）原生質(zhì)體再生植株變異還與植物種類有關(guān)：馬鈴薯易變，柑橘不易變?nèi)旧w變異染色體倍性變異是原生質(zhì)體再生植株的常見變異類型