蛋白質生化技術實驗報告

蛋白質生化實驗報告生殖免疫研究所薛櫻子學號：1133111003實驗一溶液中蛋白質濃度的測定一光吸收法（測量范圍：0.1—2mg）1實驗原理：由于蛋白質中存在著含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸，它們具有吸收紫外光的性質，其吸收高峰在280nm波長處，且在此波長內吸收峰的光密度值OD280nm與其濃度成正比關系，故可作為蛋白質定量測定的依據(jù)。

純蛋白的A280/A260為1.8，純核酸的A280/A260為2步驟：2.1）打開儀器的電源開關（接220V交流電），打開比色槽暗箱蓋，選擇光源，選檔，選波長，用調零旋鈕調暗電流至0。2.2）將空白對照樣品和待測溶液裝入石英比色杯2.3）將儀器的比色槽暗箱合上，比色槽處于蒸餾水（或校正緩沖液）校正位置，旋轉光量調節(jié)器使電表指針正確處于0。2.4）拉出比色槽手柄拉桿使比色槽處于樣品位置讀數(shù)。2.5）在260nm和280nm分別讀數(shù)（分別用緩沖液調0），根據(jù)上表查處相應蛋白濃度，根據(jù)喜事倍數(shù)計算原溶液蛋白濃度，根據(jù)體積計算總蛋白量。3結果與分析：A280=0.571A260=0.340根據(jù)公式：蛋白濃度=1.5×A280—0.75×A260=1.5×0.571—0.75×0.340=0.6015也可以根據(jù)蛋白質和核算含量折算圖表畫出一條直線估算蛋白質的濃度。結果說明我的蛋白樣品濃度是0.6015mg/ml。二Folin—酚法（測量范圍：10-300ug/ml）1實驗原理：在堿性條件下，蛋白質中的肽鍵與銅結合生成復合物。Folin—酚試劑中的磷鉬酸鹽—磷鎢酸鹽被蛋白質中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產(chǎn)生深藍色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）。在一定的條件下，藍色深度與蛋白的量成正比。2試劑：2.1）甲液：１，4%碳酸鈉；2，0.2n氫氧化鈉；3，1%硫酸銅；4,2%酒石酸鉀鈉。1和2，4溶于500ml水中，然后和4以50：1混合。當天使用。2.2）乙液：市售的Folin—酚試劑1：1稀釋成乙液（1N）3操作:3.1）標準曲線的制作：取12支大試管，分別加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.6毫升標準蛋白質溶液（濃度為300ug/mlBSA）。用水補足到2.0毫升，各管蛋白濃度分別為0，15ug/ml，30ug/ml，60ug/ml，90ug/ml，120ug/ml，180ug/ml，240ug/ml，300ug/ml，3.2）然后每支試管取0.3ml加入1.5毫升試劑甲迅速混合，于室溫（20～25℃）放置10分鐘。再逐管加入0.15毫升試劑乙（Folin—酚試劑），同樣立即混勻于室溫（20～25℃）放置30分鐘。3.3）用蛋白濃度為0的管調零，650nm測各管的OD值。每個濃度的管至少測兩次取它們的平均值。以A650為縱坐標，蛋白濃度為橫坐標做標準曲線。4結果與分析由于我當時把甲液乙液搞混淆了，所以用后面的考馬斯藍梯度濃度的蛋白重新做了，結果如下。蛋白濃度ug／ml037.515304560A65000.0360.130.050.0910.1490.188將這七組上數(shù)據(jù)作圖得到下表：分析圖表去掉第二三個偏離直線的點，得到此方程Y=0.003X待測蛋白的A650是0.255帶入上方程得到，此蛋白的濃度為293ug/ml。5注意事項5.1）加入甲液這一步混合速度要快，否則會使顯色程度減弱。5.2）甲液乙液不要弄混淆了5.3）由于各種蛋白質含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，顯色的深淺往往隨不同的蛋白質而變化。因而本測定法通常只適用于測定蛋白質的相對濃度（相對于標準蛋白質）。三考馬斯藍G—250法（測量范圍：10-200ug/ml）1實驗原理考馬斯亮藍G-250測定蛋白質含量屬于染料結合法的一種。考馬斯亮藍G-250在游離狀態(tài)下呈紅色，最大光吸收在488nm；當它與蛋白質結合后變?yōu)榍嗌?，蛋白質-色素結合物在595nm波長下有。其光吸收值與蛋白質含量成正比，因此可用于蛋白質的定量測定。2試劑2.1）蛋白試劑考馬斯亮藍G-250的配制：稱取100mg考馬斯亮藍G-250，溶于50mL95％乙醇中，加入88％（W／V）的磷酸100mL，最后用蒸餾水定容到1000mL于4℃保存。3操作步驟3.1）各取20ul，50ul，100ul，200ul，300ul，400ul標準蛋白液（500ug／ml），用蒸餾水或緩沖液稀釋成1ml，各管蛋白濃度分別為10ug／ml，25ug／ml，50ug／ml，100ug／ml，150ug／ml，200ug／ml。3.2）各取0.1ml考馬斯藍液置于微量測定板的孔中，每孔加入10ul標準蛋白或經(jīng)蒸餾水稀釋的待測樣品，并以兩孔加入同體積的蒸餾水作為空白對照。3.3）震蕩均勻，2min后測定A595。4結果處理與分析4.1）由1～6號管的數(shù)據(jù)，以蛋白質含量(mg)為橫坐標，A595為縱坐標，在坐標紙上繪制標準曲線；

