mapck信號(hào)通路磷酸化在擴(kuò)張型心肌病患者心肌纖維化中的臨床意義

mapck信號(hào)通路磷酸化在擴(kuò)張型心肌病患者心肌纖維化中的臨床意義

擴(kuò)張性心肌病（tcm）是指在心臟無異常壓力負(fù)荷或冠狀動(dòng)脈（冠狀動(dòng)脈）疾病等心臟疾病的情況下，左心室或雙室增大，導(dǎo)致心臟擴(kuò)張和收縮障礙。這是臨床上進(jìn)展性心力衰竭和起源性猝死的主要原因。1數(shù)據(jù)和方法1.1供體心臟疾病收集DCM患者接受心臟移植者受體心臟6例（DCM組），并選擇移植失敗的供體心臟6例作為對(duì)照組。DCM的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2006年美國(guó)AHA制定的DCM診斷標(biāo)準(zhǔn)，即左心室舒張末期內(nèi)徑>55mm、左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF)<45%或左心室縮短速率<25%1.2學(xué)習(xí)方法1.2.1左心室肌組織病理學(xué)檢測(cè)收集DCM患者受體心臟及移植失敗的供體心臟的左心室肌組織。切取離體心臟的左心室肌組織，生理鹽水沖洗后，分為兩份。一份立即放入凍存管于液氮中迅速冷凍后-80℃冰箱中保存，用于WesternBlot檢測(cè)；另一份置于4%多聚甲醛中固定，制作病理石蠟切片，后續(xù)染色觀察。1.2.2westernblot分析Westernblot法測(cè)定兩組心室肌組織中MAPKs信號(hào)通路分子MEK1/2、ERK1/2、JNK1/2、P38的總水平和磷酸化水平、以及下游分子EGR-1的蛋白表達(dá)水平。心室肌組織研磨后加入新鮮配制的蛋白裂解液提取總蛋白，BCA試劑盒測(cè)定各樣品的蛋白濃度，將各樣品蛋白濃度調(diào)整一致，與上樣緩沖液混合，加熱煮沸10min，使蛋白充分變性，并分裝保存在-80℃。蛋白溶解后，行SDS凝膠電泳，再4℃下轉(zhuǎn)膜，PVDF膜在5%脫脂奶粉中封閉2h，分別加入抗MEK1/2、ERK1/2、JNK1/2、P38、p-MEK1/2、p-ERK1/2、p-JNK1/2、p-P38、EGR-1、GAPDH一抗，4℃孵育過夜。次日，二抗孵育2h，顯影。以GAPDH為內(nèi)參，測(cè)定目標(biāo)條帶及GAPDH的灰度值，兩者灰度值比值為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。1.2.3石蠟切片染色4%多聚甲醛固定后的心室肌組織，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片等步驟制成石蠟切片。石蠟切片依次經(jīng)二甲苯脫蠟、下行梯度酒精脫苯、水洗、蘇木素染色、0.1%鹽酸酒精分化、Scott液返藍(lán)、伊紅染色、上行梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹脂封片；最后，顯微鏡下觀察心肌組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)及排列特點(diǎn)。1.2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法制備好的石蠟切片常規(guī)脫蠟、脫水后，依次經(jīng)磷鉬酸染色、0.1%苦味酸天狼星紅染色、0.01N鹽酸分化、上行梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹脂封片；最后，光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織中紅色膠原纖維的分布情況，拍照并計(jì)算膠原容積百分比（CVF),CVF=膠原面積/圖像面積×100%。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理計(jì)量資料數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS19.0軟件，進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1超聲心動(dòng)圖檢查DCM患者和對(duì)照組年齡、性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。DCM患者超聲心動(dòng)圖檢查提示心室擴(kuò)大，左心室擴(kuò)張更為顯著（69.83±14.71mm），呈離心性擴(kuò)張；心肌室壁運(yùn)動(dòng)幅度普遍減低，左室射血分?jǐn)?shù)明顯下降（26.83±8.49%）。2.2心肌細(xì)胞排列和諧與對(duì)照組相比，HE染色見DCM組心肌組織內(nèi)心肌細(xì)胞不同程度肥大，胞漿內(nèi)少許空泡形成；心肌細(xì)胞排列紊亂，周圍間質(zhì)組織纖維化明顯（圖1A）。PSR染色可見DCM組心肌組織間質(zhì)內(nèi)大量增粗的、亮紅色膠原纖維沉積，呈彌漫性分布，CVF較對(duì)照組顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖1B和1C）。以上提示，DCM患者心肌纖維化、心室重構(gòu)明顯。2.3nk1/2、3gp8總蛋白表達(dá)水平WesternBlot結(jié)果顯示，兩組間MEK1/2、ERK1/2、JNK1/2、P38的總蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與對(duì)照組相比，DCM組心肌組織內(nèi)MEK1/2、ERK1/2、JNK1/2、P38的磷酸化水平均明顯增高（P<0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2）。2.4map保乳分子egr-1的蛋白表達(dá)水平WesternBlot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，DCM組心肌組織內(nèi)MAPKs信號(hào)通路下游分子EGR-1的蛋白表達(dá)水平明顯增高（P<0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3）。3mapps信號(hào)通路目前，DCM臨床治療大多基于血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑、β受體阻滯劑等藥物，通過減慢心率、減緩心室重構(gòu)等改善DCM患者的預(yù)后，心臟移植是終末期DCM患者最佳的治療手段MAPKs信號(hào)通路是真核細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞外信號(hào)到細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的重要成員，通過MAPKK激酶（MAPKKK/MEKK）、MAPK激酶（MAPKK/MEK）和MAPK的級(jí)聯(lián)模式傳導(dǎo)細(xì)胞外信號(hào)，依次磷酸化激活將上游信號(hào)傳遞至下游應(yīng)答分子，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、遷移、凋亡、炎癥和纖維化修復(fù)等生物學(xué)過程早期生長(zhǎng)反應(yīng)因子（EGR-1），最早被認(rèn)為是一種腫瘤抑制因子，在細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和存活中發(fā)揮作用，后發(fā)現(xiàn)其在免疫應(yīng)答的啟動(dòng)過程中也發(fā)揮重要作用，是生長(zhǎng)因子介導(dǎo)纖維化的核心轉(zhuǎn)錄因子綜上所述，MAPKs信號(hào)通路在促進(jìn)DCM患者心肌纖維化中發(fā)揮重要作用，不是通過單一信號(hào)途徑實(shí)現(xiàn)，而是多條信號(hào)通路協(xié)同促進(jìn)DCM患者心肌纖維化的進(jìn)展。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用MAPKs信號(hào)通路各級(jí)