應(yīng)用組織芯片技術(shù)研究結(jié)直腸癌中Lumican的表達(dá)及意義

應(yīng)用組織芯片技術(shù)研究結(jié)直腸癌中Lumican的表達(dá)及意義【摘要】［目的］探討Lumican的表達(dá)與結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。［方法］構(gòu)建100對(duì)結(jié)直腸癌及相應(yīng)癌旁正常黏膜上皮組織的組織芯片，應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)Lumican的表達(dá)強(qiáng)度。［結(jié)果］Lumican在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)率顯著高于癌旁正常黏膜中的表達(dá)率。Lumican在腺癌中的表達(dá)率高于在黏液腺癌及印戒細(xì)胞癌中的表達(dá)率()。Lumican的表達(dá)強(qiáng)度與結(jié)直腸癌浸潤(rùn)深度之間存在非常顯著的正相關(guān)及線性關(guān)系(χ2=，)，即隨著浸潤(rùn)程度加深，Lumican的表達(dá)強(qiáng)度逐漸增加。Lumican的表達(dá)強(qiáng)度與患者的年齡、性別、發(fā)病部位、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移及分化程度無(wú)關(guān)。［結(jié)論］Lumican的異常表達(dá)可能是結(jié)直腸癌發(fā)生的早期事件，與結(jié)直腸癌的組織分型和侵襲能力有關(guān)，在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

【關(guān)鍵詞】腸腫瘤

ApplicationofTissueChipAssaytoExpressionofLumicanforColorectalCanceranditsSignificance

Abstract:［Purpose］ToexploretherelationshipofLumicanexpressionwithcarcinogenesisandprogressionincolorectalcancer.［Methods］Onehundredcouplesoftissuechipsofcolorectalcancertissuesandadjacentnormalepitheliummucosatissueswereconstructed.ExpressionintensityofLumincanwasmeasuredbyimmunohistochemicalmethod.［Results］Lumicanexpressionratioincolorectalcancertissues(%)wassignificantlyhigherthanthat(%)inadjacentnormalepitheliummucosatissues().Lumicanexpressionratioinadenocarcinoma(%)washigherthanthatinmucinousadenocarcinomaandsignet-ringcellcarcinoma(%),().TherewasadistinctlypositivecorrelationbetweenintensityofLumicanexpressionandinvasivedepthincolorectalcancer(r=,),aswellaslinearcorrelation(χ2=，).Lumicanexpressionintensityincreasedasinvasivedepthincreasedincolorectalcancer.Lumicanexpressionintensitydidn’trelatetoage,sex,tumorlocation,lymphnodemetastasisandcelldifferentiation().［Conclusion］Mal-expressionofLumicancorrelatestohistopathologictypeandinvasivecapabilityincolorectalcancer.Itmaybetheearlyeventofcolorectalcarcinogenesis.

Keywords:colorectalneoplasms;Lumican;tissuechip

蛋白聚糖作為細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成部分能夠調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲，在原發(fā)灶的生長(zhǎng)或轉(zhuǎn)移灶的形成期間，細(xì)胞外基質(zhì)會(huì)通過(guò)生物合成和降解形成特征性的重塑[1~3]。小的富含亮氨酸蛋白聚糖不僅可以調(diào)節(jié)細(xì)胞外水平衡、影響組織生物力學(xué)，同時(shí)在細(xì)胞遷移、增殖、腫瘤生長(zhǎng)、黏附和移行，以及調(diào)節(jié)生長(zhǎng)因子的活性等方面也發(fā)揮著重要作用[4~6]。Lumican作為SLRP家族成員之一，是近幾年發(fā)現(xiàn)的與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的基因。本研究應(yīng)用組織芯片技術(shù)及免疫組化方法檢測(cè)分析，旨在探討Lumican在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及其與組織學(xué)及臨床病理學(xué)之間的關(guān)系。

