基因工程演示文稿

基因工程在轉(zhuǎn)基因食品中的應(yīng)用

以植酸磷為唯一磷源生長的轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)型油菜

小組成員：張莉娟，王暗唐亞楠，蔣俊利磷在土壤中由于強(qiáng)吸附作用、低溶解性以及難移動性等因素的影響，使得其有效性很低，因此成為限制植物生長的重要因子之一。在酸性和堿性土壤中，磷主要以植物難以直接利用的難溶性磷存在，其中有機(jī)磷占上壤總磷量的50%-80%，其中有機(jī)磷的20%~50%是植酸磷

。在大豆、油菜、玉米等主要農(nóng)作物種子中磷的基本存在形式也

是植酸磷。植物只能吸收利用無機(jī)磷,有機(jī)磷只有在植酸酶的作用下分解釋放出無機(jī)磷后才能被吸收利用。植酸酶(phytase)是一種能水解植酸的磷酸酶類,在一定條件下能將植酸分解成為肌醇和磷酸。自然條件下,植物根系能分泌有機(jī)酸和少量磷酸酯酶(主要是植酸酶),降低根圍土壤pH,促使土壤難溶性礦物磷酸鹽的溶解和水解土壤中的植酸和其他有機(jī)磷, 釋放出無機(jī)磷供植株吸收利用。但研究表明,植物通過這兩種方式吸收利用土壤中植物難利用磷的能力很弱,植物本身并不能大量產(chǎn)生胞外植酸酶。甘藍(lán)型油菜是我國重要的油料作物,甘藍(lán)型油菜又是對磷素很敏感的作物,土壤缺有效磷可引起減產(chǎn),開展甘藍(lán)型油菜磷素營養(yǎng)高效利用遺傳改良、篩選和培育油菜磷利用高效品種,是解決土壤缺磷的有效途徑之一。Ponstein等將來源于A.niger植酸酶phyA基因轉(zhuǎn)移到油菜籽中,用種子特異性啟動子CruA控制phyA,并在植酸酶成熟肽前加上十字花科信號肽序列,結(jié)果發(fā)現(xiàn)95%的油菜籽中檢測到植酸酶的活性。研究原理：以油菜具柄子葉為外植體,應(yīng)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法,將具有胞外分泌信號肽序列的植酸酶基因轉(zhuǎn)入甘藍(lán)型油菜。通過植酸酶在植株根系中表達(dá)并分泌至胞外,使植株根系分泌物中含大量高活性的植酸酶以水解土壤中的植酸,釋放出磷供植株吸收利用。探索通過基因工程技術(shù)提高油菜對土壤有機(jī)磷的利用效率,建立土壤有機(jī)磷→植物可利用的無機(jī)磷→植物儲存的有機(jī)磷→土壤有機(jī)磷的植物磷素營養(yǎng)循環(huán)利用的環(huán)保型新途徑。材料與方法

1.試驗(yàn)材料：受體材料是由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料所選育的甘藍(lán)型油菜品種中雙6號。根癌農(nóng)(Agrobacteriumtumfaciens)菌株LBA4404。植物表達(dá)載體pBINPR-phyI為含帶胞外分泌信號肽序列的植酸酶基因和NPTⅡ基因。檢測植酸酶基因所用引物。植物表達(dá)載體如圖

植物表達(dá)載體pBINPR-phyI構(gòu)建圖譜2外植體的選擇和農(nóng)桿菌菌液的制備

飽滿的中雙6號種子消毒,植入1/2MS培養(yǎng)基生長3~4d,從子葉節(jié)上1mm處切下具柄子葉作為外植體。將一含有植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌單菌落劃線于含50mgL–1kan的YEB固體培養(yǎng)基上,28℃培養(yǎng)1~2d,用1/2MS液體培養(yǎng)基(pH5.4)洗下菌體,并將菌液稀釋至OD600＝0.08,作為侵染用菌液。3根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化甘藍(lán)型油菜將油菜具柄子葉置侵染用農(nóng)桿菌菌液中,22℃侵染5~10min,其間輕輕搖動。撈出后在無菌吸水紙上吸干菌液,將子葉轉(zhuǎn)至MS+1mgL–12,4-D+0.2mgL–16-BA培養(yǎng)基上,22℃暗培養(yǎng)2~3d,然后轉(zhuǎn)移到MS+4.5mgL–1BA+5mgL–1AgNO3+500mgL–1Cb(羧芐)上延遲培養(yǎng)5~7d,再轉(zhuǎn)至篩選培養(yǎng)基MS+4.5mgL–1BA+5mgL–1AgNO3+500mgL–1Cb+10~20mgL–1kan上培養(yǎng)2~3周,待再生綠苗長至1~2cm時,切下,植入生根培養(yǎng)基MS+0.2mgL–1NAA+20mgL–1kan上,待根系發(fā)達(dá)成為完整植株時,經(jīng)煉苗移栽在花盆中遮蔭保濕培養(yǎng)(以上培養(yǎng)基均含3%蔗糖,并用0.8%的瓊脂固化,pH5.8。培養(yǎng)條件為25℃、光16h/暗8h)。農(nóng)桿菌菌液濃度和侵染時間對轉(zhuǎn)化的影響侵染時間農(nóng)桿菌菌液濃度（OD600)接種外植體數(shù)再生綠芽轉(zhuǎn)化率2min0.020.083445970100.165min0.050.080.12472576522125302.549.2008min0.050.08492483911.800.35實(shí)驗(yàn)平均轉(zhuǎn)化率為2%。農(nóng)桿菌的濃度和感染時間是影響遺傳轉(zhuǎn)化率的重要因素。試驗(yàn)證明,當(dāng)農(nóng)桿菌菌液濃度(OD600)在0.05~0.08時處理外植體5~10min,效果較好4轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測采用CTAB法[26]提取植物基因組DNA,上游引物為5′-AGCGAGACGTTCAACAATACGC-3′,下游引物為5′-GCAGAATACCCATCCAATTCCTT-3′,以非轉(zhuǎn)基因油菜植物總DNA為陰性對照,以質(zhì)粒DNA為陽性對照,采用20μL反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)程序?yàn)?4℃4min,94℃30s、53℃30s、72℃45s,30個循環(huán),72℃5min。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測?？剐灾仓甑腜CR及Southern檢測轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測結(jié)果M:DNAmarker;1~7:轉(zhuǎn)基因植株DNA擴(kuò)增片段;CK?:陰性對照;CK+:陽性對照