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文檔簡介
大腸桿菌mazg基因參與mavef介導(dǎo)的程序性死亡
-氨基乙烯酸酯(tas)是一種廣泛存在于細(xì)菌中的遺傳因素。首先,在f質(zhì)粒中發(fā)現(xiàn)桿菌(桿菌),然后確認(rèn)細(xì)菌和老細(xì)菌都有這種外來存在。根據(jù)抗毒素的性質(zhì)和作用模式可將TAs分為6型,其中Ⅱ型TAs是種類最多、研究最為廣泛和深入的一類。研究發(fā)現(xiàn)Ⅱ型TAs參與細(xì)菌諸多生理過程的調(diào)控,如維持質(zhì)粒的穩(wěn)定在過去幾十年中,研究的焦點(diǎn)主要在于毒素抗毒素類型的解析、功能的挖掘及相關(guān)調(diào)控機(jī)制的研究,對于這樣一個二元基因元件下游是否還有其他基因參與調(diào)控研究較少。本研究團(tuán)隊(duì)通過生物信息學(xué)比對發(fā)現(xiàn),很多TAs的下游多存在一個下游基因,如mazEF下游的mazG,relBE下游的relF,以及已知的三元體系parABC。這些第三基因元件不僅是多種TAs的共同特點(diǎn),而且在不同菌株中也有很高的保守性,這提示第三基因很可能參與TAs的生理調(diào)控過程。mazEF是發(fā)現(xiàn)較早、研究最為深入的Ⅱ型TA之一,我們前期也對不同條件下mazEF對細(xì)菌的調(diào)控作用進(jìn)行了深入研究。學(xué)術(shù)界對于mazEF的模型一直存在一個爭論未解決,即mazEF的存在是否在脅迫條件下誘發(fā)細(xì)菌PCD?不同研究團(tuán)隊(duì)給出了截然相反的結(jié)論本文擬從典型TAsmazEF的下游基因mazG的功能入手,通過過表達(dá)和敲除mazG基因,研究其在不同條件下對大腸桿菌的生長及存活率的影響,構(gòu)建mazEF、mazG、mazEFG系列基因敲除菌株,研究不同基因背景下mazG功能的差異,充分闡釋mazE-FG作為一個操縱子下的基因的相互協(xié)同的調(diào)控作用機(jī)制,揭示毒素-抗毒素系統(tǒng)下游的第三基因可能是細(xì)菌生長調(diào)節(jié)的重要一環(huán),為相關(guān)研究提供新的視角。1材料和方法1.1主要試劑與儀器大腸桿菌MC4100(編號:CGMCC1.1560,基因型F30%丙烯酰胺,德國Merck公司;葡萄糖、氯化銨、氯化鈉、蔗糖、硫酸鎂、六水合氯化鎂、磷酸二氫鉀、十二水合磷酸氫二鈉,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;無水氯化鈣,西隴化工股份有限公司;蛋白胨、酵母提取物,美國Oxoid公司;瓊脂粉、硫酸卡那霉素、氨芐青霉素、氯霉素、利福平,北京索萊寶科技有限公司;異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropylβ-D-thiogalactoside,IPTG),美國Sigma-Aldrich公司;瓊脂糖,北京擎科新業(yè)生物有限公司。PhantaMaxSuper-Fidelity高保真DNA聚合酶(P505-d1)、2×PhantaMasterMixDNA聚合酶(P515-01)、BCA蛋白檢測試劑盒(E112-01),南京諾唯贊生物技術(shù)有限公司;限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶,美國ThermoFisher公司;去基因組酶RQ1RNase-FreeDNase,美國Promega公司;RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRTMasterMix,日本TaKaRa公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記的6×His抗體,美國Proteintech公司;質(zhì)粒小提試劑盒、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、DNA純化回收試劑盒,天根生化科技有限公司。