發(fā)狀念珠藻細胞破碎方法的研究

發(fā)狀念珠藻細胞破碎方法的研究

藍藻是紅藻和綠藻中獨特的捕光性蛋白。這是一種重要的內源性碳硅蛋白。發(fā)狀念珠藻(Nostocflagelliforme)是一種生長于荒漠-半荒漠地區(qū)的陸生藍細菌1材料和方法1.1材料表面野生發(fā)狀念珠藻及液態(tài)培養(yǎng)發(fā)狀念珠藻細胞由天津市工業(yè)微生物重點實驗室保藏。1.2方法1.2.1細胞破碎方法的確定將野生發(fā)狀念珠藻洗凈晾干后研磨成粉,4℃保存?zhèn)溆?。將液態(tài)培養(yǎng)發(fā)狀念珠藻細胞培養(yǎng)液5000r/min離心15min,收集細胞冷凍干燥,研磨得到細胞粉,作為各種破碎方法的待測樣。1.2.2細胞破碎法液氮研磨法:稱取野生或液態(tài)培養(yǎng)發(fā)狀念珠細胞粉置于研缽中,加入液氮研磨。反復凍融法超聲波破碎法高壓均質法玻璃珠法1.2.3蛋白總量/初始細胞密度g/l破碎率測定方法蛋白釋放量(R)=上清液中可溶蛋白總量(g/L)/初始細胞密度(g/L)。細胞破碎率=R/R藻藍蛋白提取得率(D)藻藍蛋白純度用A可溶性總蛋白測定:Bradford法2結果與分析2.1細胞密度對破碎率的影響液氮研磨不易破壞研磨物組織成分,同時增加其脆性易于磨碎。液氮研磨時,由于復水后的發(fā)狀念珠藻樣品易結冰,不利于研磨破碎,故直接采用干粉。對于發(fā)狀念珠藻而言,破碎效果并不理想,破碎率均低于30%(表1)。隨著細胞密度的增大,發(fā)狀念珠藻細胞破碎率有所下降,相應的藻藍蛋白的提得取率也依次遞減。但是液態(tài)培養(yǎng)較野生的發(fā)狀念珠藻的藻藍蛋白的提取純度高出接近3倍(0.471/0.161)。2.2細胞破碎帶的推動容器中添加一定量的玻璃珠模擬磨珠機的工作原理是圓盤的高速旋轉可使細胞懸浮液和珠子相互攪動,從而通過剪切力層之間的碰撞和磨料的滾動而使細胞破裂2.3藻細胞破碎率低在室溫和-20℃條件下,對發(fā)狀念珠藻細胞進行反復凍融處理,表3結果表明野生發(fā)狀念珠藻細胞破碎率僅為11.1%?？赡苁且吧l(fā)狀念珠藻胞外有膠質鞘包裹,影響了細胞的破碎率,以及藻藍蛋白提取得率與純度。相對應液態(tài)培養(yǎng)發(fā)狀念珠藻細胞破碎為18.73%,多次凍融能增大細胞壁的通透性,能將胞內藻藍蛋白水溶出來,提高了藻藻藍蛋白的提取得率和純度。2.4分離培養(yǎng)發(fā)狀念珠藻破碎率如表4,采用超聲破碎發(fā)狀念珠藻細胞,野生發(fā)狀念珠藻細胞破碎率為21.11%,液態(tài)培養(yǎng)發(fā)狀念珠藻破碎率達到70.27%,后者明顯高于前者。野生發(fā)狀念珠藻細胞向細胞外分泌膠質物質,將藻絲體包裹,形成膠質鞘,對細胞起到保護作用2.5材料破碎方法對材料的細胞破碎率的影響高壓均質能使細胞在一系列過程中產生高速碰撞以及由高壓到常壓的變化從而造成細胞的破碎。野生發(fā)狀念珠藻呈發(fā)絲狀,不同于一般的藍細菌,在采用其他破碎方法時,只能將其從念珠狀藻絲打碎成球狀細胞,并不能將其細胞壁完全破碎。如表5,采用高壓均質能使細胞通過物理機械的作用均勻地擠壓破碎,釋放其內溶物,破碎率達到96.45%。液態(tài)培養(yǎng)發(fā)狀念珠藻破碎率則達到97.06%,均取得很好的破碎效果。同時野生和液態(tài)培養(yǎng)發(fā)狀念珠藻藻藍蛋白的提取得率明顯高于其他破碎方法,分別達到了1.43%和1.31%。但是,由于高壓均質破碎能使胞內物充分溶出,故提取得到的藻藍蛋白的純度并不是很高。3細胞破碎方法的選擇粗提掖中藻藍蛋白濃度的測定3.1采用五種細胞破碎方法破碎野生和液態(tài)培養(yǎng)發(fā)狀念珠藻細胞,兩者有明顯的區(qū)別。結果表明,液態(tài)培養(yǎng)發(fā)狀念珠藻細胞的破碎率均高于野生發(fā)狀念珠藻細胞。兩者的破碎效果最佳方法都為高壓均質破碎法。3.2采用高壓均質處理野生發(fā)狀念珠藻細胞,藻藍蛋白的提取得率明顯其他幾種方法,純度較高,是野生