4.2）求樣品管A595的平均值A595；4.3）由平均值A595從標準曲線中求樣品管中蛋白質的含量(mg)；

蛋白濃度ug／ml0102550100150200樣品A5950.350.3360.3710.3950.4680.5260.6020.632分析圖表得到蛋白濃度與吸光值之間的方程：Y=0.0013X+0.3353將我們的待測蛋白代入方程得到蛋白濃度為228.07ug／ml。樣品在最開始稀釋了3倍，因此此結果要乘以三，則得出的最終樣品蛋白濃度為228.07×3=684.2ug／ml實驗二FPLC系統(tǒng)的使用，柱效測定1FPLC的使用：開機→進入界面→檢查報警設置→洗泵→排氣泡→接柱→選流速→基線調零→打開記錄→命名結果→開始實驗→保存結果2裝柱2.1）溶液過濾2.2）柱子底部排氣，擰緊，反向進水約2cm高，關緊出口，接上裝柱器2.3）混勻凝膠，倒出所需體積凝膠，倒進裝柱器2.4）打開出口，連接儀器和裝柱器，調至凝膠耐受的最大壓力，恒速裝柱2.5）柱子體積不變時，暫停，取下裝柱器2.6）調節(jié)器排氣，插入柱中，固定外羅口，調節(jié)柱頭至凝膠2mm深處，擰緊2.7）按裝柱壓力繼續(xù)壓緊柱子，如出現(xiàn)空隙，再次調低柱頭，至柱子體積不變，換液平衡3測柱效（編程，采用自動上樣的方法）1％的丙酮上樣500ul，流速1ml/min，觀察峰形，用軟件計算柱效。4注意事項