1材料與方法

臨床病理資料

收集2003年6~12月哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腹外科結(jié)直腸癌手術(shù)切除標(biāo)本(結(jié)直腸癌組織和癌旁正常黏膜上皮組織)100對(duì)。病理分型：中分化腺癌62例，低分化腺癌21例，黏液腺癌及印戒細(xì)胞癌17例。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性36例，陰性64例。因芯片脫落及殘缺無(wú)法分析的點(diǎn)共6對(duì)。

構(gòu)建組織芯片及免疫組化染色方法

主要試劑

SP-9003免疫組化試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。黏片劑APES和DAB顯色試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。羊抗人Lumican多克隆抗體購(gòu)自R＆DSystems公司。

組織芯片構(gòu)建

采用組織芯片制作儀，每例分別穿取結(jié)直腸原發(fā)灶癌組織和遠(yuǎn)癌正常結(jié)直腸黏膜組織，制作結(jié)直腸癌及其癌前病變的組織微陣列蠟塊，行4μm連續(xù)切片，40℃裱片，56℃烤片3h后移至37℃恒溫箱中過(guò)夜，常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

免疫組化

免疫組化染色采用鏈霉菌抗生物素蛋白—過(guò)氧化物酶法。脫蠟水化，采用微波煮沸修復(fù)抗原,山羊血清封閉，Lumican一抗工作濃度為1∶50，一抗4℃孵育過(guò)夜，PBS洗3次，二抗室溫孵育20min，滴加辣根過(guò)氧化物酶，室溫作用20min，PBS洗3次后DAB顯色5～10min，PBS沖洗,蘇木精復(fù)染2min，鹽酸酒精分化，常規(guī)脫水、透明、中性樹(shù)膠封片。采用PBS代替一抗做空白對(duì)照。

免疫組化染色結(jié)果判定

每張切片在高倍鏡(×400)下觀察5個(gè)不同視野內(nèi)細(xì)胞蛋白染色情況。Lumican蛋白陽(yáng)性反應(yīng)顆粒定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞漿內(nèi)。Lumican陽(yáng)性結(jié)果判定：凡在細(xì)胞漿內(nèi)及胞膜上著色呈淺黃或棕黃色顆粒，51%～75%染色棕黃為，26%～50%染色黃色為，10%~25%染色淺黃為；細(xì)胞漿或胞膜無(wú)著色為陰性。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用的統(tǒng)計(jì)方法包括Wilcoxon秩和檢驗(yàn)、r檢驗(yàn)及χ2檢驗(yàn)。為差異有顯著性。

2結(jié)果

組織芯片免疫組化的有效性

5個(gè)陣列蠟塊切片經(jīng)HE染色及免疫組化觀察，結(jié)直腸癌及其癌旁正常黏膜組織芯片蠟塊組織陣列排列整齊，組織形態(tài)良好。殘缺點(diǎn)數(shù)共8個(gè)，可供分析的成對(duì)點(diǎn)共94對(duì)，免疫組化有效信息量94％。

Lumican在組織芯片中的表達(dá)

在94對(duì)結(jié)直腸癌及癌旁正常黏膜組織芯片中，79例癌細(xì)胞中有Lumican蛋白不同程度的表達(dá)，而癌旁正常黏膜上皮組織中僅40例有Lumican蛋白的弱表達(dá)，Lumican在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)顯著高于在癌旁正常黏膜組織中的表達(dá)()。

結(jié)直腸癌中Lumican表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

Lumican的表達(dá)強(qiáng)度與浸潤(rùn)深度之間存在著顯著正相關(guān)(r=，P=)及線性關(guān)系(χ2=，P=)，即由肌層到漿膜外，Lumican的表達(dá)增強(qiáng)。Lumican的表達(dá)強(qiáng)度在不同的組織分型中存在差異，即在腺癌中Lumican的表達(dá)強(qiáng)度高于在黏液腺癌及印戒細(xì)胞癌中的表達(dá)。