LightCycler96熒光定量PCR儀,瑞士Roche公司;NanoDrop,美國ThermoFisher公司;5810R臺式冷凍離心機(jī),德國Eppendorf公司;電轉(zhuǎn)儀(ECM830),美國BTX公司;電泳儀(mini-sub),美國Bio-Rad公司;ViritiPCR儀,美國ThermoFisher公司;多功能搖床(SF-C),北京合眾日盛科技有限公司。1.2lb固體培養(yǎng)基平板平板制備取真空干燥保存MC4100菌種干粉的安瓿瓶(4~10℃保存),在安瓿瓶的尖嘴部分滴幾滴無菌水,酒精燈加熱使其破裂,用鑷夾碎至出現(xiàn)一大小適宜的缺口,加500μl無菌水,輕輕晃動混勻后,移取100μl至LB固體培養(yǎng)基平板(無抗性),涂布均勻后,倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。過夜培養(yǎng)的MC4100野生菌株產(chǎn)生單克隆后,挑取2~3個單克隆于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至一定生長期后,取適量菌液加入甘油至終濃度為20%,于-80℃保存。1.3mazg基因缺失菌株的構(gòu)建本文基因克隆、敲除及質(zhì)粒構(gòu)建所用引物序列見表1。利用1、2號引物PCR擴(kuò)增mazG基因,在NdeⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)插入pET28a載體,得pET28a-mazG,通過轉(zhuǎn)化BL21菌株可誘導(dǎo)表達(dá)并純化收集MazG蛋白。本文采用同源重組的方法敲除大腸桿菌目的基因。在pKOV載體上插入待敲除基因上下游各500bp的同源臂組合序列,通過轉(zhuǎn)化菌株、反篩、基因組測序得到敲除菌株。MC4100菌株的relA基因內(nèi)部存在1336個堿基的外源序列插入,本文通過擴(kuò)增插入序列的上下游序列作為同源臂,利用上述同源重組的方法無痕敲除插入序列,實(shí)現(xiàn)relA的回復(fù)突變,得4200菌株,所用引物序列為5~8。在4200菌株的基礎(chǔ)上,構(gòu)建目的基因上下游同源臂,得mazEF/mazG/mazEFG敲除質(zhì)粒,篩選得相應(yīng)的敲除菌株。所用引物序列為9~16;在pBAD33載體上插入mazG序列得pBAD33-mazG載體,通過轉(zhuǎn)化菌株4200和4200△EFG可得4200G和4200G△EFG菌株,添加阿拉伯糖可誘導(dǎo)mazG基因過表達(dá),所用引物序列為3~4。引物及測序服務(wù)由生工生物工程(上海)股份有限公司提供,4℃保存。使用載體按膠回收試劑盒說明書進(jìn)行酶切回收,將設(shè)計(jì)的引物依據(jù)合適的退火溫度進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測后,切取目的條帶回收,將得到的目的片段和載體片段在T4連接酶作用下進(jìn)行連接,并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,涂布Kana平板,挑取單克隆搖菌,按質(zhì)粒提取試劑盒說明書提取質(zhì)粒,并測定濃度,經(jīng)測序驗(yàn)證正確后,于-20℃保存?zhèn)溆谩?.4mc4200mazefg缺陷菌株在適應(yīng)環(huán)境中的cfu測定過夜培養(yǎng)的菌液按1∶100接種至M9培養(yǎng)基中,37℃、220r/min培養(yǎng)菌液至生長對數(shù)期,即測得A1.5mazg-ma突變體蛋白的構(gòu)建pET28a-mazG和pET28a-mazGE38A質(zhì)粒經(jīng)酶切和測序驗(yàn)證后轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21感受態(tài)中,在卡那霉素抗性LB平板上篩選陽性克隆得到目標(biāo)菌株-BL21G。