腺病毒的分子機制

腺病毒的分子機制

自20世紀(jì)50年代初發(fā)現(xiàn)胰腺病毒以來，它已被廣泛研究。腺病毒(Adenovirus,Ad)載體與反轉(zhuǎn)錄病毒載體相比,能有效地將外源基因轉(zhuǎn)染到各種靶細胞或組織中,載體易于構(gòu)建和操作、宿主范圍廣、感染性強、可經(jīng)不同途徑進入不同組織,能感染分化后的非分裂期細胞。在Ad的生活周期中,其基因不整合到宿主細胞中,無插入突變激活癌基因的危險。且外源基因能游離地表達,因而具有廣泛的組織親和性,這使得腺病毒成為表達和傳遞治療基因的主要候選者。1病毒和疾病的一般特征1.1正雙型血清型血清型人腺病毒屬virus腺病毒屬于腺病毒科(Adenoviridae)。根據(jù)宿主范圍不同,將腺病毒分為哺乳動物腺病毒(Mastadenovirus)和禽類腺病毒(Aviadenovirus)兩個屬。人腺病毒分為6個種,即人腺病毒A、B、C、D、E、F,共有47個血清型。人類腺病毒2型、5型、7型和12型以及許多動物腺病毒的DNA結(jié)構(gòu)、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄特征已經(jīng)清楚,而且腺病毒易于培養(yǎng)和純化,病毒產(chǎn)量高,多數(shù)腺病毒對機體無致癌性,許多疫苗毒株在人和動物體內(nèi)長期應(yīng)用未見不良反應(yīng)。1.2基底和纖突iii腺病毒具有特征性的二十面體病毒殼體。其病毒殼體含有3種主要蛋白,即六鄰體(II)、五鄰體基底(III)和纖突(IV)。腺病毒基因組DNA為線狀雙鏈,長約30~38kb,其DNA分子各含有100~140bp反向重復(fù)(invertedterminalrepetition,ITR)末端,5′端連接有末端蛋白(terminalprotein,TP)。1.3病毒毒素的轉(zhuǎn)移和復(fù)制1.3.1早期mrna轉(zhuǎn)錄腺病毒五鄰體上的纖突蛋白與兩種細胞受體結(jié)合后,腺病毒DNA進入宿主細胞核。隨后,病毒基因組立即開始進行早期mRNA轉(zhuǎn)錄。在轉(zhuǎn)染2~3h后,早期mRNA被翻譯成E2A基因編碼的SSB蛋白、E2B基因編碼的DNA聚合酶和DNA末端結(jié)合蛋白等數(shù)種早期蛋白,這些酶和蛋白都是腺病毒DNA復(fù)制所必需的。1.3.2dna的合成腺病毒在感染約8h后開始DNA復(fù)制,再經(jīng)歷大約8h達到合成的最高峰。其DNA合成是不同步的,從線狀DNA的兩個5′端開始向兩個方向延伸,直到分子的另一端。其起始引物是病毒編碼的末端蛋白和與之結(jié)合的dCMP。病毒粒子的裝配一般發(fā)生在感染后13~24h。2病毒防護裝置的歷史發(fā)展2.1病毒無法分離的外源基因后重組腺病毒在10a前,大多數(shù)腺病毒載體是用體外連接方法構(gòu)建的。如構(gòu)建hAd5載體,首先要構(gòu)建一個含有hAd5的DNA左側(cè)序列(含有左側(cè)的ITR、包裝信號及E1A增強子序列)的質(zhì)粒,將外源基因連接在質(zhì)粒中腺病毒DNA序列的下游。用ClaI消化質(zhì)粒,將含有病毒左側(cè)序列及外源基因的片段與經(jīng)ClaI消化的hAd5的DNA大片段進行連接,將病毒E1A基因替換掉。再用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)染293細胞,產(chǎn)生重組腺病毒。但這種方法效率低,并且需用蝕斑方法純化重組病毒。2.2利用兩個含有重疊核酸片段的質(zhì)粒進行構(gòu)建利用在腺病毒E1轉(zhuǎn)化的輔助細胞(293細胞)內(nèi)的同源重組機制構(gòu)建重組腺病毒載體。