植物細胞培養(yǎng)專家講座

第四章植物組織與細胞培養(yǎng)4.1植物組織培養(yǎng)與細胞培養(yǎng)區(qū)分4.2發(fā)展歷史4.3植物組織與器官培養(yǎng)4.4植物細胞培養(yǎng)4.5植物原生質(zhì)培養(yǎng)植物細胞培養(yǎng)專家講座第1頁4.1植物組織培養(yǎng)與細胞培養(yǎng)區(qū)分植物組織培養(yǎng)：指取出機體內(nèi)組織與細胞，模擬機體內(nèi)生理條件，使之在體外生長成組織或完整植株。植物細胞培養(yǎng)：植物細胞在體外條件下存活或生長，不再形成組織，以生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物為目標(biāo)。意義：能夠有效地保持優(yōu)良品種特征；生產(chǎn)無病毒種苗，快速繁殖新品種；生成藥品成份如紫杉醇等植物細胞培養(yǎng)專家講座第2頁4.1植物組織培養(yǎng)與細胞培養(yǎng)區(qū)分4.2發(fā)展歷史4.3植物組織與器官培養(yǎng)4.4植物細胞培養(yǎng)4.5植物原生質(zhì)培養(yǎng)植物細胞培養(yǎng)專家講座第3頁4.2發(fā)展歷史和研究意義：4.2.1發(fā)展歷史：自學(xué)4.2.2研究意義：含有主要經(jīng)濟意義植物細胞培養(yǎng)專家講座第4頁4.1植物組織培養(yǎng)與細胞培養(yǎng)區(qū)分4.2發(fā)展歷史4.3植物組織與器官培養(yǎng)4.4植物細胞培養(yǎng)4.5植物原生質(zhì)培養(yǎng)植物細胞培養(yǎng)專家講座第5頁4.3植物組織與器官培養(yǎng)4.3.1植物組織培養(yǎng)定義：在無菌條件下，將離體植物器官，組織，細胞，胚胎，原生質(zhì)體等在人工培養(yǎng)條件下，誘發(fā)產(chǎn)生愈傷組織，潛在芽或者長成新完整植物一門試驗技術(shù)，又稱為“試管植物”。植物細胞培養(yǎng)專家講座第6頁4.3.2幾個主要概念全能性細胞：是能夠表示生物體基因組任何一個基因，并能分化出該生物體內(nèi)任何一個類型細胞，進而發(fā)育為一個完全相同生物體。外植體：用來進行離體無菌培養(yǎng)離體材料。愈傷組織：外植體在離體培養(yǎng)條件下，細胞經(jīng)脫分化等一系列過程，產(chǎn)生一團不定型疏散排列薄壁細胞（含有未分化細胞特征）。胚狀體：由愈傷組織細胞誘導(dǎo)分化出含有胚芽，胚根和胚軸胚狀結(jié)構(gòu)。不定芽：愈傷組織中細胞發(fā)生分化，形成不一樣器官原基，再逐步形成芽和根。植物細胞培養(yǎng)專家講座第7頁4.3.3植物組織培養(yǎng)基本步驟培養(yǎng)材料采集培養(yǎng)材料消毒制備外植體愈傷組織形成根和芽誘導(dǎo)組培苗練苗移栽基本步驟植物細胞培養(yǎng)專家講座第8頁試管植物兩個關(guān)鍵步驟：一是愈傷組織形成，二是愈傷組織分化愈傷組織形成愈傷組織分化植物細胞培養(yǎng)專家講座第9頁1）培養(yǎng)材料采集：能夠取受精卵，發(fā)育中分生組織（根尖，莖尖），雌雄配子等。最慣用培養(yǎng)材料是莖尖，通常切塊0.5cm以下，假如是培養(yǎng)無病毒苗，其長度在0.1mm以下。植物細胞培養(yǎng)專家講座第10頁外植體（培養(yǎng)材料）選擇標(biāo)準必須含有活細胞。幼嫩組織所含活躍分裂細胞百分比高。母株必須健康而且無任何腐爛或生病跡象。母株必須活躍生長而且不會馬上進入休眠。