3討論

Lumican基因定位于12號(hào)染色體的~q22區(qū)。Lumican蛋白由338個(gè)氨基酸組成，包含一個(gè)由18個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的信號(hào)肽，Lumican核心蛋白包含一個(gè)亮氨酸高度重復(fù)的中央?yún)^(qū)，其兩側(cè)為二硫腱區(qū)域，其分子中心區(qū)具有4個(gè)天冬酰胺殘基，能夠進(jìn)行N-糖基化鏈鎖[7~9]。Lumican不但有SLRP家族的共同功能結(jié)構(gòu)，還有自己獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用。

在癌細(xì)胞的增殖過(guò)程中，大多類(lèi)型的癌細(xì)胞都顯示出癌巢周?chē)胁煌潭鹊睦w維化，這些纖維組織主要包括膠原纖維和成纖維細(xì)胞，它可以影響癌細(xì)胞增殖、遷移和擴(kuò)散[10，11]。在胰腺癌的間質(zhì)組織中Lumican高表達(dá)與病人的存活期有關(guān)，Lumican的高表達(dá)可以促進(jìn)胰腺癌的生長(zhǎng)和侵襲[12]。在乳腺癌組織中，LumicanmRNA在癌細(xì)胞周?chē)某衫w維細(xì)胞中而非在癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)。Lumican高表達(dá)與腫瘤病理分級(jí)高、癌組織中雌激素受體水平低和病人的低年齡相關(guān)。乳腺癌中Lumican低表達(dá)與腫瘤快速進(jìn)展和存活期短相關(guān)[13~15]。

YuePingLu等[16]通過(guò)免疫組化和原位雜交方法研究了12例人結(jié)直腸癌組織，其中8例癌細(xì)胞中有LumicanmRNA和蛋白強(qiáng)烈表達(dá)，在毗鄰癌細(xì)胞的成纖維細(xì)胞中有較弱的表達(dá)，而在癌旁正常的結(jié)腸上皮細(xì)胞中則沒(méi)有表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)將100對(duì)標(biāo)本制作在5張芯片上進(jìn)行同步檢測(cè)，避免了多次實(shí)驗(yàn)帶來(lái)的系統(tǒng)誤差。本實(shí)驗(yàn)對(duì)可供分析的94對(duì)結(jié)直腸癌及癌旁正常黏膜組織芯片研究顯示，其中79例癌細(xì)胞中有Lumican不同程度的表達(dá)，在毗鄰癌細(xì)胞的成纖維細(xì)胞中有較弱的表達(dá)，而癌旁正常黏膜上皮組織中僅40例有Lumican的表達(dá)且表達(dá)弱。部分癌旁正常黏膜上皮組織中有Lumican的弱表達(dá)，與YuePingLu等[16]的研究結(jié)果不完全一致，可能與以下因素有關(guān)：①本實(shí)驗(yàn)在免疫組化過(guò)程中使用了抗原修復(fù)的方法；②實(shí)驗(yàn)所用抗體靈敏性；③是否進(jìn)行了大樣本研究。本研究發(fā)現(xiàn)Lumican在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)強(qiáng)度顯著高于癌旁正常黏膜，提示Lumican在結(jié)直腸癌組織中的高表達(dá)可能在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。

SeyaT等[17]通過(guò)免疫組化方法對(duì)158例經(jīng)外科手術(shù)治療的伴早期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌研究發(fā)現(xiàn)，Lumican高表達(dá)者生存率顯著降低，Lumican的高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的范圍和癌腫浸潤(rùn)深度相關(guān)，與年齡、性別、發(fā)病部位、組織分型及是否侵及淋巴管及靜脈無(wú)關(guān)。而本實(shí)驗(yàn)研究顯示，結(jié)直腸癌組織中Lumican的表達(dá)強(qiáng)度與年齡、性別、發(fā)病部位、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分化程度無(wú)關(guān)，與癌腫浸潤(rùn)深度存在非常顯著的正相關(guān)(P=)及線性關(guān)系(P=)，即由肌層到漿膜外，Lumican的表達(dá)強(qiáng)度逐漸增加。這可能與結(jié)直腸癌來(lái)源的Lumican蛋白擁有

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