4.1）儀器管路維護：每次工作結束后，用超純水沖洗管路，并用20％乙醇保存管路。

4.2）系統(tǒng)泵的維護：將系統(tǒng)泵的清潔管道放入20％乙醇清潔液中，并定期更換清潔液。

4.3）所有的緩沖液和樣品必須用0.45um/0.22um的微孔過濾。5實驗結果分析N=5.54（Ve/W1/2）2Ve：開始加樣至峰值的洗脫體積（保留體積）；W1/2：即峰高度一半處的峰寬的洗脫體積HETP=L/N=柱高cm/5.54（Ve/W1/2）2100cmL：柱床高度（M）對稱值As=b/a，As大于1，峰形拖尾，表示柱床過松；As小于1，峰形前伸，表示柱床過緊。離子交換層析及疏水層析，As一般在0.8與1.8之間，凝膠過濾層析，As一般在0.7與1.3之間。結果:根據(jù)這些公式以及計算方法測得柱效為811（N/m）。實驗三蛋白質的脫鹽凍干1凝膠過濾法：1.1實驗原理凝膠是一種多孔性的不帶表面電荷的物質，當帶有多種成分的樣品溶液在凝膠內運動時，由于它們的分子量不同而表現(xiàn)出速度的快慢，在緩沖液洗脫時，分子量大的物質不能進入凝膠孔內，而在凝膠間幾乎是垂直的向下運動，而分子量小的物質則進入凝膠孔內進行“繞道”運行，這樣就可以按分子量的大小，先后流出凝膠柱，達到分離的目的。2脫鹽柱手動操作方法2.1先用注射器推入5ml水洗柱2.2用注射器推入1.5ml樣品2.3用注射器裝5ml水到柱子上2.4用收集管接住出口，推1.5ml，收集樣品2.5繼續(xù)推入剩余的水，繼續(xù)用注射器推入5到10ml水洗柱2.6用注射器推入5ml20%乙醇，封閉下口，移走注射器，再封閉上口3注意事項：每次拔注射器前都要用小蓋堵住出口，每次接住注射器之前都要排走柱子上方的氣泡，以保證柱子不進空氣，不干柱。3透析法原理：透析法是利用小分子物質在溶液中可通過半透膜，而大分子物質不能通過半透膜的性質，達到分離的方法3.1操作脫鹽→濃縮脫鹽：將透析袋一段用透析夾夾住，倒入樣品，夾住另一端，查漏。置大燒杯中，加入蒸餾水，打開磁力攪拌，4小時換液一次，記錄樣品體積和加入蒸餾水量及體積，計算透析效率。濃縮：將透析袋一端用透析夾夾住，倒入樣品，夾住另一端，查漏。置一容器中，用PEG20000（或凝膠等）埋住，定期觀察剩余體積至滿意。4濃縮凍干4.1操作步驟樣品預冷→冷井預冷→打開凍干樣品蓋子，離心旋轉→打開真空泵→濃縮后取出樣品，關機，關電源。5實驗結果分析無色素時：第一次是為無色素蛋白樣品，第一次是從23.5ml開始加樣，到50.5ml蛋白峰降到最低，統(tǒng)計計算出樣品的量是51-23.8=27.2ml，同樣第二次加樣為105.5-78.5=27ml，沒有色素時峰形較單一，可以直接統(tǒng)計出。有色素時：有色素的蛋白樣品峰形，色素帶和蛋白帶連在一起，如果單純根據(jù)峰的出現(xiàn)沒有辦法知道什么時候停止收樣，這樣就根據(jù)上圖的蛋白量來進行。第一次加樣從24.5m開始加樣，根據(jù)蛋白體積是27ml可知，應該到51.5ml就停止收樣，第二次從100.5ml開始收樣，到127.5ml停止收樣，第三次從200ml到227ml是第三次收的蛋白樣，依次按照這個方法就可以正確收到目的蛋白。實驗四金屬螯合層析1實驗原理:該方法是利用蛋白質表面暴露的一些氨基酸殘基和載體之上的金屬離子之間的相互作用而進行的親和純化。2操作步驟：2.1蒸餾水洗柱，用0.5倍體積的0.1mol／LNicl上柱2.2蒸餾水洗回基線為02.3用5倍體積上樣緩沖液平衡柱子2.4樣品調PH、過濾、上樣2.5上樣緩沖液洗至基線回02.6用0.02mol／LPB+0.5mol／LNicl洗弱結合蛋白2.7柱子的再生2.8樣品的進一步純化3實驗結果分析前面有穿透峰可能是雜蛋白，當咪唑的濃度達到50％時蛋白峰出現(xiàn)，收集該蛋白，到75％時又有蛋白峰出現(xiàn)，但根據(jù)經(jīng)驗該峰不是目的蛋白峰，到100％時的峰表示一些高鹽結合的色素被洗脫下來。對收集的樣品進行脫鹽處理，驗證目的蛋白，75％（樣品1）和100％（樣品2）的進行脫鹽處理時，樣品1蛋白峰后出鹽，然后出色素峰，但樣品2就沒有蛋白峰出現(xiàn)，只在出鹽后出現(xiàn)色素峰，證明樣品1才是目的蛋白樣品。實驗五SDS和凝膠染色定量1實驗原理：SDS能使蛋白質的氫鍵、疏水鍵打開，并結合到蛋白質分子上，形成蛋白質-SDS復合物。由于十二烷基硫酸根帶負電，它的量大大超過了蛋白質分子原有的電荷量，因而掩蓋了不同蛋白質間原有的電荷差別從而將將蛋白質分離成若干條區(qū)帶，如果分離純化的樣品中只含有同一種蛋白質，蛋白質樣品電泳后，就應只分離出一條區(qū)帶。2試劑配制2.1）10％分離膠配制（6ml）30％凝膠貯液330ul1.5mol/LTris-HCl,PH8.8250ulH2O250ul10％SDS60ul10％過硫酸銨35ulTEMED5ul2.2）4％濃縮膠的配制30％凝膠貯液330ul1.5mol/LTris-HCl,PH6.8625ulH2O1.5ml10％SDS25ul10％過硫酸銨15ulTEMED5ul2.3）樣品溶解液的配制1.5mol/LTris-HCl,PH6.82.5ml10％SDS2ml甘油1mlH2O4.5ml溴酚藍少許共10ml2.4）電泳液的配制Tris3g甘氨酸14.4gSDS1g加蒸餾水至1000ml（PH8.3）2.5）蛋白染色和