檢驗技術(shù)化學(xué)發(fā)光和熒光免疫技術(shù)和儀器

檢驗技術(shù)化學(xué)發(fā)光和熒光免疫技術(shù)和儀器檢驗技術(shù)化學(xué)發(fā)光和熒光免疫技術(shù)和儀器第1頁2第一節(jié)化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)第二節(jié)電化學(xué)發(fā)光免疫分析第三節(jié)時間分辨熒光免疫分析法第四節(jié)熒光偏振免疫分析法第五節(jié)化學(xué)發(fā)光免疫分析臨床應(yīng)用內(nèi)容概述:檢驗技術(shù)化學(xué)發(fā)光和熒光免疫技術(shù)和儀器第2頁3教學(xué)目標(biāo)和要求

掌握化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)基礎(chǔ)原理、反應(yīng)底物和標(biāo)識方法以及反應(yīng)類型。

熟悉電化學(xué)發(fā)光免疫分析基礎(chǔ)原理和標(biāo)識物，時間分辨熒光免疫分析法基礎(chǔ)原理及其標(biāo)識物和螯合物。

了解熒光偏振免疫分析法基礎(chǔ)原理和技術(shù)特點，化學(xué)發(fā)光免疫分析臨床應(yīng)用

檢驗技術(shù)化學(xué)發(fā)光和熒光免疫技術(shù)和儀器第3頁4第一節(jié)化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)基礎(chǔ)原理反應(yīng)底物標(biāo)識方法反應(yīng)類型相關(guān)儀器檢驗技術(shù)化學(xué)發(fā)光和熒光免疫技術(shù)和儀器第4頁5一、基礎(chǔ)原理化學(xué)發(fā)光，是指伴隨化學(xué)反應(yīng)過程所產(chǎn)生發(fā)光發(fā)射現(xiàn)象。一些物質(zhì)在進行化學(xué)反應(yīng)時，吸收了反應(yīng)過程中所產(chǎn)生化學(xué)能，使反應(yīng)物分子形成電子激發(fā)態(tài)，當(dāng)電子從激發(fā)態(tài)返回到穩(wěn)定基態(tài)時，多出能量就以光子形式發(fā)射出來。這一現(xiàn)象稱為化學(xué)發(fā)光。A+BC*+D,C*C+h

檢驗技術(shù)化學(xué)發(fā)光和熒光免疫技術(shù)和儀器第5頁6(一)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng)條件和過程化學(xué)發(fā)光與熒光區(qū)分:化學(xué)能光能化學(xué)發(fā)光反應(yīng)條件:反應(yīng)必須提供足夠激發(fā)能焓變(△H)介于170～300kj·mol-1之間，才能在可見光范圍觀察到化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象吸收了化學(xué)能后處于激發(fā)態(tài)分子或原子，必須以光子形式將能量釋放出來，或者將能量轉(zhuǎn)移到另一個物質(zhì)分子上并使該分子激發(fā)，當(dāng)被激發(fā)分子回到基態(tài)時，也以光子形式釋放能量檢驗技術(shù)化學(xué)發(fā)光和熒光免疫技術(shù)和儀器第6頁7(二)化學(xué)發(fā)光效率化學(xué)發(fā)光反應(yīng)發(fā)光效率(φCl)又稱為化學(xué)發(fā)光總能量產(chǎn)生率φCl取決于生成激發(fā)態(tài)產(chǎn)物分子化學(xué)激發(fā)效率(φCE)和激發(fā)態(tài)產(chǎn)物分子發(fā)射效率(φEM)。普通化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，φCl值約為10-6

檢驗技術(shù)化學(xué)發(fā)光和熒光免疫技術(shù)和儀器第7頁8(三)強度與反應(yīng)物質(zhì)濃度之間關(guān)系反應(yīng)物濃度反應(yīng)速度化學(xué)發(fā)光反應(yīng)所發(fā)出光強度檢驗技術(shù)化學(xué)發(fā)光和熒光免疫技術(shù)和儀器第8頁9(四)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)類型直接化學(xué)發(fā)光間接化學(xué)發(fā)光1．直接化學(xué)發(fā)光化學(xué)反應(yīng)釋放化學(xué)能激發(fā)是反應(yīng)產(chǎn)物分子A+BC*+D,C*C+h

