一種新型羅丹明b衍生物的合成及性質研究

一種新型羅丹明b衍生物的合成及性質研究

羅丹明衍生物熒光探針羅丹明作為一個熒光標記，在分析和酶化學等領域得到了廣泛應用。通過引入不同官能團對羅丹明母體骨架進行結構設計改造,以改善其性能,擴展應用?；诹_丹明熒光基團而設計的金屬離子熒光探針大多是通過羅丹明酰化合成,該類化合物具有形成“OFF-ON”型熒光探針的潛能。本課題組報道了系列杯芳烴、三角架及小分子結構的羅丹明衍生物熒光探針的研究。不同修飾方式得到的不同結構羅丹明衍生物,能選擇性響應多種金屬離子,識別性能存在差異。文獻報道了Fe3+離子熒光猝滅及熒光增強型羅丹明類探針。設計合成并篩選出對金屬離子高靈敏識別、高選擇性響應、分析性能優(yōu)越的小分子羅丹明類熒光探針仍具有研究價值。本文合成了一種新型羅丹明內酰胺席夫堿衍生物并研究了該衍生物對Fe3+的響應及應用分析性能。1實驗部分1.1儀器和試劑參照文獻儀器。牛血清蛋白(BSA,SolarbioCompany),其余參照文獻試劑。1.2羅丹明席夫堿的表征參照文獻方法,以羅丹明B與二乙烯三胺生成羅丹明內酰胺,再與苯基乙酰丙酮縮合得到羅丹明席夫堿(1),目標化合物結構經1HNMR,13CNMR,MS以及元素分析表征,結構式圖如Scheme1所示。1.3熒光光譜測定1.00×10-4mol·L-1羅丹明席夫堿乙醇溶液;2.00×10-3mol·L-1Fe3+及其他金屬離子乙醇溶液;4.0×10-3mol·L-1Tris-HCl乙醇-水緩沖溶液。移取適量羅丹明席夫堿(0～8.0mL),Tris-HCl溶液(1.0mL),Fe3+或其他金屬離子溶液(0～8.0mL),乙醇-水溶液(3∶1,V∶V)稀釋至10mL。熒光光譜測定的激發(fā)和發(fā)射波長為556/578nm。以Tris-HCl緩沖溶液(pH6.0,含0.1mol·L-1NaCl維持溶液離子強度)為溶劑配制1.0×10-4g·mL-1的BSA標準溶液備用。BSA標準液在0～4℃冰箱中保存。2結果與討論2.1金屬離子檢測衍生物的性質與介質的酸度有很大關系。我們選擇pH6.0的乙醇-水(3∶1,V∶V)為最佳實驗條件,該條件下羅丹明席夫堿在556nm激發(fā)波長下無明顯的熒光發(fā)射并且在可見光區(qū)無吸收。而Fe3+的加入使羅丹明席夫堿溶液的熒光顯著增強,由無色變?yōu)榧t色。其他常見實驗金屬離子的加入均無明顯的響應信號(除Cu2+有微弱的響應外),實驗表明該羅丹明席夫堿可作為檢測Fe3+的高選擇性探針(圖1)。用摩爾比和Job法分別進行了Fe3+對羅丹明席夫堿的熒光及吸收滴定實驗(圖2),推測出Fe3+和羅丹明席夫堿形成為1∶1的配合物。熒光和吸收法分別計算得Fe3+與羅丹明席夫堿的相互作用穩(wěn)定常數分別為1.51×104和2.80×104L·mol-1。并根據文獻方法測定了配合物的熒光量子產率(Ф)為0.70。常見共存金屬離子的干擾實驗結果表明除Cu2+外(相對于Fe3+濃度1.5倍),在Fe3+-羅丹明席夫堿溶液中加入相對于Fe3+濃度2.5倍的其他大部分常見金屬離子時,均不會對Fe3+誘導羅丹明席夫堿的熒光及紫外響應產生影響。表明該羅丹明席夫堿可作為檢測Fe3+的高靈敏度探針。2.2配合作用的鑒定用HPLC方法分別對羅丹明席夫堿及Fe3+-羅丹明席夫堿配合物溶液的色譜進行了分析。在保留值為8.4min處出現羅丹明席夫堿色譜峰。而在羅丹明席夫堿中加入Fe3+的混合溶液,一個新的色譜峰出現在保留值為6.4min處,原來的羅丹明席夫堿色譜峰仍然存在且強度明顯減弱,表明出現了新的配合物。