一種新型羅丹明b衍生物的合成及性質(zhì)研究

一種新型羅丹明b衍生物的合成及性質(zhì)研究

羅丹明衍生物熒光探針羅丹明作為一個熒光標(biāo)記，在分析和酶化學(xué)等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。通過引入不同官能團(tuán)對羅丹明母體骨架進(jìn)行結(jié)構(gòu)設(shè)計改造,以改善其性能,擴展應(yīng)用。基于羅丹明熒光基團(tuán)而設(shè)計的金屬離子熒光探針大多是通過羅丹明?；铣?該類化合物具有形成“OFF-ON”型熒光探針的潛能。本課題組報道了系列杯芳烴、三角架及小分子結(jié)構(gòu)的羅丹明衍生物熒光探針的研究。不同修飾方式得到的不同結(jié)構(gòu)羅丹明衍生物,能選擇性響應(yīng)多種金屬離子,識別性能存在差異。文獻(xiàn)報道了Fe3+離子熒光猝滅及熒光增強型羅丹明類探針。設(shè)計合成并篩選出對金屬離子高靈敏識別、高選擇性響應(yīng)、分析性能優(yōu)越的小分子羅丹明類熒光探針仍具有研究價值。本文合成了一種新型羅丹明內(nèi)酰胺席夫堿衍生物并研究了該衍生物對Fe3+的響應(yīng)及應(yīng)用分析性能。1實驗部分1.1儀器和試劑參照文獻(xiàn)儀器。牛血清蛋白(BSA,SolarbioCompany),其余參照文獻(xiàn)試劑。1.2羅丹明席夫堿的表征參照文獻(xiàn)方法,以羅丹明B與二乙烯三胺生成羅丹明內(nèi)酰胺,再與苯基乙酰丙酮縮合得到羅丹明席夫堿(1),目標(biāo)化合物結(jié)構(gòu)經(jīng)1HNMR,13CNMR,MS以及元素分析表征,結(jié)構(gòu)式圖如Scheme1所示。1.3熒光光譜測定1.00×10-4mol·L-1羅丹明席夫堿乙醇溶液;2.00×10-3mol·L-1Fe3+及其他金屬離子乙醇溶液;4.0×10-3mol·L-1Tris-HCl乙醇-水緩沖溶液。移取適量羅丹明席夫堿(0～8.0mL),Tris-HCl溶液(1.0mL),Fe3+或其他金屬離子溶液(0～8.0mL),乙醇-水溶液(3∶1,V∶V)稀釋至10mL。熒光光譜測定的激發(fā)和發(fā)射波長為556/578nm。以Tris-HCl緩沖溶液(pH6.0,含0.1mol·L-1NaCl維持溶液離子強度)為溶劑配制1.0×10-4g·mL-1的BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。BSA標(biāo)準(zhǔn)液在0～4℃冰箱中保存。2結(jié)果與討論2.1金屬離子檢測衍生物的性質(zhì)與介質(zhì)的酸度有很大關(guān)系。我們選擇pH6.0的乙醇-水(3∶1,V∶V)為最佳實驗條件,該條件下羅丹明席夫堿在556nm激發(fā)波長下無明顯的熒光發(fā)射并且在可見光區(qū)無吸收。而Fe3+的加入使羅丹明席夫堿溶液的熒光顯著增強,由無色變?yōu)榧t色。其他常見實驗金屬離子的加入均無明顯的響應(yīng)信號(除Cu2+有微弱的響應(yīng)外),實驗表明該羅丹明席夫堿可作為檢測Fe3+的高選擇性探針(圖1)。用摩爾比和Job法分別進(jìn)行了Fe3+對羅丹明席夫堿的熒光及吸收滴定實驗(圖2),推測出Fe3+和羅丹明席夫堿形成為1∶1的配合物。熒光和吸收法分別計算得Fe3+與羅丹明席夫堿的相互作用穩(wěn)定常數(shù)分別為1.51×104和2.80×104L·mol-1。并根據(jù)文獻(xiàn)方法測定了配合物的熒光量子產(chǎn)率(Ф)為0.70。常見共存金屬離子的干擾實驗結(jié)果表明除Cu2+外(相對于Fe3+濃度1.5倍),在Fe3+-羅丹明席夫堿溶液中加入相對于Fe3+濃度2.5倍的其他大部分常見金屬離子時,均不會對Fe3+誘導(dǎo)羅丹明席夫堿的熒光及紫外響應(yīng)產(chǎn)生影響。表明該羅丹明席夫堿可作為檢測Fe3+的高靈敏度探針。2.2配合作用的鑒定用HPLC方法分別對羅丹明席夫堿及Fe3+-羅丹明席夫堿配合物溶液的色譜進(jìn)行了分析。在保留值為8.4min處出現(xiàn)羅丹明席夫堿色譜峰。而在羅丹明席夫堿中加入Fe3+的混合溶液,一個新的色譜峰出現(xiàn)在保留值為6.4min處,原來的羅丹明席夫堿色譜峰仍然存在且強度明顯減弱,表明出現(xiàn)了新的配合物。羅丹明席夫堿及Fe3+配合物混合乙醇溶液的IR光譜測定見圖3。