檢驗技術(shù)化學(xué)發(fā)光和熒光免疫技術(shù)和儀器第9頁102．間接化學(xué)發(fā)光(敏化化學(xué)發(fā)光)在化學(xué)反應(yīng)中，激發(fā)能傳遞到另一個未參加化學(xué)反應(yīng)分子上，使該分子到達(dá)電子激發(fā)態(tài)，再由激發(fā)態(tài)分子返回到基態(tài)時發(fā)光；或反應(yīng)首先生成一個高能量中間體，此中間體再將能量轉(zhuǎn)移給另一個未參加化學(xué)反應(yīng)分子，使該分子到達(dá)電子激發(fā)態(tài)，再由激發(fā)態(tài)分子躍遷回到基態(tài)時發(fā)光過程。A+BC*+D,C*+FF*+E,F*F+h

檢驗技術(shù)化學(xué)發(fā)光和熒光免疫技術(shù)和儀器第10頁11二、反應(yīng)底物(發(fā)光劑或發(fā)光底物)在化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中，參加能量轉(zhuǎn)移并最終以發(fā)射光子形式釋放能量化合物發(fā)光免疫技術(shù)中常見化學(xué)發(fā)光底物:１．氨基苯二酰肼類主要有魯米諾(3-氨基苯二甲酰肼，luminol)和異魯米諾(5-氨基苯二甲酰肼，isolumino1)及其衍生物。2．瞇唑類化合物較常見是2，4，6-三苯基咪唑，即洛粉堿(lophine)。3．吖啶酯類經(jīng)典代表是N，N-二甲基二吖啶硝酸酯，即光澤精(1ucigenin)。4．苯酚類化合物其中主要有鄰苯三酚，即焦性沒食子酸。5．芳香草酸酯類主要有雙-(2，4，6，-三氯苯基)-草酸酯(TCPO)和雙-(2，4-二硝基苯基)-草酸酯(DNPO)。6．(金剛烷)-1，2-二氧乙烷及其衍生物

檢驗技術(shù)化學(xué)發(fā)光和熒光免疫技術(shù)和儀器第11頁12檢驗技術(shù)化學(xué)發(fā)光和熒光免疫技術(shù)和儀器第12頁13三、標(biāo)識方法化學(xué)標(biāo)識生物標(biāo)識化學(xué)標(biāo)識:用于化學(xué)發(fā)光(酶)免疫測定直接用發(fā)光物質(zhì)(如魯米諾、吖啶酯類等)標(biāo)識抗體或抗原以催化劑(如HRP、GOD等)和／或協(xié)同因子(如ATP、NAD等)標(biāo)識抗體或抗原按照標(biāo)識物應(yīng)用:檢驗技術(shù)化學(xué)發(fā)光和熒光免疫技術(shù)和儀器第13頁14按照被標(biāo)識物結(jié)構(gòu)或性質(zhì):對小分子物質(zhì)(如甾體激素、藥品等)標(biāo)識對大分子抗原、抗體標(biāo)識(如蛋白質(zhì)、核酸等)以及對一些配基和載體標(biāo)識檢驗技術(shù)化學(xué)發(fā)光和熒光免疫技術(shù)和儀器第14頁15按照標(biāo)識反應(yīng)過程和形成結(jié)合物結(jié)構(gòu)特點:直接偶聯(lián)間接偶聯(lián)經(jīng)過偶聯(lián)反應(yīng)，使標(biāo)識物分子中反應(yīng)基團直接連接在被標(biāo)識分子反應(yīng)基團上。在標(biāo)識物與被標(biāo)識物之間插入一條鏈或一個基團，使兩種物質(zhì)經(jīng)過這種引入“橋”連結(jié)成結(jié)合物碳二亞胺縮正當(dāng)、過碘酸鹽氧化法、重氮鹽偶聯(lián)法和混合酸酐法琥珀酰亞胺活化法、O-(羧甲基)羥胺法、異硫氰酸酯衍生物和戊二醛法檢驗技術(shù)化學(xué)發(fā)光和熒光免疫技術(shù)和儀器第15頁16檢驗技術(shù)化學(xué)發(fā)光和熒光免疫技術(shù)和儀器第16頁17常見標(biāo)識方法1．碳二亞胺（EDC）縮正當(dāng)此法可用于蛋白質(zhì)分子中游離羧基或游離氨基標(biāo)識。常見縮合劑有l(wèi)-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亞胺(EDC)和二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)直接偶聯(lián)檢驗技術(shù)化學(xué)發(fā)光和熒光免疫技術(shù)和儀器第17頁18