IPTG濃度為1mmol/L時,在25℃,220r/min條件下誘導(dǎo)表達(dá)4h時,細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量可溶性目標(biāo)蛋白,離心收集細(xì)胞,超聲破碎后得到的上清液經(jīng)鎳柱親和層析,超濾濃縮后,得純度和濃度較高的MazG蛋白和MazGE38A突變體蛋白;用BCA法測定濃縮后的MazG蛋白溶液濃度,根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的條件進(jìn)行MazG的體外酶學(xué)反應(yīng)1.6實(shí)驗(yàn)1:聚苯胺-mazg取4200::pBAD33-mazG和4200△EFG::pBAD33-mazG,過夜培養(yǎng)12h后用M9液體培養(yǎng)基稀釋100倍(稀釋后總體積為20ml),于37℃、220r/min搖床培養(yǎng)至A1.7伊g菌株取4200、4200△G、4200△EF和4200△EFG菌株,過夜培養(yǎng)12h后用LB液體培養(yǎng)基稀釋100倍(稀釋后總體積為20ml),于37℃、220r/min搖床培養(yǎng)至A1.8單因素方差分析使用GraphPadPrism5進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,單因素方差分析結(jié)合Dunnett檢驗(yàn)用于3組間比較,P<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。應(yīng)用生長對數(shù)期細(xì)胞每分裂一次所需要的時間即代時,分析細(xì)菌生長曲線的趨勢差異,計(jì)算公式:式中t2結(jié)果2.1mc4200菌株的構(gòu)建為探究基因mazEFG操縱子對細(xì)菌正常生長造成的影響,本文對大腸桿菌MC4100菌株進(jìn)行了relA基因的回復(fù)突變,構(gòu)建了MC4200菌株,使其獲得正常的嚴(yán)緊反應(yīng)能力。在此基礎(chǔ)上,構(gòu)建了MC4200的mazEF、mazG、mazEFG基因敲除菌株,分別標(biāo)識為4200、4200△EF、4200△G和4200△EFG。文獻(xiàn)表明2.2mdv基因和mazg38a突變基因載體的誘導(dǎo)表達(dá)MazG蛋白廣泛存在于原核生物和古菌中,其共同特點(diǎn)是含有NTP焦磷酸水解酶結(jié)構(gòu)域,具有水解dNTP的能力,該結(jié)構(gòu)域具有較高的保守性(圖2)。大腸桿菌MazG蛋白的結(jié)構(gòu)已得到解析為確認(rèn)MazG蛋白的細(xì)胞毒性是否與其酶活性相關(guān),我們將MazG活性結(jié)構(gòu)域內(nèi)的38位的Glu(E)突變?yōu)锳la(A),構(gòu)建mazGE38A突變體。分別將野生型mazG基因和mazGE38A突變體基因克隆至pET28a表達(dá)載體,通過基因測序驗(yàn)證了2個載體序列的正確性。首先將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)中,在含有卡那霉素的LB平板上篩選得到陽性轉(zhuǎn)化菌株。通過表達(dá)預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索MazG的最適表達(dá)條件。結(jié)果表明當(dāng)IPTG濃度為1mmol/L時,在25℃,220r/min條件下誘導(dǎo)表達(dá)4h時,細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量可溶性目標(biāo)蛋白。據(jù)此條件進(jìn)行大容量搖瓶誘導(dǎo)表達(dá),離心收集細(xì)胞并超聲破碎后得到菌體裂解懸液,離心后的上清液經(jīng)過鎳柱純化,用800mmol/L咪唑洗脫得大量單一的MazG蛋白(圖3),超濾濃縮用于酶活測定。采用薄層色譜法(TLC)進(jìn)行MazG的焦磷酸水解酶活性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明(圖4),野生型MazG蛋白能催化dNTP生成dNMP,這與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果吻合隨后,分別將pBAD33的空載體和攜帶了mazG及mazGE38A突變基因的載體轉(zhuǎn)入MC4200△EFG菌株中,通過阿拉伯糖誘導(dǎo)目標(biāo)基因的表達(dá),測試目的基因表達(dá)對菌株生長曲線的影響。圖5結(jié)果表明,與野生型不同,MazGE38A對細(xì)菌生長無明顯抑制作用。以上結(jié)果表明,MazG的細(xì)胞毒性依賴于其dNTP焦磷酸水解酶活性。