總標(biāo)準：健康無病年幼組織。植物細胞培養(yǎng)專家講座第11頁2）培養(yǎng)材料消毒材料自來水和蒸餾水沖洗酒精中浸泡30-60秒0.01%升汞（HgCl2)消毒10分鐘無菌水沖洗3遍植物細胞培養(yǎng)專家講座第12頁3）制備外植體在無菌條件下將材料切成0.2-0.5cm厚小片，剝?nèi)パ亏[片，嫩枝外皮或種皮胚乳。植物細胞培養(yǎng)專家講座第13頁4）接種和培養(yǎng)（愈傷組織形成，生長和分化）接種：無菌環(huán)境下，外植體接種在培養(yǎng)基上，每瓶接種4-10個。植物細胞培養(yǎng)專家講座第14頁培養(yǎng)基主要成份：水無機成份：無機大量元素氮：銨鹽、硝酸鹽混合磷：磷酸鹽鉀：鉀鹽鈣、硫、鎂無機微量元素主要有：鐵、硼、錳、鋅、銅、鉬、鈷、氯有機成份（碳源）：糖、維生素、肌醇、氨基酸及有機附加物。植物生長調(diào)整物質(zhì)：生長素類：NAA、IAA、IBA、2,4-D細胞分裂素類：BAP,KT，TDz，ZTpH值（5.8）瓊脂植物細胞培養(yǎng)專家講座第15頁封口：接種后，瓶，管用無菌藥棉或蓋封口，培養(yǎng)皿用無菌膠帶封口溫度（25度），pH（5-6）和氧氣（5%）增殖：在新梢（愈傷組織）等形成后，分株或切段轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)。植物細胞培養(yǎng)專家講座第16頁5）愈傷組織生成成熟細胞經(jīng)脫分化等一系列過程，產(chǎn)生一團不定型疏散排列薄壁細胞---愈傷組織。植物愈傷組織芽和根分化由生長素和細胞分裂素濃度及百分比決定。當(dāng)生長素濃度大于細胞分裂素濃度時，愈傷組織分化根，反之則形成芽。植物細胞培養(yǎng)專家講座第17頁6）組培苗練苗移栽試管苗進入自然環(huán)境前必須進行練苗。將培養(yǎng)容器打開，自然光照3天，取出小苗后用自來水沖洗潔凈；再移栽到準備好基質(zhì)中。植物細胞培養(yǎng)專家講座第18頁4.3.4愈傷組織形成過程在接種和培養(yǎng)過程中包括到愈傷組織形成，生長和分化。愈傷組織形成普通要經(jīng)過三個步驟：植物細胞培養(yǎng)專家講座第19頁1）開啟期：指成熟細胞或原生質(zhì)準備分裂和脫分化時期，需要適當(dāng)誘導(dǎo)劑：NAA，IAA等。2）分裂期：外植體細胞經(jīng)過誘導(dǎo)以后脫分化，外層細胞，不停分裂、增生子細胞過程。3）分化期：分化期是指在分裂期末期，細胞內(nèi)開始出現(xiàn)一系列形態(tài)和生理上改變，從而使愈傷組織內(nèi)產(chǎn)生不一樣形態(tài)和功效細胞。分化出形態(tài)和功效不一樣細胞，分生細胞、色素細胞、纖維細胞等。植物細胞培養(yǎng)專家講座第20頁愈傷組織要求：渙散性好、增殖快、再生能力強。外觀普通為鮮艷乳白或淡黃色，呈小顆粒狀，疏松易碎。植物細胞培養(yǎng)專家講座第21頁誘導(dǎo)愈傷組織形成條件：植物生長調(diào)整劑是誘導(dǎo)愈傷組織形成極為主要原因：包含生長素（NAA，IAA，2，4-D）和分裂素（KT，6-BA，ZT）：生長素使用濃度普通在0.01-10mg/L，分裂素使用濃度普通在0.1-10mg/L其它一些條件：植物生長力、起源、培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)條件等。植物細胞培養(yǎng)專家講座第22頁幼苗莖尖消毒處理接種培養(yǎng)形成愈傷組織MS+（1-6mg/L)BA+(0.1-0.5mg/L)NAA繼代培養(yǎng)生芽培養(yǎng)MS+（2-4mg/L)BA+(0.1-0.5mg/L)NAA生根培養(yǎng)MS+(0.1-0.5mg/L)IBA+（2-5mg/L)PP333基質(zhì)：河砂∶珍珠巖（1∶1）