2．重氮鹽偶聯(lián)法(又稱重氮化法)此法簡易、成本低、重復(fù)性好，但不適合用于脂肪伯胺基發(fā)光劑，因其生成重氮鹽不穩(wěn)定，即使在０℃也會生成氮氣。另外，ABEI等伯胺基位于側(cè)鏈者也不適用此法。芳香伯胺直接偶聯(lián)檢驗技術(shù)化學(xué)發(fā)光和熒光免疫技術(shù)和儀器第18頁193．過碘酸鹽氧化法標(biāo)識物可用發(fā)光劑或催化劑，適合用于芳香伯胺或脂肪伯胺發(fā)光劑，標(biāo)識方法穩(wěn)定標(biāo)識物不易脫落，但此法不適合用于無糖基蛋白質(zhì)和含有糖基但氧化后會影響免疫學(xué)活性蛋白質(zhì)。直接偶聯(lián)檢驗技術(shù)化學(xué)發(fā)光和熒光免疫技術(shù)和儀器第19頁204．戊二醛法

間接偶聯(lián)芳香伯胺基氨基因為戊二醛在溶液中以單體和聚合體形式存在，后者占多數(shù)，所以在標(biāo)識反應(yīng)中雙方分子間組成較大距離，降低了在抗原抗體反應(yīng)時空間位阻；但因偶聯(lián)不易定量控制且缺乏特異性等而未得到廣泛應(yīng)用雙功效偶聯(lián)劑檢驗技術(shù)化學(xué)發(fā)光和熒光免疫技術(shù)和儀器第20頁215．琥珀酸酐法(環(huán)內(nèi)酸酐法)間接偶聯(lián)此法沒有雙功效交聯(lián)劑不良反應(yīng)，能實現(xiàn)標(biāo)識物和蛋白質(zhì)分子間單向定量縮合，標(biāo)識效率高，已經(jīng)有商品化試劑供給。檢驗技術(shù)化學(xué)發(fā)光和熒光免疫技術(shù)和儀器第21頁226．異硫氰酸酯衍生物法此法標(biāo)識溫和、穩(wěn)定，取得標(biāo)識物不易脫落，且不損失蛋白質(zhì)等生物活性發(fā)光標(biāo)識物標(biāo)識物間接偶聯(lián)檢驗技術(shù)化學(xué)發(fā)光和熒光免疫技術(shù)和儀器第22頁237．O-(羧甲基)羥胺法O--羧甲基衍生物8．混合酸酐法檢驗技術(shù)化學(xué)發(fā)光和熒光免疫技術(shù)和儀器第23頁24四、反應(yīng)類型化學(xué)發(fā)光免疫分析化學(xué)發(fā)光酶免疫分析微粒子化學(xué)發(fā)光免疫分析依據(jù)發(fā)光免疫分析中發(fā)光反應(yīng)不一樣體系和標(biāo)識方法不一樣檢驗技術(shù)化學(xué)發(fā)光和熒光免疫技術(shù)和儀器第24頁251.化學(xué)發(fā)光免疫分析(chemiluminescenceimmunoassay，CLIA)用化學(xué)發(fā)光劑直接標(biāo)識抗原或抗體,免疫反應(yīng)后生成標(biāo)識免疫復(fù)合物,經(jīng)過開啟發(fā)光試劑(NaOH-H2O2)作用于AE而發(fā)光，發(fā)光強度依賴于免疫反應(yīng)物中化學(xué)發(fā)光劑濃度。原理:常見化學(xué)發(fā)光劑:吖啶酯(acridiniumester，AE)類化合物反應(yīng)特點:CLIA檢測小分子抗原采取競爭法；大分子抗標(biāo)準(zhǔn)采取夾心法。與大分子結(jié)合不會減小所產(chǎn)生光量，從而增加靈敏度。強烈直接發(fā)光在1s內(nèi)完成，為快速閃爍發(fā)光。應(yīng)用:檢驗技術(shù)化學(xué)發(fā)光和熒光免疫技術(shù)和儀器第25頁261)直接化學(xué)發(fā)光使用吖啶酯(AE)作為標(biāo)識物，無需附加催化劑。AE氧化直接發(fā)光，氧化反應(yīng)在430nm處快速發(fā)光并在1s內(nèi)到達(dá)峰值。發(fā)光強度是I125在1min內(nèi)發(fā)光強度十萬倍，所以系統(tǒng)該含有高速度、產(chǎn)光強等特點。

