克氏原螯蝦過敏反應模型的構建及評價

克氏原螯蝦過敏反應模型的構建及評價

克氏原始蝦，也被稱為小龍蝦，是近年來中國水產(chǎn)養(yǎng)殖面積顯著增加的淡水養(yǎng)殖。近年來，江蘇省已發(fā)展成為小型蝦業(yè)中的“著名商”。這種小型蝦的消費令人難以置信，已經(jīng)成為眾所周知的餐桌餐食之一。克氏原螯蝦是營養(yǎng)價值較高的食品,深受普通消費者喜愛,但由于部分人群食用小龍蝦后會產(chǎn)生食物過敏癥狀,部分報道有橫紋肌溶解癥狀,給部分人群的食用健康帶來威脅通常發(fā)生食物過敏是由于食物中的過敏原成分誘導機體的免疫系統(tǒng)發(fā)生超敏反應,并且通常是速發(fā)型的,典型的指標就是測定血清中的IgE抗體,同時抗原抗體的特異性結合會釋放出炎癥因子,如組胺,會帶來機體的紅腫熱痛等基本炎癥效果,對人體健康帶來威脅1材料和方法1.1實驗試劑和動物克氏原螯蝦,購于淮陰工學院附近水產(chǎn)市場,立即用清水洗凈表面,然后置于超低溫冰箱中,-80℃保存,待用;鼠源血清IgE抗體、組胺、IFN-γ、IL-4、IL-6等小鼠血清ELISA試劑盒購自于廣州優(yōu)迪生物。其它試劑均為國產(chǎn)分析純。模型動物選用SPF級別的雌性Balb/c小鼠,自南方醫(yī)科大學動物實驗中心購買,在廣州科學城孵化器實驗動物中心開展飼喂實驗,實驗操作均符合實驗動物倫理規(guī)定的要求。主要設備有松下MDF-U3386S立式超低溫冰箱、貝克曼庫爾特AvantiJ-E多用途高效離心機、賽默飛世爾FC型全自動酶標儀、德國SRKLYOGT2型冷凍干燥機。1.2方法1.2.1克氏原始蝦粗蛋白的制備參考張杰等1.2.2小鼠的致敏試驗實驗小鼠共分為兩組:皮下注射致敏組和PBS對照組。提取到的克氏原螯蝦蛋白經(jīng)皮下注射入致敏組小鼠體內,對照組采用PBS溶液代替,各組小鼠采用非含魚粉飼糧飼喂,預飼一周后開始正式試驗,連續(xù)三周按0.25mg/mL致敏原劑量進行致敏操作,末次致敏的隔日進行致敏的激發(fā),劑量加倍。1.2.3小鼠致敏生理性狀的觀察小鼠經(jīng)致敏及激發(fā)操作后,通過對小鼠尾靜脈注射EvansBlue染液,通過觀察小鼠足部腫脹情況及生理變化情況,了解致敏過程炎癥因子對血管通透性上的影響,從而確定小鼠是否發(fā)生食物過敏反應及反應嚴重程度。1.2.4大鼠血清指數(shù)的模型測定采用小鼠摘眼球取血,參考趙祥杰1.2.5數(shù)據(jù)分析分析檢測指標均進行三次重復,各數(shù)據(jù)利用SPSS12.0軟件進行統(tǒng)計分析。組間差異性顯著采用t檢驗,顯著水平為P<0.01。2結果與分析2.1皮膚長期致敏組小鼠焦失壓檢測模型小鼠發(fā)生食物過敏反應時,其在生理性狀上會發(fā)生改變,過敏時的炎癥反應會產(chǎn)生瘙癢、皮疹等癥狀,實驗中發(fā)現(xiàn),致敏組小鼠會在鼠籠中焦躁不安,皮膚摩擦鼠籠情況較為常見。通過在其尾部注射EvansBlue染液(圖1),結果發(fā)現(xiàn)致敏組(圖1A)小鼠足部充血較空白對照組(圖1B)嚴重,說明發(fā)生食物過敏反應時,由于炎癥因子的作用,帶來毛細血管通透性的提高,因此致敏小鼠多部位被染液染成藍色。2.2血清抗體含量小鼠發(fā)生食物過敏時會出現(xiàn)典型的I型超敏反應,血清中特異性sIgE會大量產(chǎn)生,而通過測定模型動物血清中的抗體含量,是判定模型結果的一個重要標志。從圖2中可以看出,致敏組小鼠血清中IgE抗體的濃度達到10.5ng/mL,而對照組小鼠血清中IgE的含量僅為3.5ng/mL,說明模型致敏組小鼠產(chǎn)生了明顯的食物過敏反應。2.3酰胺的含量測定發(fā)生食物過敏時小鼠機體會產(chǎn)生大量的sIgE用于機體免疫,當特異性抗體與致敏原物質發(fā)生特異性結合時,誘導結合的肥大細胞釋放組胺物質,而組胺物質會產(chǎn)生嚴重的炎癥反應,給身體健康帶來重大威脅,因此組胺的含量是確定抗體產(chǎn)生及其與抗原結合的重要指標,在食物過敏研究中具有重要意義2.4食物不良反應試驗中t細胞的生長白介素細胞因子是免疫過程中具有典型意義的指標,是速發(fā)型超敏反應過程中T細胞所分泌的,如IL-4、IL-6等均是食物過敏反應中產(chǎn)生的細胞因子。從圖4中可以看出致敏組小鼠血清中的IL-4和IL-6細胞因子的含量均高于對照組中所測定的含量,而且具有統(tǒng)計顯著性差異。2.5t細胞免疫分型血清中的IFN-γ是自體免疫中細胞免疫的主要效用成分,是與I型超敏反應效應物質截然不同的組分,也是對T細胞免疫分型的重要參考。從圖5中可以看出,致敏組模型小鼠血清中IFN-γ含量為22.7pg/mL,而空白對照組小鼠血清中IFN-γ含量為90.3pg/mL,致敏模型組IFN-γ含量低于其空白對照組,且達到顯著水平(P<0.01)。由上可知,均表明模型組小鼠產(chǎn)量顯著的I型超敏反應,模型初步構建成功。3開展產(chǎn)品普遍認可性研究,提高產(chǎn)品的市近年來克氏原螯蝦產(chǎn)業(yè)獲得了較快發(fā)展,克氏原螯蝦消費量驚人,但由于食用過敏或引發(fā)橫紋肌溶解癥的情況時有報道,引發(fā)普通消費者對食用克氏原螯蝦安全的憂慮,因此開展其過敏性研究對于提高產(chǎn)品健康食用和行業(yè)的快速穩(wěn)定發(fā)展具有重要意義。開展克氏原螯蝦動物過敏模型的研究是解決食物過敏抗體來源的重要步驟,也是相關研究的基礎。本文以克氏原螯蝦食物過敏動物模型研究為目的,通過生理性