煉苗煉苗移植蘆薈愈傷組織培養(yǎng)植物細胞培養(yǎng)專家講座第23頁4.3.5植物器官培養(yǎng)定義：指將植株上各種器官從母體上分離出來，放在無菌人工環(huán)境讓其深入發(fā)育，最終長成幼苗過程。植物器官主要包含：毛狀根，芽，體細胞胚等植物器官培養(yǎng)技術(shù)與植物組織培養(yǎng)技術(shù)基本一致。植物細胞培養(yǎng)專家講座第24頁4.3.6植物組織培養(yǎng)應(yīng)用：1.無性繁殖系快速繁殖2.取得無病毒植株3.新品種育種4.在遺傳、生理、生化和病理研究上應(yīng)用5.種質(zhì)資源保留與創(chuàng)新6.產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)：花卉，果蔬脫毒植物細胞培養(yǎng)專家講座第25頁4.3.7人工種子

在一定條件下，愈傷組織細胞誘導(dǎo)分化出含有胚芽，胚根和胚軸胚狀結(jié)構(gòu)—胚狀體定義:即最外面包裹一層有機薄膜植物胚狀體優(yōu)勢：便于運輸和儲備；提升生產(chǎn)效率；保留寶貴品種植物細胞培養(yǎng)專家講座第26頁人工種子外層：固定化膜（有機薄膜），保護胚狀體水分，預(yù)防外部力量沖擊中間：營養(yǎng)成份和植物激素內(nèi)層：包裹胚狀體或芽植物細胞培養(yǎng)專家講座第27頁4.1植物組織培養(yǎng)與細胞培養(yǎng)區(qū)分4.2發(fā)展歷史4.3植物組織與器官培養(yǎng)4.4植物細胞培養(yǎng)4.5植物原生質(zhì)培養(yǎng)植物細胞培養(yǎng)專家講座第28頁4.4植物細胞培養(yǎng)：4.4.1植物細胞培養(yǎng)定義定義：指在離體條件下，將愈傷組織或其它輕易分散組織置于培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，得到分散成游離懸浮細胞，經(jīng)過繼代培養(yǎng)使細胞增殖，從而取得大量細胞群體一門技術(shù)。目標(biāo)是取得初級和次級代謝產(chǎn)物?？山?jīng)過改變培養(yǎng)基成份及其濃度，生長調(diào)整劑選擇等伎倆來實當(dāng)代謝產(chǎn)物誘導(dǎo)。植物細胞培養(yǎng)專家講座第29頁4.4.2植物細胞培養(yǎng)方法依據(jù)培養(yǎng)對象：主要有：單細胞培養(yǎng)，單倍體培養(yǎng)（花藥雄性生殖細胞），原生質(zhì)依據(jù)培養(yǎng)系統(tǒng)：主要有：固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)。植物細胞培養(yǎng)專家講座第30頁4.4.3植物細胞培養(yǎng)培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基有：MS，B5，N6。主要有沒有機鹽，碳源，有機氮源，有機酸等組成。慣用培養(yǎng)基組成：MS+植物生長激素+椰子汁植物細胞培養(yǎng)專家講座第31頁4.4.4植物單細胞培養(yǎng)單細胞培養(yǎng)目標(biāo)主要是觀察培養(yǎng)細胞個體是怎樣進行分裂，分化，生長及發(fā)育，同時也為大規(guī)模培養(yǎng)奠定基礎(chǔ)。單細胞培養(yǎng)過程中往往也包括愈傷組織形成.植物細胞培養(yǎng)專家講座第32頁4.4.4.1單細胞制備方法：機械法：機械磨碎；效率低酶解法：消化植物細胞壁專一性水解酶如：纖維素酶，效率高起源于愈傷組織植物細胞培養(yǎng)專家講座第33頁4.4.4.2單細胞培養(yǎng)平板培養(yǎng)看護培養(yǎng)微室培養(yǎng)雙層濾紙培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)適宜于得到細胞數(shù)目少，細胞比較寶貴情況下使用植物細胞培養(yǎng)專家講座第34頁1)細胞平板培養(yǎng)平板培養(yǎng)（platingculture)是指將一定密度懸浮細胞接種到或混合到一薄層固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)技術(shù),類似于微生物細胞平板培養(yǎng)。細胞分離及密度調(diào)整：普通采取酶分離法，小細胞團不能超出6個細胞，要選擇適當(dāng)過濾網(wǎng)篩。細胞密度普通控制在1000-1×105/ml植物細胞培養(yǎng)專家講座第35頁板制備和細胞培養(yǎng)：35℃固體培養(yǎng)基（1.4%瓊脂）均勻平鋪于培養(yǎng)皿中，厚度5mm左右。接種和培養(yǎng)：