2)AE有甲基，增加了試劑穩(wěn)定性，使試劑穩(wěn)定性好，使用期更長。

3)AE作為化學(xué)發(fā)光標(biāo)識物，對溫度及pH等外界環(huán)境改變不敏感，故其含有很高精密度。

4)AE相對分子質(zhì)量水常小(MW：481)，使其對結(jié)合反應(yīng)空間位阻作用降低，增加擴散率，提升了靈敏度，可達(dá)l0-15mol·L-1。

5)AE是以共價鍵結(jié)合抗體而不影響抗體結(jié)合抗原反應(yīng)，故不影響發(fā)光。

6)AE加堿后，發(fā)光是在一暗盒中進行，其光量值與濃度有著良好線性關(guān)系，且本底較低。吖啶酯特點檢驗技術(shù)化學(xué)發(fā)光和熒光免疫技術(shù)和儀器第26頁272．化學(xué)發(fā)光酶免疫分析(chemiluminescentenzymeimmnunoassay，CLEIA)采取參加發(fā)光效應(yīng)酶作為標(biāo)識物標(biāo)識抗體或抗原，免疫反應(yīng)后形成酶標(biāo)識抗原抗體復(fù)合物，利用魯米諾作為發(fā)光底物在酶和開啟發(fā)光試劑(NaOH-H2O2)催化下，產(chǎn)生發(fā)光反應(yīng)，發(fā)光強度依賴于酶免疫反應(yīng)物中酶濃度。原理:

底物產(chǎn)物發(fā)光Ag+Ab*Ag-Ab**檢驗技術(shù)化學(xué)發(fā)光和熒光免疫技術(shù)和儀器第27頁28常見標(biāo)識物:辣根過氧化物酶(HRP)或ALP反應(yīng)特點:①標(biāo)識物常標(biāo)識抗體；②標(biāo)識物作為發(fā)光反應(yīng)催化劑，本身不發(fā)光。檢驗技術(shù)化學(xué)發(fā)光和熒光免疫技術(shù)和儀器第28頁293．微粒子化學(xué)發(fā)光免疫分析(microparticlechemiluminescenceimmunoassay，MLIA)以順磁性微粒作為載體包被抗體，利用磁性微粒能被磁場吸引，在磁力作用下發(fā)生力學(xué)移動特征，快速捕捉到被測抗原。加入堿性磷酸酶標(biāo)識第二抗體，形成磁性微粒包被抗體-抗原-酶標(biāo)識抗體復(fù)合物經(jīng)洗滌去掉未結(jié)合抗體后，加入ALP發(fā)光底物AMPDD，AMPDD被復(fù)合物上ALP催化發(fā)光,發(fā)射光所釋放光子能量被光量子閱讀系統(tǒng)統(tǒng)計，經(jīng)過計算機處理系統(tǒng)將光能量強度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上轉(zhuǎn)換為待測抗原濃度。原理:檢驗技術(shù)化學(xué)發(fā)光和熒光免疫技術(shù)和儀器第29頁30

