人類外周血培養(yǎng)及染色體核型分析

人類外周血培養(yǎng)及染色體核型分析一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?.學(xué)習(xí)外周血淋巴細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的原理和方法；2.利用培養(yǎng)后進(jìn)行分裂的細(xì)胞制備人類染色體標(biāo)本；3.利用人類染色體核型分析軟件進(jìn)行核型分析。二、實(shí)驗(yàn)原理：1、植物血凝素的作用外周血中的淋巴細(xì)胞幾乎都是處在G0或G1期，一般情況下是不分裂的。當(dāng)在培養(yǎng)基中加入植物血凝素(PHA)時，這種小淋巴細(xì)胞受到刺激后轉(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞，進(jìn)而開始進(jìn)行有絲分裂。2、秋水仙素的作用：秋水仙素(colchicines)可以抑制細(xì)胞紡錘體的形成，使處在分裂的細(xì)胞停留在中期。因此利用秋水仙素處理可以獲得許多同步的中期分裂細(xì)胞。使用秋水仙素處理會引起染色體在一定程度上的收縮，因此在處理時間和濃度上要合適。3、低滲的原理：徐道覺(T.C.Hsu)等于1952年發(fā)現(xiàn)在固定細(xì)胞之前使用低滲液進(jìn)行處理，可以使細(xì)胞的核膜吸水膨脹，滴片后細(xì)胞破裂，染色體分散開來，在顯微鏡下易于觀察和統(tǒng)計(jì)，染色效果也明顯提高。這種技術(shù)被廣泛采用后，使人類染色體分析技術(shù)得到了發(fā)展。4、核型和帶型：核型(karyotype)：是指染色體組在有絲分裂中期的表型,是染色體數(shù)目、大小、形態(tài)特征的總和。在對染色體進(jìn)行測量計(jì)算的基礎(chǔ)上,進(jìn)行分組、排隊(duì)、配對,并進(jìn)行形態(tài)分析的過程叫核型分析。將一個染色體組的全部染色體逐條按其特征畫下來，再按長短、形態(tài)等特征排列起來的圖稱為核型模式圖，它代表一個物種的核型模式。帶型（bandingpattern）即染色體帶型。借助細(xì)胞學(xué)的特殊處理程序，使染色體顯現(xiàn)出深淺不同的染色帶。染色帶的數(shù)目、部位、寬窄和著色深淺均具有相對穩(wěn)定性，所以每一條染色體都有固定的分帶模式，即稱帶型。常用的顯帶技術(shù)所顯示的帶有Q帶、G帶、C帶、R帶、T帶等。就每一種分帶技術(shù)而言，每一染色體的帶型是高度專一和恒定的。三、實(shí)驗(yàn)用具及試劑：實(shí)驗(yàn)儀器及用具：恒溫培養(yǎng)箱、離心機(jī)、恒溫水浴箱、冰箱、顯微鏡、顯微數(shù)碼攝像系統(tǒng)、染色體分析儀；培養(yǎng)瓶、注射器、微量移液器、槍頭、吸管、離心管(10ml)、載玻片、燒杯、量筒。2.實(shí)驗(yàn)試劑：外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基2%碘酒75%酒精20μg/ml秋水仙素0.075mol/LKCl溶液甲醇冰醋酸Giemsa原液1/15mol/L磷酸緩沖液四、實(shí)驗(yàn)步驟：1、采血：將皮膚常規(guī)消毒后靜脈采血約0.5ml。2、種血及培養(yǎng)：將采到的血樣立即接種到培養(yǎng)瓶內(nèi)，每個培養(yǎng)瓶接25－28滴（約0.5ml），輕輕搖勻后將培養(yǎng)瓶放在37℃溫箱中培養(yǎng)723、秋水仙素處理：在終止培養(yǎng)前4小時，向培養(yǎng)瓶中加20μg/ml的秋水仙素20μl，輕輕搖勻后繼續(xù)培養(yǎng)到72小時。4、制片：（1）離心：從溫箱中取出培養(yǎng)瓶，用吸管將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入10ml的刻度離心管內(nèi)。2000轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘。（2）低滲：棄去上清液。加入37℃0.075mol/LKCl低滲液6-8ml，用吸管輕輕吹打均勻，放在37℃恒溫水浴中30分鐘。(此時配固定液：甲醇225ml+冰醋酸（3）預(yù)固定：在離心管中加入現(xiàn)配的預(yù)溫的甲醇-冰醋酸(3:1)固定液約1ml，輕輕混勻,37℃固定15（4）再次離心：2000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘。（5）第一次固定：棄上清液，加入固定液約7ml，立即用吸管吹打使之成細(xì)胞懸液，室溫固定20分鐘。2000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘。（6）第二次固定：同第一次固定。（7）棄上清液，根據(jù)沉淀量的多少，加入適量固定液6～8滴，用吸管吹打使均勻后制成細(xì)胞懸液。（8）滴片：在10-15cm（9）染色：用10%吉姆薩染液扣染30分鐘，染色結(jié)束后用清水將浮色沖去，干燥后即可進(jìn)行鏡檢。（10）照相：在顯微鏡下尋找分散較好的分裂相(核型)，再置于顯微照相儀下拍攝照片，并保存。（11）核型分析：應(yīng)用核型分析軟件，進(jìn)行染色體核型分析。五、注意事項(xiàng):1、秋水仙素處理時間過長，分裂細(xì)胞多，染色體短小；反之，則少而細(xì)長。都不宜觀察形態(tài)及計(jì)數(shù)。故秋水仙素的濃度及時間要準(zhǔn)確掌握。2、低滲使紅細(xì)胞膜破裂，淋巴細(xì)胞膨脹，低滲處理濃度及時間要適當(dāng)。且低滲后混勻細(xì)胞一定要輕，否則引起膜破裂、染色體散失。3、離心前配平，離心速度過高，細(xì)胞團(tuán)不易打散；反之，細(xì)胞易丟失。4、固定液應(yīng)在使用前臨時配制。5、載玻片一定要潔凈，否則染色體分散不好。六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析：染色體核型分析：人類每個體細(xì)胞有46條染色體，22對常染色體和一對性染色體，男性為46，XY；女性為46，XX。（1）人類染色體分組A組（No.1～3）：是最大的一組染色體，它們的著絲粒在中部或幾乎在中部，為中部著絲粒染色體；B組（N0.4～5）：為兩對大的亞中部著絲粒染色體，它們有明顯的長臂和短臂；C組（N0.6～12+X）：為中等大小的亞中部著絲粒染色體，它們大小相差不多，X染色體大小介于期間，一般難以區(qū)分；D組（N0.13～15）：為中等大小的近端著絲粒染色體，它們的一個重要形態(tài)特征是隨體，隨體是一對著色很深的小球，處于短臂的末斷，隨體與短臂之間的區(qū)域很少著色；E組（N0.16～18）：包括一對中著絲粒染色體（16）和兩對亞中著絲粒染色體（17、18）；F組（N0.19～20）：為兩對小的中部著絲粒染色體；G組（N0.21～22+Y）：為最小的一組近端著絲粒染色體，在N0.21～22的短臂上可見隨體。Y染色體常呈現(xiàn)異固縮狀態(tài)，著色更深，可以識別。（2）人類染色體核型分析結(jié)果（1）染色體的相對長度=單個染色體長度*1000/22條常染色體總長+1條X染色體長度（2）臂比率=長臂長度/短臂長度（3）著絲點(diǎn)指數(shù)=短臂長度*100/染色體全長七、作業(yè)及思考題：1、將分散良好的標(biāo)本進(jìn)行顯微照相；2、觀察人類染色體的形態(tài)、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)；答：A組（No.1～3）：是最大的一組染色體，它們的著絲粒在中部或幾乎在中部，為中部著絲粒染色體；B組（N0.4～5）：為兩對大的亞中部著絲粒染色體，它們有明顯的長臂和短臂；C組（N0.6～12+X）：為中等大小的亞中部著絲粒染色體，它們大小相差不多，X染色體大小介于期間，一般難以區(qū)分；D組（N0.13～15）：為中等大小的近端著絲粒染色體，它們的一個重要形態(tài)特征是隨體，隨體是一對著色很深的小球，處于短臂的末斷，隨體與短臂之間的區(qū)域很少著色；E組（N0.16～18）：包括一對中著絲粒染色體（16）和兩對亞中著絲粒染色體（17、18）；F組（N0.19～20）：為兩對小的中部著絲粒染色體；G組（N0.21～22+Y）：為最小的一組近端著絲粒染色體，在N0.21～22的短臂上可見隨體。Y染色體常呈現(xiàn)異固縮狀態(tài)，著色更深，可以識別。3、對比男性和女性的染色體標(biāo)本，比較異同；答：相同點(diǎn)：每個細(xì)胞都有46條染色體，22對常染色體和1對性染色體。不同點(diǎn)：男性為46，XY；女性為46，XX。Y染色體常呈現(xiàn)異固縮狀態(tài)，著色更深；X染色體為中等大小的亞中部著絲粒染色體4、總結(jié)做好本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵因素。答：本實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵是標(biāo)本片子中的染色體分散良好，結(jié)構(gòu)明顯，易于區(qū)別，所以應(yīng)注意：1）使用秋水仙素處理會引起染色體在一定程度上的收縮，因此在處理時間和濃度上要合適。秋水仙素處理細(xì)胞時，時間應(yīng)控制適當(dāng)，時間過長，分裂細(xì)胞多，染色體短小，反之，細(xì)胞分裂想少，染色體細(xì)長，都不利于觀察和分析。2）低滲處理時時間要適當(dāng)，且混勻細(xì)胞時一定動作要柔和，否則，細(xì)胞膜破裂，染色體丟失。3）離心前要配平，離心速度合適，