這種方法是利用兩個含有重疊核酸片段的質(zhì)粒進行構(gòu)建。該方法的缺點是同源重組的效率低,并且由于質(zhì)粒的腺病毒基因組可能與整合進293細胞染色體的腺病毒DNA發(fā)生同源重組,產(chǎn)生野生型腺病毒(約占20%~70%),因此,需用蝕斑純化,費時費力。2.3重組腺病毒基因重組菌的構(gòu)建利用recBCsbcBC大腸桿菌(BJ5183)內(nèi)高效率的同源重組機制構(gòu)建腺病毒載體。載體質(zhì)粒含有腺病毒全基因組或缺失E3區(qū)的腺病毒基因組,基因組兩側(cè)引進PacI位點。該質(zhì)粒含有氨芐青霉素抗性基因。穿梭質(zhì)粒含有腺病毒基因組的左側(cè)序列,包括左側(cè)的ITR、包裝信號和與載體質(zhì)粒發(fā)生重疊的E1區(qū)的下游序列,以便將目的基因克隆進穿梭質(zhì)粒。用ClaI(在E1缺失區(qū))對載體質(zhì)粒進行酶切,然后與穿梭質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化recBCsbcBC大腸桿菌,發(fā)生同源重組。然后重新轉(zhuǎn)化其他菌株(如DH5α),提取質(zhì)粒進行酶切鑒定。用PacI對陽性重組子進行酶切,轉(zhuǎn)染293細胞,包裝產(chǎn)生重組腺病毒。該方法產(chǎn)生野生型病毒的幾率很低,不需要用蝕斑進行純化。2.4重組人scei用兩個質(zhì)粒載體在體外進行連接,構(gòu)建腺病毒載體。載體質(zhì)粒含有缺失E1/E3的hAd5的基因組和3個單一的酶切位點(I-CeuI、SwaI和PI-SceI)。在穿梭質(zhì)粒多克隆位點的兩側(cè)含有I-CeuI和PI-SceI酶切位點。將目的基因克隆進穿梭質(zhì)粒,用I-CeuI和PI-SceI對載體質(zhì)粒和穿梭質(zhì)粒進行消化,將兩個目的片段進行連接。然后用SwaI對連接產(chǎn)物進行消化,以防止非重組基因組的產(chǎn)生。先用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌,再用PacI消化重組子,轉(zhuǎn)染293細胞,包裝產(chǎn)生重組腺病毒。改良的體外連接方法與細菌內(nèi)同源重組法相比有以下優(yōu)點:只需簡單的分子生物學(xué)技術(shù),不用再次轉(zhuǎn)化其他大腸桿菌。2.5外源基因克隆進e區(qū)和3g區(qū)利用PacI位點將一個外源基因克隆到E3區(qū),然后利用在293細胞內(nèi)的同源重組機制將另外一個外源基因插到E1缺失處。另外,還可利用細菌內(nèi)同源重組機制將兩個目的基因克隆進E1區(qū)和E3區(qū)。首先,用線性化的含外源基因的E3缺失區(qū)穿梭質(zhì)粒與線性化的載體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化recBCsbcBC大腸桿菌,這樣就獲得了在E3缺失區(qū)插入外源基因的重組基因組載體;然后,將另一外源基因按同樣的方法克隆進E1缺失區(qū)。雙表達載體的主要優(yōu)點是分別將兩個基因插進E1缺失區(qū)和E3缺失區(qū),在同一個載體中能同時有效地進行表達。2.6第二代及其融合的病毒載體第二代腺病毒載體是在第一代腺病毒載體的基礎(chǔ)上進一步完善和發(fā)展起來的。降低重組病毒載體誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫反應(yīng)是新型腺病毒載體構(gòu)建的著眼點。