加入Fe3+前后羅丹明席夫堿在1681cm-1處的羰基特征峰變化顯著,CN峰(1615cm-1)強度明顯減弱,我們推斷羰基和CN參與了配合作用。羅丹明席夫堿及其Fe3+配合物的1HNMR核磁譜如圖4所示,在羅丹明席夫堿中加入Fe3+后,峰形明顯變寬,羅丹明結(jié)構(gòu)部分的質(zhì)子大多向低場移動(δ=0.06～0.41ppm),例如Hp,Ha,Hc,Hb,Hd,Hf,He,Hg(δ=0.16,0.32,0.34,0.41,0.12,0.11,0.19,0.06ppm),這是由于羅丹明生成了醌式結(jié)構(gòu),導(dǎo)致電子云密度降低。實驗結(jié)果與文獻(xiàn)類似。以EDTA為配合競爭試劑,在Fe3+-羅丹明席夫堿配合物溶液中加入相對于羅丹明席夫堿80倍的EDTA,發(fā)現(xiàn)溶液立即褪色,熒光淬滅;當(dāng)再加入100倍的Fe3+(相對于羅丹明席夫堿)后,溶液顏色、熒光及吸收強度均恢復(fù)接近未加競爭試劑前,此過程證明了配合反應(yīng)的可逆性。從以上實驗結(jié)果我們推測出配合作用的機理如Scheme2所示。由于配合物的形成,誘導(dǎo)探針的螺環(huán)結(jié)構(gòu)打開,發(fā)生熒光及吸收顯著變化,這與文獻(xiàn)報道的羅丹明類探針響應(yīng)金屬離子的離子誘導(dǎo)作用相同。2.3檢出限和定量限測試表明,Fe3+濃度在0.4～20×10-6mol·L-1(R=0.9914,n=8)和2.0～8.0×10-5mol·L-1(R=0.9967,n=11)間,溶液熒光強度與Fe3+濃度呈線性相關(guān),計算得檢出限為4.24×10-8mol·L-1;以556nm為最大吸收波長測定紫外吸收,Fe3+響應(yīng)的濃度在0.4～80×10-6mol·L-1(R=0.9968,n=17)范圍內(nèi),檢出限為2.01×10-7mol·L-1。在上述最佳實驗條件下,對自制含鐵樣品溶液進(jìn)行了檢測,其結(jié)果如表1所示,具有良好的回收率和較低的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。2.4配合物與bsa的結(jié)合常數(shù)研究蛋白質(zhì)與配體之間的相互作用及動力學(xué)過程,對解釋蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系及蛋白質(zhì)與各種配體的作用機制意義重大。利用小分子配體與生物大分子結(jié)合前后的光譜差異,在不分離的情況下用分子光譜研究配體與蛋白質(zhì)分子的相互作用。分別以羅丹明席夫堿及Fe3+-羅丹明席夫堿配合物為探針,研究了與牛血清蛋白(BSA)作用的熒光光譜特征。發(fā)現(xiàn)單純的配體與BSA作用的光譜強度變化靈敏度遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于配合物的作用,初步建立了利用金屬配合物作為探針研究測定痕量蛋白質(zhì)的方法。在室溫下配合物能迅速與蛋白質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物,并可穩(wěn)定5h,其熒光強度基本保持不變。在一定的BSA濃度范圍內(nèi),隨BSA濃度的增大,Fe3+-羅丹明席夫堿配合物的熒光強度逐漸降低,并具有良好的線性關(guān)系,線性范圍為1.0～10μg·mL-1,檢出限可達(dá)3.78×10-2μg·mL-1。隨著溫度的升高,猝滅曲線斜率降低,初步證明該過程為靜態(tài)猝滅。其熒光強度變化用靜態(tài)猝滅公式求得不同溫度下的KA和n,結(jié)果見表2。數(shù)據(jù)顯示,Fe3+-羅丹明席夫堿配合物與BSA的結(jié)合常數(shù)較大,且溫度對結(jié)合常數(shù)KA影響很小。較大的KA數(shù)值說明Fe3+-羅丹明席夫堿配合物與BSA之間有較強的結(jié)合作用,可以被蛋白質(zhì)運輸和儲存。有機小分子和蛋白質(zhì)之間的作用力主要有疏水作用力、氫鍵、范德華力和靜電引力等。不同分子與蛋白質(zhì)結(jié)合力的類型不同。由表2中數(shù)據(jù):ΔH<0,ΔS>0,說明配合物與BSA之間的主要作用力為靜電引力,且ΔG<0,所以配合物與BSA之間的結(jié)合反應(yīng)是自發(fā)進(jìn)行的,可以作為研究BSA的標(biāo)記試劑。3與fe3+及羅丹明席夫堿配合物的催化劑的區(qū)別合成了一種新型羅丹明