AMPDD一側(cè)芳香基團上磷酸酯被水解，失去一個磷酸基而生成一個中等穩(wěn)定中間體AMPPD(半衰期2～30min)，此中間體經(jīng)過內(nèi)部電子轉(zhuǎn)移而裂解為一分子金剛烷酮和一分子激發(fā)態(tài)間氧苯甲酸甲酯陰離子，當(dāng)回到基態(tài)時發(fā)出波長為470nm光)檢驗技術(shù)化學(xué)發(fā)光和熒光免疫技術(shù)和儀器第30頁31常見標(biāo)識物:ALP反應(yīng)特點:①可采取競爭法和夾心法,多采取雙抗體夾心法②采取磁性微粒作為固相載體，以堿性磷酸酶作為標(biāo)識物，固相載體應(yīng)用擴充了測定范圍,檢測水平可茯Pg·mL-1，重復(fù)性好。

檢驗技術(shù)化學(xué)發(fā)光和熒光免疫技術(shù)和儀器第31頁32五、相關(guān)儀器介紹ADVIACENTAUR全自動免疫分析儀檢驗技術(shù)化學(xué)發(fā)光和熒光免疫技術(shù)和儀器第32頁33(一)ADVIACENTAUR檢測原理利用化學(xué)發(fā)光和磁性微粒子分離技術(shù)相結(jié)合測定方法，用高敏感性吖啶酯作為化學(xué)發(fā)光標(biāo)識物，以極細(xì)磁性顆粒(PMP)作為固相載體，提供最大包被面積。1．液相吖啶酯(AE)。2．固相氧化鐵(Fe2O3)。包被面積大,降低了擴散時間,增加了捕捉效率檢驗技術(shù)化學(xué)發(fā)光和熒光免疫技術(shù)和儀器第33頁34

(二)ADVIACENTAUR反應(yīng)類型

1．雙抗體夾心法檢驗技術(shù)化學(xué)發(fā)光和熒光免疫技術(shù)和儀器第34頁352．競爭法包含AE標(biāo)識抗原法和AE標(biāo)識抗體法。檢驗技術(shù)化學(xué)發(fā)光和熒光免疫技術(shù)和儀器第35頁363．捕捉法

常見來檢測樣本中特異性抗體，又稱為抗體捕捉法。試劑中使用了一個抗人免疫球蛋白抗體。抗體捕捉法通常使用兩次溫育和洗滌，第一次溫育和洗滌是為了除去樣品中過多干擾物質(zhì)；第二次溫育和洗滌是為了檢測樣品中抗體。檢驗技術(shù)化學(xué)發(fā)光和熒光免疫技術(shù)和儀器第36頁37第二節(jié)電化學(xué)發(fā)光免疫分析電化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence，ECL)是對電極施加一定電壓進行電化學(xué)反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物之間或體系中某種組分發(fā)生化學(xué)發(fā)光，用普通化學(xué)伎倆測量發(fā)光光譜及強度從而對物質(zhì)進行痕量分析一個方法。電化學(xué)發(fā)光免疫分析(electrochemiluminescenceimmunoassay，ECLIA)是將ECL和免疫反應(yīng)(抗原抗體反應(yīng))融為一體標(biāo)識免疫分析技術(shù),是一個在電極表面由電化學(xué)引發(fā)特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng).檢驗技術(shù)化學(xué)發(fā)光和熒光免疫技術(shù)和儀器第37頁38一、基礎(chǔ)原理檢驗技術(shù)化學(xué)發(fā)光和熒光免疫技術(shù)和儀器第38頁39技術(shù)特點1．ECLIA為非核素方法，可防止核素放射性污染2．為均相免疫測定技術(shù)，檢測中不需要分離結(jié)合相和游離相，操作簡便3．磁性微珠包被技術(shù)應(yīng)用使檢測靈敏度更高、線性范圍更寬、反應(yīng)時間更短。4．標(biāo)識物Ru