Krougliak等用含有E4和pIX基因編碼序列(分別在小鼠乳腺瘤病毒和金屬硫蛋白啟動子控制下)的載體轉(zhuǎn)染293細胞,獲得了表達E1、E4和pIX蛋白的兩個細胞系(VK2-20和VK10-9),不僅可有效轉(zhuǎn)染DNA,而且可使腺病毒及重組體得到增殖。用此細胞系,構(gòu)建了一種缺失2.7kbE3區(qū)和2.8kbE4區(qū)重組病毒。E1-E3-E4-Ad比E1-Ad和E1-E3-Ad毒性更小、更安全,因而更適于基因治療。采用上述方法構(gòu)建的新型重組腺病毒載體稱為第二代腺病毒載體,但它也存在一些缺陷:腺病毒載體上仍有許多病毒蛋白,不能完全消除腺病毒的免疫原性。近幾年來,出現(xiàn)的第三代腺病毒載體有了較大的突破,該載體只保留了腺病毒必要的順式作用元件,即基因組兩端ITR和包裝信號序列,總長不到1kb。這種新型載體具有第一代載體的優(yōu)點,即容量進一步擴大、細胞毒性和免疫原性大幅度減弱、目的基因的表達時間大大延長;不足之處是輔助病毒的產(chǎn)量很高。這種方法的延伸包括用腺相關(guān)病毒(AAV)ITRs形成雜交載體。最近,通過使用Maloney白血病病毒的長末端重復(fù)序列已經(jīng)開發(fā)了一個相似的方法,因為通常并不引起局部體液免疫,所以在體內(nèi)和體外模式體系中都在有利于轉(zhuǎn)基因的持久性方面顯示了良好的應(yīng)用前景。目前,動物腺病毒載體也已作為疫苗載體而被廣泛使用。3基于had載體的重組疫苗hAd在人群中普遍存在,對嬰兒和無免疫應(yīng)答者能致死。許多原因阻礙了hAd載體作為人和動物重組疫苗的實際應(yīng)用。動物腺病毒是高度種屬特異性的,雖能進入人細胞,但不能復(fù)制,因此不必考慮人體中預(yù)先存在的免疫反應(yīng)的問題,作為基因治療載體具有巨大潛力,并可作為動物病毒的活疫苗。3.1brv-1gd基因檢測Baxi等在E4區(qū)和右端ITR間插入SV40早期啟動子和polyA調(diào)控下的1.9kb的BHV-1gD基因構(gòu)建了重組病毒,結(jié)果證明該區(qū)域是BAV-3復(fù)制的非必需區(qū),在感染的早期和晚期均可表達gD蛋白。免疫接種?？色@得部分保護而不產(chǎn)生臨床癥狀,并且排毒時間減少。3.2豬3型腺病毒pav-3的對基因型別進行重組1999年,Reddy等和Hammond等1044報道了用豬腺病毒(PAV)構(gòu)建表達載體。在右末端處的HpaⅠ位點將SV40早期啟動子和SV40polyA控制下的CAT基因插入豬3型腺病毒(PAV-3)基因組,獲得了重組病毒。感染細胞后,早期表達水平低,感染后36h時達最高,能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生CSFV特異性中和抗體,能抵抗CSFV強毒的攻擊。3.3重組病毒的誘導(dǎo)表達綿羊腺病毒(OAV)基因組結(jié)構(gòu)特殊,許多基因的功能還不十分清楚。目前已經(jīng)構(gòu)建了含有堿性磷酸酶報告基因和羊寄生蟲抗原基因的重組OAV載體,用這些重組病毒感染羊胎肺細胞CSL503后,用免疫沉淀法可檢測到抗原的表達。如果將OAV的冗余序列及E1區(qū)缺失,構(gòu)建復(fù)制缺陷型載體,不但可大大增加其克隆能力,并且安全性也會得到改善。3.4fav10的載體構(gòu)建Sheppard等以雞10型腺病毒(Fowladenovirus10,FAV10)為載體構(gòu)建了表達傳染性法氏囊病毒(IBDV)VP2基因的重組病毒。該重組病毒沒有缺失FAV10基因組的任何部分,免疫接種SPF雞,可誘導(dǎo)產(chǎn)生抗IBDVVP2的抗體反應(yīng),并能保護雞免受IBDVV877的攻擊。4其他方面的應(yīng)用腺病毒載體能高效表達外源基因,并能對外源蛋白進行剪切、糖基化、磷酸化等翻譯后加工,表達的蛋白具有天然蛋白的特性,可用于