26℃置暗處培養(yǎng)21天。低倍顯微鏡觀察，記數(shù)單細胞或小細胞團，計算置板效率（也稱植板率）。植板率:已形成細胞團百分數(shù)（即每100個鋪在平板上細胞中有多少個能長出細胞團）植物細胞培養(yǎng)專家講座第36頁固體平板培養(yǎng)圖示：優(yōu)點:能夠定點觀察分離細胞輕易缺點:培養(yǎng)細胞氣體交換不暢，濕度不夠。植物細胞培養(yǎng)專家講座第37頁2）看護培養(yǎng)和喂養(yǎng)層培養(yǎng)I看護培養(yǎng)（nurseculture）Muir等1953年設(shè)計。是指用一塊活躍生長愈傷組織來看護單個細胞，使其連續(xù)分裂和增殖。植物細胞培養(yǎng)專家講座第38頁定義:指用一塊活躍生長愈傷組織來看護單個細胞，并使其生長和增殖方法。基本技術(shù):（1）在一個培養(yǎng)瓶中加入一定量厚固體培養(yǎng)基，滅菌后備用。（2）在無菌條件下，將一小塊活躍生長愈傷組織接種到培養(yǎng)基上，再在愈傷組織塊上放一片已滅菌濾紙，放置一晚上。（3）將分離單細胞接種到培養(yǎng)基濾紙上。（4）恒溫培養(yǎng)1-3月。植物細胞培養(yǎng)專家講座第39頁優(yōu)點：

（1）簡便易行。

（2）效果好，易于成功。

缺點：

（1）不能在顯微鏡下直接觀察細胞生長過程?？醋o培養(yǎng)特點：植物細胞培養(yǎng)專家講座第40頁II喂養(yǎng)層培養(yǎng)：喂養(yǎng)層培養(yǎng)是用處理過（X射線處理）無活性或分裂很慢，不具備分裂能力細胞來喂養(yǎng)所養(yǎng)靶細胞(要培養(yǎng)細胞）。紅色細胞為喂養(yǎng)層細胞；藍色為靶細胞植物細胞培養(yǎng)專家講座第41頁3）雙層濾紙培養(yǎng)

在喂養(yǎng)層和靶細胞層之間放兩張濾紙,上面一層濾紙用于將靶細胞轉(zhuǎn)移到其它培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng).植物細胞培養(yǎng)專家講座第42頁4）微室培養(yǎng)定義:將單細胞培養(yǎng)在少許培養(yǎng)基中培養(yǎng)。植物細胞培養(yǎng)專家講座第43頁優(yōu)點：

（1）在培養(yǎng)過程中，能夠連續(xù)進行顯微觀察一個細胞生長、分裂和形成細胞團全部過程.

缺點：

（1）培養(yǎng)時間較短.

（2）操作麻煩。植物細胞培養(yǎng)專家講座第44頁5)懸浮培養(yǎng)將一定密度懸浮細胞接種于液體培養(yǎng)基中,在保持良好分散狀態(tài)下培養(yǎng).適宜于消化得到細胞數(shù)充分情況下使用。懸浮培養(yǎng)植物細胞培養(yǎng)專家講座第45頁4.4.4.3細胞同時化細胞同時化：指同一培養(yǎng)體系全部細胞都同時經(jīng)過細胞周期某一特定時期。有饑餓法，抑制法和冷處理法等。植物細胞培養(yǎng)專家講座第46頁能夠經(jīng)過饑餓法取得G1或G2期同時化細胞。植物細胞培養(yǎng)專家講座第47頁植物細胞培養(yǎng)專家講座第48頁植物細胞培養(yǎng)專家講座第49頁有絲分裂抑制法:在指數(shù)生長久細胞懸浮培養(yǎng)物加入一定濃度有絲分裂抑制劑如秋水仙素4-6小時，作用不可逆。植物細胞培養(yǎng)專家講座第50頁4.4.4.4植物細胞保留繼代培養(yǎng)保留法低溫保留法：5-10度冰凍保留法：-20度或液氮中植物細胞培養(yǎng)專家講座第51頁4.5原生質(zhì)體培養(yǎng)原生質(zhì)體相關(guān)概念和研究意義原生質(zhì)體分離原生質(zhì)體培養(yǎng)植物細胞培養(yǎng)專家講座第52頁4.5.1關(guān)于原生質(zhì)體幾個主要概念原生質(zhì)體(protoplast):指除去細胞壁細胞或是說一個被質(zhì)膜所包圍裸露細胞。亞原生質(zhì)體（subprotoplast）：在原生質(zhì)體分離過程中，有時會引發(fā)細胞內(nèi)含物斷裂而形成一些較小原生質(zhì)體就叫做亞原生質(zhì)體。它能夠含有細胞核或沒有細胞核。植物細胞培養(yǎng)專家講座第53頁4.5.2原生質(zhì)體研究意義研究組織和器官發(fā)育機制；能夠進行相關(guān)遺傳操作；研究植物細胞生理功效；誘導(dǎo)融合形成雜種細胞。植物細胞培養(yǎng)專家講座第54頁4.5.3原生質(zhì)體制備原材料準備預(yù)處理與酶解原生質(zhì)體搜集與純化原生質(zhì)體活力檢測植物細胞培養(yǎng)專家講座第55頁4.5.3.1用于分離原生質(zhì)體材料起源兩個起源：各種組織葉片，根尖等愈傷組織植物細胞培養(yǎng)專家講座第56頁4.5.3.2酶消化取材消毒取植物組織，消毒后去掉表皮，剪碎；酶消化然后在25-28度水浴酶解60-90分鐘。使用酶：果膠酶，纖維素酶等植物細胞培養(yǎng)專家講座第57頁4.5.3.3搜集和純化原生質(zhì)體