羅丹明席夫堿及Fe3+配合物混合乙醇溶液的IR光譜測定見圖3。加入Fe3+前后羅丹明席夫堿在1681cm-1處的羰基特征峰變化顯著,CN峰(1615cm-1)強度明顯減弱,我們推斷羰基和CN參與了配合作用。羅丹明席夫堿及其Fe3+配合物的1HNMR核磁譜如圖4所示,在羅丹明席夫堿中加入Fe3+后,峰形明顯變寬,羅丹明結構部分的質子大多向低場移動(δ=0.06～0.41ppm),例如Hp,Ha,Hc,Hb,Hd,Hf,He,Hg(δ=0.16,0.32,0.34,0.41,0.12,0.11,0.19,0.06ppm),這是由于羅丹明生成了醌式結構,導致電子云密度降低。實驗結果與文獻類似。以EDTA為配合競爭試劑,在Fe3+-羅丹明席夫堿配合物溶液中加入相對于羅丹明席夫堿80倍的EDTA,發(fā)現溶液立即褪色,熒光淬滅;當再加入100倍的Fe3+(相對于羅丹明席夫堿)后,溶液顏色、熒光及吸收強度均恢復接近未加競爭試劑前,此過程證明了配合反應的可逆性。從以上實驗結果我們推測出配合作用的機理如Scheme2所示。由于配合物的形成,誘導探針的螺環(huán)結構打開,發(fā)生熒光及吸收顯著變化,這與文獻報道的羅丹明類探針響應金屬離子的離子誘導作用相同。2.3檢出限和定量限測試表明,Fe3+濃度在0.4～20×10-6mol·L-1(R=0.9914,n=8)和2.0～8.0×10-5mol·L-1(R=0.9967,n=11)間,溶液熒光強度與Fe3+濃度呈線性相關,計算得檢出限為4.24×10-8mol·L-1;以556nm為最大吸收波長測定紫外吸收,Fe3+響應的濃度在0.4～80×10-6mol·L-1(R=0.9968,n=17)范圍內,檢出限為2.01×10-7mol·L-1。在上述最佳實驗條件下,對自制含鐵樣品溶液進行了檢測,其結果如表1所示,具有良好的回收率和較低的相對標準偏差。2.4配合物與bsa的結合常數研究蛋白質與配體之間的相互作用及動力學過程,對解釋蛋白質結構與功能的關系及蛋白質與各種配體的作用機制意義重大。利用小分子配體與生物大分子結合前后的光譜差異,在不分離的情況下用分子光譜研究配體與蛋白質分子的相互作用。分別以羅丹明席夫堿及Fe3+-羅丹明席夫堿配合物為探針,研究了與牛血清蛋白(BSA)作用的熒光光譜特征。發(fā)現單純的配體與BSA作用的光譜強度變化靈敏度遠遠小于配合物的作用,初步建立了利用金屬配合物作為探針研究測定痕量蛋白質的方法。在室溫下配合物能迅速與蛋白質結合形成復合物,并可穩(wěn)定5h,其熒光強度基本保持不變。在一定的BSA濃度范圍內,隨BSA濃度的增大,Fe3+-羅丹明席夫堿配合物的熒光強度逐漸降低,并具有良好的線性關系,線性范圍為1.0～10μg·mL-1,檢出限可達3.78×10-2μg·mL-1。隨著溫度的升高,猝滅曲線斜率降低,初步證明該過程為靜態(tài)猝滅。其熒光強度變化用靜態(tài)猝滅公式求得不同溫度下的KA和n,結果見表2。數據顯示,Fe3+-羅丹明席夫堿配合物與BSA的結合常數較大,且溫度對結合常數KA影響很小。較大的KA數值說明Fe3+-羅丹明席夫堿配合物與BSA之間有較強的結合作用,可以被蛋白質運輸和儲存。有機小分子和蛋白質之間的作用力主要有疏水作用力、氫鍵、范德華力和靜電引力等。不同分子與蛋白質結合力的類型不同。由表2中數據:ΔH<0,ΔS>0,說明配合物與BSA之間的主要作用力為靜電引力,且ΔG<0,所以配合物與BSA之間的結合反應是自發(fā)進行的,可以作為研究BSA的標記試劑。3與fe3+及羅丹明席夫堿配合物的催化劑的區(qū)別合成了一種新型羅丹明