穩(wěn)定性好，室溫下半衰期大于1年，所標(biāo)識蛋白活性在2～4℃也可保持1年：以上。5．標(biāo)識物可進行化學(xué)修飾，以形成易于和蛋自、半抗原及核酸等分子結(jié)合活性NHS酯或磷酰胺基團，可用于各種分析物檢測。6．標(biāo)識物相對分子質(zhì)量小，在一個抗體分子上可同時標(biāo)識許多標(biāo)識物分子而不影響抗體免疫學(xué)活性，也可用于核酸標(biāo)識而不影響探針雜交活性。7．標(biāo)識物再循環(huán)利用使發(fā)光反應(yīng)時間更長、發(fā)光強度更高，更易于測定。8．儀器沒計使操作較為簡便，更易于實現(xiàn)自動化。檢驗技術(shù)化學(xué)發(fā)光和熒光免疫技術(shù)和儀器第39頁40二、標(biāo)識物釕衍生物，分子結(jié)構(gòu)簡單、穩(wěn)定、相對分子質(zhì)量小、水溶性強、空間位阻小等特點，可與待測物質(zhì)進行全量反應(yīng)．使得ECLIA測定含有高效性與穩(wěn)定性且沒有噪聲干擾。三聯(lián)吡啶釕檢驗技術(shù)化學(xué)發(fā)光和熒光免疫技術(shù)和儀器第40頁41第三節(jié)時間分辨熒光免疫分析法一、基礎(chǔ)原理抗原抗體反應(yīng)熒光物質(zhì)標(biāo)識

時間分辨技術(shù)++原理：檢驗技術(shù)化學(xué)發(fā)光和熒光免疫技術(shù)和儀器第41頁42用三價稀土離子及其螯合劑作為示蹤物(代替熒光物質(zhì)、放射核素或酶)，經(jīng)過雙功效基團螯合劑與蛋白質(zhì)、多肽、激素、抗體、核酸探針或生物活性細(xì)胞以共軛雙鍵結(jié)合進行標(biāo)識，待反應(yīng)體系(如抗原抗體免疫反應(yīng)、生物素親和素反應(yīng)、核酸探針雜交反應(yīng)、靶細(xì)胞與效應(yīng)細(xì)胞殺傷反應(yīng)等)發(fā)生后，三價稀土離子螫合物能夠在紫外光激發(fā)下，發(fā)出強度高(波長為613nm左右)、連續(xù)時間長(10～l000μs)熒光，利用延緩測量時間，待樣品中蛋白質(zhì)等背景熒光完全淬滅后，再測量三價稀土離子螯合物特異熒光，依據(jù)熒光強度和相對熒光強度比值，判斷反應(yīng)體系中分析物濃度，到達(dá)定量分析目標(biāo)檢驗技術(shù)化學(xué)發(fā)光和熒光免疫技術(shù)和儀器第42頁43時間分辨技術(shù)消除背景熒光:

在檢測樣品中，含有各種蛋白質(zhì)和其它化合物，這些物質(zhì)在較大波長范圍內(nèi)都可產(chǎn)生自發(fā)熒光,壽命短.

鑭系離子熒光壽命很長（10us～1.0ms），比背景熒光長3～4個數(shù)量級。所以應(yīng)用熒光時間分辨技術(shù)在背景熒光已經(jīng)降到很低時再開始檢測稀土鰲合物熒光，從而消除了非特異性熒光干擾。解離-增強原理:

較大Stocks位移（即激發(fā)光波長與發(fā)射光波長之差）和較窄發(fā)射峰等都增大了檢測信噪比;特點：檢驗技術(shù)化學(xué)發(fā)光和熒光免疫技術(shù)和儀器第43頁44二、標(biāo)識物和螯合劑1．TRF