酶解結(jié)束后,要將原生質(zhì)與碎片和酶液分離，然后經(jīng)洗滌后再進行培養(yǎng).過濾-離心法：先過濾后低速離心沉淀漂浮法：利用原生質(zhì)體比重小，能在25%蔗糖溶液中漂浮沉降法和漂浮法結(jié)合.先離心搜集沉淀，在用21%蔗糖漂浮離心植物細胞培養(yǎng)專家講座第58頁4.5.3.4原生質(zhì)體判定及活力檢測判定：低滲脹破法和熒光染色法植物細胞培養(yǎng)專家講座第59頁熒光染色法：在活細胞內(nèi)，F(xiàn)DA（二乙酸熒光素）被酯酶裂解即發(fā)熒光（熒光素）

活力測定植物細胞培養(yǎng)專家講座第60頁影響原生質(zhì)體活力原因

分離材料生理狀態(tài)酶解條件：酶質(zhì)量、濃度、酶解溫度、酶解時間、酶溶液滲透壓分離條件：高心次數(shù)、離心速度、純化方法、分離連續(xù)時間環(huán)境條件：操作環(huán)境溫度、分離用具影響植物細胞培養(yǎng)專家講座第61頁液體淺層培養(yǎng)；固液雙層培養(yǎng)，固體平板培養(yǎng)，瓊脂糖珠培養(yǎng)，看護培養(yǎng)，喂養(yǎng)層培養(yǎng)。4.5.4原生質(zhì)體培養(yǎng)植物細胞培養(yǎng)專家講座第62頁4.5.5愈傷組織形成與植株再生細胞分裂與細胞壁再生在短時間內(nèi)細胞壁和葉綠體開始生成；細胞開始分裂。愈傷組織形成愈傷組織分化依據(jù)需要可進行植株再生或細胞大規(guī)模培養(yǎng)植物細胞培養(yǎng)專家講座第63頁4.5植物細胞和組織大規(guī)模培養(yǎng)植物中含有數(shù)量極為可觀次代謝物質(zhì)。這些次級代謝產(chǎn)物對人類有巨大利用價值，如紫草細胞中紫草寧可用于治療創(chuàng)傷，燒傷；人參是治療與保健名貴藥材。依靠傳統(tǒng)從植物中分離提取已極難滿足需求，工業(yè)化生產(chǎn)植物產(chǎn)品是一條有效路徑。植物細胞培養(yǎng)專家講座第64頁植物細胞培養(yǎng)和從完整植物生產(chǎn)紫草寧比較生產(chǎn)方式收獲時間紫草寧濃度（%干重）完整植物2-3y1-2植物細胞培養(yǎng)21d14植物細胞培養(yǎng)專家講座第65頁4.5.1植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)特點植物細胞特點（與微生物比較）：體積大以細胞團形式存在對剪切力敏感生長慢，周期長對營養(yǎng)要求高培養(yǎng)過程中輕易產(chǎn)生泡沫植物細胞培養(yǎng)專家講座第66頁4