2.3種菌株增殖時間MC4200菌株及其系列基因敲除株在正常生長條件下的生長情況表明(圖6)。4種菌株生長曲線基本一致(圖6A),各菌株的增殖時間無顯著差異(圖6B)。表明mazEFG操縱子各基因的敲除,在正常生長條件下不會對細(xì)菌生長產(chǎn)生不利影響。2.4mc4200及其mazg基因回補(bǔ)菌株MazEFTAs是細(xì)菌脅迫應(yīng)激的最重要的調(diào)控元件之一,所以我們進(jìn)一步探索在脅迫環(huán)境下mazG基因敲除對mazEF生理功能及細(xì)菌生長狀態(tài)的影響。分別向培養(yǎng)基中添加利福平(Rif)、H為排除極化效應(yīng)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響,在MC4200、MC4200△mazG及MC4200△EFG菌株中轉(zhuǎn)入pBAD-mazG質(zhì)粒,對應(yīng)菌株標(biāo)記為MC4200G、MC4200G△mazG及MC4200G△mazEFG。通過加入Ara誘導(dǎo)mazG基因的表達(dá)以回補(bǔ)MazG,比較回補(bǔ)菌株與野生型菌株在10μg/ml利福平刺激下的存活率。Western印跡法結(jié)果表明(圖8),阿拉伯糖的加入成功誘導(dǎo)了MazG的表達(dá)(攜帶6*His標(biāo)簽,圖8B)。mazG基因回補(bǔ)后,MC4200菌株和MC4200△G菌株與野生型菌株無顯著差異,這說明mazG的敲除并未影響其上游mazEF的表達(dá),未產(chǎn)生“極化效應(yīng)”。而MC4200△EFG在MazG回補(bǔ)后,細(xì)菌存活率會顯著低于野生型菌株(P<0.01),這是由于mazG的活性所致,該結(jié)果與本文圖1結(jié)果及文獻(xiàn)3mc4200及其mazf基因敲除菌株的構(gòu)建MazG蛋白是一個NTP焦磷酸水解酶(NTP-PPase),最初是因?yàn)榕c大腸桿菌內(nèi)的GTPaseEra具有相互作用而被發(fā)現(xiàn)并鑒定為新的NTP-PPaseMC4100菌株是毒素-抗毒素機(jī)制研究中廣泛采用的菌株,但其relA基因存在插入突變,是relA失活型。而RelA是誘導(dǎo)細(xì)菌嚴(yán)緊應(yīng)答的重要蛋白,可使細(xì)菌在氨基酸饑餓、氧化應(yīng)激等不利生長條件下,限制蛋白質(zhì)與核糖體RNA的合成,控制基本代謝從而維持細(xì)菌存活。RelA缺失菌株更易在脅迫環(huán)境下死亡。RelA對細(xì)菌全局性的調(diào)控是通過其產(chǎn)物鳥苷四磷酸(p)ppGpp介導(dǎo)實(shí)現(xiàn)的。因此,我們首先對MC4100菌株進(jìn)行了relA的回復(fù)突變,通過同源重組的方法無痕敲除了基因組中relA基因內(nèi)部的外源插入堿基,獲得了relA野生型的新的菌株,命名為MC4200。在此基礎(chǔ)上,分別構(gòu)建了mazG、mazEF、mazEFG基因敲除菌株,分別標(biāo)識為4200、4200△EF、4200△G和4200△EFG。在正常生長條件下,該系列基因的敲除都不影響大腸桿菌的生長狀態(tài)(圖6),說明與mazEF一樣,mazG在正常生長條件下也不是必需基因,它們可能只參與應(yīng)對脅迫條件的嚴(yán)緊反應(yīng)。文獻(xiàn)研究表明,mazEF在脅迫條件下,會誘發(fā)細(xì)菌的程序性死亡,這是細(xì)菌的一種重要自殺性調(diào)控機(jī)制為探究mazG的作用機(jī)制,我們在MC4200野生型和mazEFG敲除株過表達(dá)mazG基因,基因敲除株的表型與文獻(xiàn)報(bào)道一致MazG蛋白具有典型的保守結(jié)構(gòu)域,我們選擇其重要的保守酶活位點(diǎn)E38進(jìn)行了定點(diǎn)突變,構(gòu)建了突變體MazGE38A。經(jīng)測試,該突變體喪失了NTP-PPase活性(圖4)。過表達(dá)該突變體并不影響細(xì)菌的生長狀態(tài),MazG過表達(dá)對細(xì)菌的生長抑制與其NTP-PPase密切相關(guān)。有研究報(bào)道稱M
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